药用植物内生菌对乌苏酸的微生物转化筛选

 目的 从药用植物蛇足石杉分离纯化内生菌,并筛选可以转化乌苏酸的菌株,以期探究利用药用植物内生菌对乌苏酸进行结构修饰和改造的可行性。方法 通过组织块法分离内生菌;用薄层色谱检测转化反应的发生;用CTAB法提取转化菌株的基因组DNA,PCR技术对其ITS rDNA进行扩增,再经Blast比对鉴定菌株。结果 从药用植物蛇足石杉的茎和叶中分离得到内生菌52株,用30株对乌苏酸进行转化筛选。有4株内生菌具有转化乌苏酸的能力,经表观形态及分子生物学的方法鉴定转化菌株,分别是Pestalotiopsis microspora,Colletotrichum gloeosporioides,Fusarium chlamydosporum,Arthrinium. sp。结论 从转化产物的结构可以得出结论,利用药用植物内生菌对天然活性成分乌苏酸进行微生物转化,可以丰富乌苏酸的结构类型,为获得活性更好的衍生物提供技术和方法基础。     

农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系的优化

目的 该研究在已有高卢蜜环菌遗传转化体系的基础上，对遗传转化体系进行优化以提高转化效率，为后续蜜环菌分子标记辅助育种、基因功能的研究奠定基础。方法 首先构建遗传转化的质粒pH101-PAgGPD-GFP-TrpC，将其转化到大肠埃希菌中扩大培养并提取质粒。提取的质粒分别转化LBA4404，EHA105，GV3101，AGL-1共4种不同的农杆菌。用转化后的农杆菌浸染高卢蜜环菌，筛选出转化率最高的农杆菌。再分别从抗生素种类及浓度、共培养时间、菌液浓度和浸染方法5个方面对农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系进行优化。采用Synbiosis ProtoCol 3测量影像分析仪观察蜜环菌在不同条件下的表型谱。结果 优化后高卢蜜环菌遗传转化条件为农杆菌菌株采用EHA105，菌液浓度为吸光度A_{600 nm}=0.6；共培养时间为2 d，浸染方式为负压浸染10 min，初筛培养基为含400 mg·L^-1头孢噻肟钠，10 mg·L^-1潮霉素的PDA培养基，复筛培养基为含12 mg·L^-1潮霉素的PDA培养基。结论 该研究在已经建立的高卢蜜环菌的遗传转化体系的基础上成功对该体系进行了优化，且优化前后的转化率差异存在明显统计学意义（P<0.05），即优化后高卢蜜环菌的转化效率约为4.33%，相比于优化前提高了约8倍。     

假单胞菌菌株ZL8发酵培养基及发酵条件的优化

目的 课题组前期从猪苓菌核中分离得到对丹参枯萎病等植物病原真菌具有广谱抑制作用且对植物生长有促进作用的假单胞菌菌株ZL8，该研究在此基础上对假单胞菌菌株ZL8的发酵培养基和发酵条件进行优化，以提高单位体积发酵液中菌体数量，为此菌株的开发和应用提供基础。方法 测定ZL8菌株在LB培养基中的生长曲线，明确其在液体培养基中的生长规律；以ZL8菌株发酵液中活菌数、菌体干重和菌悬液A₆₀₀值为检测指标，对不同种类的氮源、碳源及无机盐进行单因素考察以确定最适培养基组分，并进行正交试验优化培养基配比，以筛选最优发酵培养基；对ZL8菌株的接种量、培养温度、时间和转速等4个方面进行单因素和正交试验考察以确定最优培养条件。结果 假单胞菌菌株ZL8的液体发酵最佳培养基为蛋白胨15 g·L^-1、葡萄糖7.5 g·L^-1、氯化钾10 g·L^-1，发酵48 h后，发酵液活菌数可达8.93×10⁹ cfu·mL^-1，为LB液体培养基的3.93倍（P<0.01）；最佳发酵条件为接种量3%、温度28 ℃、时间72 h、转速220 r·min^-1，发酵液中活菌数可达6.37×10¹⁰ cfu·mL^-1。结论 优化后的培养基配方和发酵条件相对LB培养基和初始发酵条件，不仅可有效提高单位体积中假单胞菌ZL8菌株的菌体量及延长菌株生长的稳定期，而且可降低培养基成本，为假单胞菌ZL8的高效发酵和应用提供理论基础。     

高山绚孔菌化学成分研究

目的： 研究高山绚孔菌子实体化学成分。 方法： 采用柱色谱手段,结合波谱方法（MS,NMR）分离鉴定高山绚孔菌子实体的化学成分。 结果： 从高山绚孔菌的氯仿提取物和醋酸乙酯提取物中分离得到11个单体化合物,分别为麦角甾醇过氧化物（1）,麦角甾-7,22-二烯-3β-醇（2）,啤酒甾醇（3）,麦角甾醇（4）,麦角甾-7,22-二烯-3-酮（5）,阿里红酸A（6）,硫色多孔菌酸（7）（4E,8E）-N-D-2’-羟基棕榈酰-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4,8-sphingadienine（8）,N-（2’-羟基二十四碳酰基）-1,3,4-三羟基-2-氨基-十八烷（9）,烟酸（10）和齿孔酸（11）。 结论： 化合物 3,5,6,8~10 首次从该真菌中分离得到。     

川芎嗪联合大黄素抑制腹水癌细胞HIF-1α通路相关因子表达的作用研究

目的 从抑制癌细胞缺氧诱导因子（HIF）信号通路中核转录因子-κB（NF-κB），HIF-1α及血管内皮生长因子-C（VEGF-C）的角度探讨川芎嗪和大黄素合用抑制腹水癌细胞新生血管的作用。方法 50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、川芎嗪组、大黄素组、川芎嗪+大黄素组，各实验组采用原位注射法对正常大鼠肝脏注射大鼠腹水癌细胞（Walker-256细胞），假手术组注射同等体积生理盐水，并分组灌胃给药川芎嗪（10 mg·kg^-1），大黄素（10 mg·kg^-1），川芎嗪+大黄素（川芎嗪10 mg·kg^-1+大黄素10 mg·kg^-1），给药7 d后取实验组肝脏肿瘤接种组织样本制作病理切片，观察肿瘤细胞存留状态和VEGF的表达情况。分别构建Walker-256细胞体外氧糖剥夺模型（缺氧缺糖模型）、单缺氧模型和单缺糖模型。川芎嗪组、大黄素组及川芎嗪+大黄素组均选择不影响Walker-256增殖的3个连续浓度作为考察浓度，造模前给药，模型处理时间4 h，检测各组细胞培养上清液中HIF-1α，VEGF-C，NF-κB的水平。结果 大鼠肝脏在接种Walker-256细胞后，肝脏总质量明显升高（P<0.05），川芎嗪组，大黄素组和川芎嗪+大黄素组肝脏总质量较模型组明显降低（P<0.05），组织病理学检测显示，各给药组肝脏组织中的VEGF表达响应均低于模型组；在细胞水平，川芎嗪组和川芎嗪+大黄素组缺氧缺糖模型的HIF-1α，VEGF-C，NF-κB水平均明显降低（P<0.05），呈一定的剂量依赖性，对单缺氧模型作用有一定降低作用；大黄素1×10^-2，1×10^-3 mol·L^-1组和川芎嗪+大黄素1×10^-2，1×10^-3 mol·L^-1组明显降低缺氧缺糖和单缺糖模型中HIF-1α，NF-κB的水平（P<0.05），而所有给药组对单缺糖模型中VEGF-C作用不显著，差异无统计学意义。结论 川芎嗪和大黄素单用和川芎嗪+大黄素联合使用均可抑制大鼠肝脏在接种Walker-256细胞后重量的异常升高，并抑制肝脏组织的VEGF表达；川芎嗪和大黄素可以抑制NF-κB，HIF-1α的蛋白表达，从而减少了HIF-1α转录激活的转移相关靶基因蛋白VEGF的表达、限制肿瘤细胞新生血管的生成以达到抑制腹水癌细胞侵袭和扩散。其中川芎嗪对缺氧的作用最显著，葡萄糖对川芎嗪的作用有干预，与大黄素合用时葡萄糖的干预作用降低，合用对肿瘤细胞的作用更稳定。     

多指标综合评分法优选制何首乌的β-环糊精辅助提取工艺

目的： 优选制何首乌的β-环糊精（β-CD）辅助提取工艺。 方法： 采用层次分析法,以二苯乙烯苷、大黄素及大黄素甲醚转移率的综合评分为指标,通过正交试验考察β-CD用量、料液比、提取次数及时间对制首乌有效成分提取工艺的影响。采用HPLC测定二苯乙烯苷、大黄素及大黄素甲醚含量,流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）梯度洗脱（0~5 min,15%~25%A;5~12 min,25%~30%A;12~15 min,30%~60%A;15~20 min,60%A;20~25 min,60%~75%A;25~31 min,75%~77%A）,检测波长320（二苯乙烯苷）,254 nm（大黄素、大黄素甲醚）。 结果： 最佳工艺条件为β-CD加入量10%,加10倍量水提取3次,每次1 h;二苯乙烯苷、大黄素及大黄素甲醚转移率分别为90.19%,8.39%,0.76%。 结论： 与传统水提法相比,β-CD辅助提取法能显著提高活性成分转移率。     

虎杖的抗补体活性蒽醌类成分及其作用靶点

目的 研究虎杖Polygonum cuspidatum中的抗补体活性蒽醌类成分及其作用靶点。方法 采用溶血试验法进行抗补体活性成分的导向分离,对所得化合物进行抗补体活性测定,并利用补体缺失血清鉴定主要活性化合物的作用靶点。结果 从虎杖醋酸乙酯活性部位分离得到10个蒽醌类和3个其他类成分,分别鉴定为大黄素甲醚（1）、大黄酚（2）、大黄素-8-甲醚（3）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（4）、大黄素（5）、大黄酸（6）、迷人醇（7）、6-羟基芦荟大黄素（8）、xanthorin（9）、isorhodoptilometrin（10）、2, 5-二甲基-7-羟基-色原酮（11）、7-羟基-4-甲氧基-5-甲基-香豆素（12）和5, 7-二羟基-异苯并呋喃酮（13）。化合物9、10为首次从蓼科中分离得到,化合物9是首次从虎杖中发现的茜草素型蒽醌;化合物3～9对补体系统的经典和旁路途径有不同程度的抑制活性,以化合物7的活性最显著 [CH₅₀＝（6±2）μg/mL;AP₅₀＝（50±5）μg/mL]。靶点研究表明,化合物4作用于补体系统的C1q、C2及C9组分;化合物7作用于C1q、C2、C4及C9组分。结论 蒽醌类化合物是虎杖的主要抗补体活性成分,迷人醇活性强、靶点明确,值得深入研究。     

UPLC-ESI-HRMS同时测定藏药小大黄及其炮制品中11种成分

目的 建立UPLC-ESI-HRMS方法同时测定藏药小大黄Rheum pumilum及酒炙、炒炭、蒸炙3种炮制小大黄中11种成分。方法 色谱采用Kinetex^TM C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm,2.6 μm）,流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱,体积流量0.3 mL/min,进样量1 μL,柱温32℃。质谱采用ESI离子源,负离子模式进行检测。结果 所测11种成分没食子酸、表儿茶素、虎杖苷、土大黄苷、木犀草素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚在测定质量浓度范围内具有良好的线性关系,r值均≥0.999 1,方法精密度、重复性和稳定性良好,加样回收率在91.31%～107.08%,RSD在1.73%～3.58%。小大黄炮制后没食子酸、虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素含量发生显著变化。在酒炙、炒炭中没食子酸、大黄素含量均显著升高,炒炭中大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量显著降低,虎杖苷含量在所有炮制品中均显著降低。结论 该方法简单、快速、准确度及灵敏度高,可用于小大黄及其3种炮制品11种成分的测定,为进一步研究小大黄炮制前后化学成分变化奠定基础。     

总状毛霉对20(S)-原人参二醇的微生物转化及条件优化

目的: 利用微生物转化的方法构建20(S)-原人参二醇过氧衍生物的新合成途径,并对转化条件进行优化,提高过氧衍生物的产率。方法: 选取总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205为转化菌株,从接菌量,底物浓度,转化时间,加样时间,温度,转速等方面对转化条件进行优化。结果: 获得2个20(S)-原人参二醇过氧衍生物,20(S)-原人参二醇为25,26-烯-24(R)过氧羟基-20(S)-原人参二醇和23,24-烯-25过氧羟基-20(S)-原人参二醇;获得了优化的转化工艺,即接种量为10%,底物浓度为0.25 mmol·L^-1,加样时间为转种后48 h,培养温度为28 ℃,转化时间为5 d,摇床转速为150 r·min^-1。结论: 该方法能简便的获得20(S)-原人参二醇过氧衍生物,采用优化后的转化条件25,26-烯-24(R)过氧羟基-20(S)-原人参二醇和23,24-烯-25过氧羟基-20(S)-原人参二醇的产率均明显增大。     

大黄素-大黄素甲醚型二蒽酮化合物安全性研究

目的 评价大黄素-大黄素甲醚型二蒽酮化合物的潜在肝毒性风险。方法 采用计算机分子对接构建尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）与反式-大黄素-大黄素甲醚二蒽酮（trans-EPD）、顺式-大黄素-大黄素甲醚二蒽酮（cis-EPD）的结合模型,考察化合物与酶蛋白的结合位点及结合强弱;体外采用大鼠肝微粒体酶抑制实验评价化合物对UGT1A1的抑制作用;通过细胞增殖与活性检测试剂盒-8（CCK-8）评价化合物对肝细胞活力的影响;采用荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）实验检测肝细胞中UGT1A1 mRNA水平。结果 计算机分子对接实验结果显示,trans-EPD及cis-EPD均与UGT1A1结合于site F区;体外酶抑制实验及细胞毒性实验证明,trans-EPD和cis-EPD均可显著抑制UGT1A1活性,下调其基因表达,产生肝细胞毒性作用。结论 具有大黄素（10→10′）大黄素甲醚或大黄素（10→10′）大黄素甲醚母核结构的二蒽酮化合物可能是一类具有潜在肝毒性的化合物,其作用靶点为胆红素代谢酶UGT1A1。研究结果为此类成分的临床安全用药提供参考。