神经母细胞瘤体外细胞系的构建方法

目的 对神经母细胞瘤(NB)进行体外培养，探讨神经母细胞瘤(NB)体外建系的方法。方法 NB患儿新鲜手术标本，采用组织块培养法、酶消化培养法建立原代细胞系；用选择性酶消化法和机械刮除法进行细胞纯化；从细胞形态学、神经特异性烯醇化酶染色、软琼脂克隆形成实验三方面对细胞进行初步鉴定，证实所培养细胞是否为NB细胞。结果 两种细胞培养法均可培养出NB细胞，纯化后可得形态均一的细胞系。结论 可采用适当的细胞培养方法建立神经母细胞瘤的体外细胞系。     

神经母细胞瘤骨髓转移的细胞形态学及免疫组化

神经母细胞瘤在小儿恶性肿瘤中，仅次于白血病及中枢神经系统肿瘤，约占小儿恶性实体瘤的10％。多见于肾上腺、腹膜后、后纵隔等处。此病高度恶性、分化差，常于短期内转移至骨、淋巴结、肝和肺等处。转移至骨的神经母细胞瘤在细胞形态学上常与恶性淋巴瘤、Ewing瘤、小细胞未分化癌等混淆，鉴别颇难，现收集6例，对其细胞形态学及免疫组化观察分析。     

细胞内钙离子和活性氧在氟化钠致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤中的关系

目的 探讨细胞内钙离子水平([Ca2+]1)和活性氧(ROS)在氟化钠(NaF)致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤中的关系.方法 用40 mg/L NaF对SH-SY5Y细胞进行染毒,检测在染毒不同时间(0、3、6、12、18、24 h)的[Ca2+]1和ROS水平的变化,选择最佳染毒时间;观察最佳染毒时间(12 h)40 mg/L NaF与38.23 mg/L BAPTA-AM或380.40 mg/L乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)或16.32 mg/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)共同和单独作用下,[Ca2+]1、细胞内ROS和培养液乳酸脱氢酶(LDH)水平变化.结果 染毒3、6、12、18、24 h,[Ca2+]1水平(5620.0±226.3、4775.5±85.6、3312.3±87.5、3047.0±75.0、2717.0±66.5),与0 h(2115.0±24.0)比较,均明显升高(P<0.05);ROS水平(4449.53±324.61、7463.07±117.43、20 227.33±178.04、8817.56±200.13、7975.61±92.90),与0 h(4098.01±21.22)比较,除3 h外也明显升高(P<0.05);[Ca2+]1、ROS达到峰值的时间分别为3、12 h.[Ca2+]1、LDH水平,NaF组[3279.5±94.0,(1057.50±64.35)U/L]、NaF+NAC组[3583.0±350.7,(561.02±85.50)U/L]、NaF+EGTA组[3701.5±157.7,(1074.50±86.97)U/L]、NaF+BAPTA-AM组[2766.5±38.9,(521.43±40.80)U/L],与对照组[2022.5±118.1,(186.97±8.73)U/L]比较,均有明显升高(P<0.05);ROS水平,NaF组(19 003.04±332.34)、NaF+EGTA组(19 170.12±95.46)明显高于对照组(4060.98±145.66,P<0.05).在财ROS和LDH的影响中,NaF与NAC之间存在拮抗作用(F值分别为976.11、43.54,P<0.05).在对[Ca2+]1、ROS和LDH水平的影响中,NaF与BAPTA-AM之间存在拮抗作用(F值分别为15.65、1515.53、115.00.P<0.05).结论 NaF诱导SH-SY5Y细胞损伤的机制可能是通过胞内钙库的释放而提高[Ca2+]1水平,升高的[Ca2+]1促使ROS的产生,二者共同对细胞产生毒性,导致细胞培养液中LDH水平升高.     

疱疹病毒变异株对神经母细胞瘤有潜在作用

据Medscape．com 12月7日报道(原载Pediatr Blood Cancer 2005；44：1—10)，减毒的单纯疱疹病毒(HSV)对几种神经母细胞瘤(Nb)细胞系有很强的溶瘤细胞活性，在疾病的动物模型中也一样。     

人SUMO病毒载体构建及稳转神经母细胞瘤SHSY5Y细胞系的建立

目的构建表达人小泛素化相关修饰蛋白(SUMO)基因的逆转录病毒载体,并观察其稳定感染神经母细胞瘤SHSY5Y细胞后SUMO蛋白的表达情况。方法用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA 3.0-HA-SUMO1、pcDNA3.0-HA-SUMO2、pcDNA 3.0-HA-SUMO3质粒,得到3×Flag-SUMOs基因的编码序列,定向插入到pBabe-puro载体中,经扩增、筛选阳性克隆、酶切和测序验证后,转染293T细胞进行病毒包装、扩增、纯化获取逆转录病毒颗粒。将逆转录病毒颗粒感染SHSY5Y细胞,经嘌呤霉素筛选后抗性克隆集落长出。Western blot检测稳定转染的pBabe-3×Flag-SUMOs-SHSY5Y单克隆细胞SUMO1～3的表达。结果 pBabe-3×Flag-SUMOs-puro质粒构建正确。稳定转染的SHSY5Y细胞系3×Flag-SUMOs表达明显增强。结论成功构建了稳定表达SUMO的pBabe-3×Flag-SUMOs-SHSY5Y细胞系。     

Fas/FasL途径在氟致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

目的 探讨Fas/FasL途径在氟致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡中的作用.方法 用不同剂量氟化钠[NaF,0(对照)、20、40、80 mg/L].SH-SY5Y细胞进行染毒,24 h后检测细胞存活率、凋亡率和Fas、FasL mRNA表达;选择40 mg/L NaF组,观察在Fas受体激动剂(CH11)或拮抗剂(ZB4)作用下细胞凋亡率及Fas、FasL mRNA表达水平的改变.结果 40、80 mg/L组细胞存活率[(84.63±2.57)%、(69.04±5.63)%]明显低于对照组(100.00%),组间比较差异有统计学意义(P<0.01);细胞凋亡率随染毒剂量的升高呈上升趋势.40、80 mg/L组细胞凋亡率[(8.54±1.95)%、(17.94±2.71)%]明显高于对照组[(3.32±1.33)%],组间比较差异有统计学意义(Jp<0.05);NaF能不同程度地上调Fas、FasL mRNA表达,使Fas/β-actin[40mg/L组(0.94±0.51)、80 mg/L组(0.99±0.12)]和FasL/β-actin[40 mg/L组(0.96±0.42)、80 mg/L组(0.99±0.24)]比值增加.与对照组[Fas/β-actin(0.50±0.33)、FasL/β-actin(0.58±0.23)]比较,差异均有统计学意义(P<0.05).在对细胞凋亡率和Fas、FasL mRNA表达水平的影响中,NaF与CH11之间存在协同作用(,值分别为32.89、18.46、14.69,P<0.01),NaF与ZB4之间存在拈抗作用(F值分别为5.73、24.26、10.17,P<0.05或<0.01).结论 NaF可诱导SH-SY5Y细胞凋亡,Fas/FasL途径在NaF诱导SH-SY5Y细胞凋亡中起重要作用.     

组织因子表达影响阿霉素对人神经母细胞瘤细胞毒性的研究

目的：研究组织因子（TF）表达对阿霉素在人神经母细胞瘤细胞系中细胞毒性的影响。方法：以Western Blotting检测TF表达。分子生物学方法构建TFsiRNA—pSUPER表达载体，以脂质体介导进行基因转染。以WST法检测阿霉素细胞毒性。结果：①人神经母细胞瘤细胞系SK—N—MC高表达TF；②所构建的TFsiRNA—pSUPER表达载体转染SK-N—MC细胞后，呈剂量依赖性降低TF表达水平；③转染TFsiRNA-pSUPER的SK—N—MC细胞与转染pSUPER质粒的对照细胞分别以不同浓度的阿霉素处理后，前者与后者相比存活细胞数显著降低。结论：以siRNA特异性下调人神经母细胞瘤细胞SK—N—MC中的TF表达，可增强阿霉素的细胞毒性。TF的异常高表达有可能增强肿瘤细胞对化疗药物的耐受性，籍此影响疾病预后。     

选择性COX-2抑制剂CAY10404对人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH的影响

采用MTT比色法计算环氧合酶-2（COX-2）抑制剂CAY10404对人神经母细胞瘤（NB）细胞（简称SK-N-SH细胞）的抑制率,台盼蓝拒染法观测细胞群体倍增时间（TD）,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期变化。不同浓度的CAY1040作用SK-N-SH细胞后,其增殖受到抑制,并呈时间和剂量依赖性,细胞凋亡率升高。提示选择性COX-2抑制剂能抑制人NB细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

独角莲醇提液对H22荷瘤鼠的抑瘤及抗氧化作用

目的探讨独角莲醇提物对H22肝癌荷瘤鼠动物模型的抑瘤作用及其抗氧化机制。方法以H22荷瘤鼠为研究对象,独角莲醇提物灌胃给药,观察其对小鼠肿瘤的抑瘤率、体重增长率的影响。采用分光光度法检测血清中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果腹腔注射5-Fu和经胃灌服独角莲醇提液对H22荷瘤鼠肿瘤组织均有抑制作用(P<0.05),体重增长率、SOD活性和T-AOC水平较对照组明显增高(P<0.05),而MDA含量则显著下降(P<0.05),独角莲醇提液与对照组比较有显著差异。结论独角莲醇提液对H22荷瘤鼠肝癌组织生长具有抑制作用,其作用机制可能与提高H22荷瘤鼠抗氧化能力有关。     

儿童神经母细胞瘤的治疗与预后

神经母细胞瘤(NB)是威胁儿童生命的主要恶性肿瘤之一,素有小儿“癌王”之称。NB由未分化的交感神经细胞组成,起源于神经嵴。沿交感神经节链从颈部一直到盆腔及肾上腺髓质均可发生,具有高度恶性。多发生1～5岁儿童,男性略多于女性。NB的临床表现复杂多样,有时因并发症而就诊。1990～2004年,我院收治经手术病理检查证实的NB24例。现报告如下,并探讨其治疗方法及预后。     

肝癌细胞不同制悬方法建立裸鼠移植瘤模型的比较

目的比较肝癌细胞不同制悬方法建立裸鼠皮下瘤及原位瘤模型,优选建模方法。方法将肝癌细胞分别采用PBS缓冲液(PBS组)、无血清DMEM溶液(DMEM组)和含10%血清的DMEM溶液(血清DMEM组)3种液体制悬后注入裸鼠皮下建立肝癌裸鼠皮下瘤模型,比较皮下瘤的体积、瘤重及成瘤率;将肝癌细胞分别采用PBS缓冲液(PBS组)、无血清DMEM溶液(DMEM组)和含10%血清的DMEM溶液(血清DMEM组)3种液体制悬后注入裸鼠肝脏建立肝癌裸鼠原位瘤模型,比较原位瘤的成瘤率。结果3组裸鼠皮下瘤模型的皮下瘤体积及瘤重相比,差异无统计学意义(P0.05),但是PBS组及DMEM组的成瘤率(90%和100%)明显高于血清DMEM组(40%),差异有统计学意义(P0.05);裸鼠原位瘤模型中PBS组的成瘤率(90%)明显高于DMEM组(40%)及血清DMEM组(20%),差异有统计学意义(P0.05)。结论采用PBS缓冲液或无血清DMEM溶液对肝癌细胞稀释制悬可以有效建立裸鼠皮下瘤模型,采用PBS缓冲液对肝癌细胞稀释制悬可以有效建立裸鼠原位瘤模型。     

人肝癌细胞系7721丙型肝炎病毒体外感染模型的建立

目的　建立接近体内自然感染状态并能稳定支持丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） 体外长期复制的感染细胞模型。方法　将人肝癌细胞系７７２１ 与慢性丙型肝炎患者血清共温育８ 小时后,分别以逆转录聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞和／ 或培养上清中的ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶ 抗原表达及ＨＣＶＲＮＡ 在感染细胞内的定位。结果　感染血清和细胞共同温育后的第２ ～６６ 天,从细胞内和培养上清中均可间断地检测出ＨＣＶ 正、负链ＲＮＡ,即使其间细胞传代６ 次,ＨＣＶ ＮＳ３ 、ＮＳ５ 抗原在细胞内能稳定表达,原位杂交显示ＨＣＶ ＲＮＡ 阳性物质多位于细胞浆。结论　７７２１ 细胞不但对ＨＣＶ 易感,而且可以稳定地支持ＨＣＶ 的体外长期复制,此模型可以用于ＨＣＶ 感染、复制机制的研究、抗病毒药物的评价及保护性抗体／ 疫苗的初步筛选。     

人NPTX2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建入神经元正五聚蛋白2(NPTX2)真核表达载体.转染人胰腺癌细胞PANC1,建立稳定转染的细胞系.方法 通过双酶切的方法获得人NPTX2全长cDNA,利用Not I和EcoR I酶切位点将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序验证盾,用脂质体转染法转染PANC1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的PANC1细胞,用实时定量PCR方法筛选NPTX2 mRNA高表达克隆.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)-NPTX2真核表达载体.并建立了稳定转染的PANC1细胞,成功表达了目的 基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染PANC1细胞系的建立为进一步研究NPTX2基因在胰腺癌细胞的作用奠定了良好的基础.     

Metastatic human hepatocellular carcinoma models in nude mice and cell line with metastatic potential

Metastatic human HCC model is needed for the studies onmechanism and intervention of metastatic recurrence,Byusing orthotopic implantation of histologically intacttissues of 30 surgical specimens,a patient-likemetastatic model of human HCC in nude mice (LCI-D20)and a low metastatic model of human HCC in nude mice(LCI-D35) have been established.All mice withtransplanted LCI-D20 tumors exhibited extremely highmetastatic ability including spontaneous metastasis toliver,lungs,lymph nodes and peritoneal seeding.Remarkable difference was also found in expression ofsome of the invasiveness related genes and growthfactors between the LCI-D20 and LCI-D35 tumors.PAI-1increased gradually following tumor progression in LCI-D20 model,and correlated with tumor size and AFP level.Phasic expression of tissue intercellular adhesionmolecule-1 in this model was also observed.Using cornealmicropocket model,it was demonstrated that the vascularresponse induced by LCI-D20 tumor was stronger than thatinduced by LCI-D35 tumor.Similar report on metastatichuman HCC model in nude mice and human HCC cell linewith metastatic potential was rarely found in theliterature.This LCI-D20 model has been widely used forthe studies on intervention of metastasis,including anti-angiogenesis,antisense approach,metalloproteinaseinhibitor,differentiation inducer,etc.It is concluded thatthe establishment of metastatic human HCC model in nudemice and human HCC cell line with metastatic potentialwill provide important models for the in vivo and in vitrostudy of HCC invasiveness,angiogenesis as well asintervention of HCC recurrence.     

First attempt to produce experimental Campylobacter concisus infection in mice

AIM： TO infect mice with atypical Campylobacter concisus （C. concisus） for the first time. METHODS： Three separate experiments were conducted in order to screen the ability of five clinical C. concisus isolates of intestinal origin and the ATCC 33237 type strain of oral origin to colonize and produce infection in immunocompetent BALB/cA mice. The majority of the BALB/cA mice were treated with cyclophosphamide prior to C. concisus inoculation to suppress immune functions. Inoculation of C. conc/sus was performed by the gastric route. RESULTS： C. concisus was isolated from the liver, ileum and jejunum of cyclophosphamide-treated mice in the first experiment. No C. concisus strains were isolated in the two subsequent experiments. Mice infected with C. concisus showed a significant loss of body weight from day two through to day five of infection but this decreased at the end of the first week. Histopathological examination did not consistently find signs of inflammation in the gut, but occasionally microabscesses were found in the liver of infected animals. CONCLUSION： Transient colonization with C. concisus was observed in mice with loss of body weight. Future studies should concentrate on the first few days after inoculation and in other strains of mice.     

大鼠心肌缺血再灌注损伤后无复流模型的制备

目的制备大鼠心肌缺血再灌注损伤后无复流模型,探讨建立模型过程中的关键点,为该疾病模型的成功复制提供参考。方法选取20只SD大鼠,随机分成无复流组(n=15)和假手术组(n=5)。无复流组结扎冠状动脉左前降支45 min后再灌注120 min;假手术组只穿线不结扎。在再灌注末予硫磺素S活体染色确定无复流区,同时监测大鼠呼吸及心电图变化。结果 20只大鼠全部存活,且心电图在心肌缺血期均出现心率加快、Ⅱ导联ST段抬高;恢复心肌灌注后,ST段下降30%;硫磺素S染色显示出无复流区域。结论该方法可成功复制无复流动物模型,且模型制作方法成功率高,动物存活率也高。     

氨氯地平对家兔实验性动脉粥样硬化的防治作用

目的 探讨氨氯地平对动脉粥样硬化(AS)家兔模型的预防治疗作用。方法 动态观察各模型组血胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平，光镜、电镜观测各组动脉粥样硬化面积．结果 氨氯地平和硒维尔 VE可降低。FG、LDL水平．升高HDL水平．动脉粥样硬化斑块面积的测定以预防组最小．结论 氨氯地平对AS发生．发展的重要因素LDL、平滑肌细胞移行和增生、平滑肌细胞从收缩型向合成塑转化等均有抑制作用，特别是早期用药效果明显，提示了氨氯地平抑制AS形成和发展的部分机理。     

HCV 5''''NCR转基因小鼠模型的初步建立

目的 为进行反义核酸抗ＨＣＶ药物的体内活性评价。方法 以含ＣＭＶ启动子的ＨＣＶ ５＇ＮＣＲ与荧光素酶基因的融合基因为转基因片段，经显微注射导入ＩＣＲ小鼠受精卵原核，由移植鼠获６８只仔鼠，取鼠尾组织经ＰＣＲ方祛鉴定转基因整合鼠，取整合鼠的子代阳性鼠的肝肾组织采用ＲＴ—ＰＣＲ方法进行ｍＲＮＡ表达鉴定，同时取其心、肝及肾组织进行荧光素酶活性检测。结果 共有１３只Ｇ０代阳性整台鼠，整合率为１９．２％；有３只整合鼠后代的肝肾组织中有ｍＲＮＡ表达；有１个转基因小鼠系心、肝、肾组织中显示荧光素酶活性。该系小鼠在外形、生长速度及繁育方面与正常小鼠无异。结用 ＨＣＶ ５＇ＮＣＲ转基因小鼠模型的初步建立提示ＣＭＶ启动子启动转录的ＨＣＶ ５＇ＮＣＲ－荧光素酶融合基因构件在转基因小鼠体内能够表达，这为ＨＣＶ ５＇ＮＣＲ转基因小鼠模型的进一步研究奠定了基础。