稳定表达人水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4的建立及应用

 【目的】 建立一种可临床应用的并能稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4,用于检测视神经脊髓炎患者血清中的AQP4抗体｡ 【方法】 构建有AQP4基因的表达载体,利用脂质体将载体转入HEK293细胞,G418筛选,RT-PCR､间接免疫荧光检测稳定细胞系中水通道蛋白4的表达及分布｡细胞间接免疫荧光检测20例NMO患者､20例MS患者､30例健康对照血清中的AQP4抗体,并同鼠脑间接免疫荧光检测法比较｡ 【结果】 限制性酶切消化､PCR､测序结果证明载体构建成功｡间接免疫荧光证实稳定细胞系中有AQP4表达,且主要分布在细胞膜上｡20 例NMO患者血清中11例NMO-IgG阳性,18例AQP4抗体阳性,滴度在1 ∶ 60 - 1 ∶ 15 360之间,而MS患者仅检测到1例阳性,健康对照未检测到阳性｡ 【结论】 成功构建稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4 ,并检测出国人NMO患者血清中存在AQP4抗体,且敏感性高于鼠脑法,可以有效的鉴别视神经脊髓炎和多发性硬化｡ 关键词: 视神经脊髓炎; NMO-IgG; 水通道蛋白4( AQP4); HEK293     

表达AQP4不同亚型的细胞系检测AQP4抗体敏感性的研究

【目的】 研究表达不同亚型的AQP4细胞系检测中国人群视神经脊髓炎患者血清中AQP4抗体的敏感性? 【方法】 根据纳入标准共获取血清205例,其中包括视神经脊髓炎40例,长节段性脊髓炎39例,复发性视神经炎39例,多发性硬化47例,另设40例健康对照?使用稳定表达水通道蛋白4的四种细胞系HEK293/pcDNA3.1(+)-M23-AQP4?HEK293/pcDNA3.1(+)-M1-AQP4、HEK293/pEGFP-N3-M23-AQP4?HEK293/pEGFP-N3-M1-AQP4通过细胞间接免疫荧光法分别检测以上血清中的AQP4抗体?【结果】 NMO-IgG普遍存在于视神经脊髓炎疾病谱中?AQP4抗体同AQP4两种亚型结合敏感性比较发现,M23-AQP4的敏感性高于M1-AQP4?同时绿色荧光蛋白作为标签蛋白,可能干扰抗体同AQP4的结合?【结论】M23-AQP4作为靶抗原检测血清中AQP4抗体优于M1-AQP4, 临床中采用细胞间接免疫荧光法对抗体进行检测时应首选表达M23-AQP4亚型的细胞系进行检测?     

水通道蛋白4慢病毒表达载体的构建与临床应用

目的 构建水通道蛋白4(AQP4)慢病毒表达载体,并检测视神经脊髓炎(NMO)患者血清中的抗AQP4抗体.方法 从人胶质母细胞瘤中提取RNA,通过RT-PCR获得人AQP4目的片段,将目的片段克隆到慢病毒表达载体中,转染HEK-293T细胞,通过RT-PCR、Western印迹及细胞免疫荧光检测鉴定AQP4表达,并对人血清中抗AQP4抗体初步检测.结果 质粒测序结果与Genbank中人AQP4编码片段完全相符,转染人AQP4的HEK-293T细胞能稳定表达AQP4.细胞免疫荧光法检测12例NMO患者血清,11例阳性(91.7%);34例多发性硬化阳性4例(11.8%);50名健康人群血清均为阴性.结论 HEK-293T细胞经水通道蛋白4慢病毒表达载体转染后能够稳定表达AQP4,可用于临床NMO患者抗AQP4-抗体的检测.     

水通道蛋白－9表达载体的构建及视神经脊髓炎患者血清中抗体的检测

目的：构建一种能稳定表达人水通道蛋白－9（ AQP9）的真核细胞载体,并检测视神经脊髓炎（NMO）患者血清中的AQP9抗体。方法将人AQP9基因克隆入pcDNA3．1＋质粒中构建AQP9－pcDNA3．1＋载体,并转染HEK－293T细胞中。 AQP9蛋白的表达通过RT－PCR和Western blot法验证。通过间接免疫荧光法检测NMO患者血清中的AQP9抗体。结果 AQP9的mRNA相对表达量明显高于空载体,且蛋白表达量在32 kD条带附近明显高于空载和293T细胞。在4例NMO患者血清中均检测到AQP9抗体,1例脑梗死和1例健康人中抗体均为阴性。结论这种转染表达AQP9的细胞模式相对简捷,可用来检测NMO患者中的AQP9抗体,对NMO研究有一定意义。     

水通道蛋白4抗体检测的方法学比较及其临床意义

为了比较经典分析法和水通道蛋白4（AQP4）抗体分析法对AQP4抗体检测率的异同,并探讨该抗体对区分中国视神经脊髓炎（NMO）和多发性硬化（MS）患者的诊断准确度,中山大学附属第三医院神经病学科龙友明等选择44例NMO和46例MS患者的血清,     

AQP4真核表达载体的构建和AQP4-M23蛋白在中国仓鼠肺细胞系V79中的表达

目的：构建水通道蛋白4（AQP4）真核表达载体pmCherry-N1-hAQP4-M23,检测AQP4-M23蛋白在中国仓鼠肺细胞系V79中的表达。方法：采用PCR方法扩增hAQP4-M23基因,经双酶切后与真核表达载体pmCherry-N1连接,构建pmCherry-N1-hAQP4-M23重组表达质粒。采用脂质体将其转染至V79细胞中,将细胞随机分为对照组（未转染重组质粒的V79细胞）和转染组（转染重组质粒的V79细胞）。利用RT-PCR法和荧光显微镜检测2组细胞中hAQP4-M23基因的表达;取视神经脊髓炎（NMO）患者血清中抗AQP4抗体,与2组细胞结合,采用免疫荧光和水通透性法检测2组细胞中hAQP4-M23的活性。结果：成功构建AQP4真核表达载体;荧光显微镜观察,转染组细胞膜清晰表达红色荧光;免疫荧光检测,转染组细胞膜呈现绿色荧光,表明转染组细胞膜AQP4-M23蛋白可与NMO患者血清成分结合;与对照组比较,转染组细胞中hAQP4-M23活性升高（P<0.05）。结论：成功构建表达AQP4基因的真核表达载体,并在V79细胞系中成功表达hAQP4-M23蛋白。     

中枢神经脱髓鞘疾病血清水通道蛋白4抗体检测的临床意义

目的研究中枢神经脱髓鞘疾病患者血清水通道蛋白4抗体(AQP4-Ab)阳性率,并探讨其临床意义。方法采集2008年11月至2010年10月间就诊于我院神经内科门诊和病房的185例中枢神经系统脱髓鞘疾病患者血清,其中视神经脊髓炎(NMO)72例,多发性硬化(MS)68例,视神经炎(ON)4例,横贯性脊髓炎(TM)41例;后者包括非长节段横贯性脊髓炎(nLETM)19例,单次发作长节段横贯性脊髓炎(mLETM)14例,复发长节段横贯性脊髓炎(rLETM)8例。采用细胞间接免疫荧光技术检测患者血清AQP4-Ab,统计其阳性率并进行分析。结果 AQP4-Ab在NMO、MS、ON、TM组的阳性率分别为72.2%(52/72)、5.9%(4/68)、25.0%(1/4)、17.1%(7/41),NMO组显著高于MS组(P<0.01);nLETM、rLETM和mLETM组AQP4-Ab阳性率分别为5.3%(1/19)、62.5%(5/8)和7.1%(1/14),rLETM组显著高于nLETM组(P<0.01)和mLETM组(P<0.05)。rLETM和NMO组间AQP4-Ab阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AQP4-Ab在NMO和rLETM患者血清阳性率高,支持两者同属于视神经脊髓炎谱系疾病;AQP4-Ab可以作为诊断NMO并与MS相鉴别的重要指标,对于AQP4-Ab阳性患者应给予高度关注和更为积极的免疫抑制治疗。     

中国人视神经脊髓炎疾病谱NMO-IgG/anti-AQP4抗体检测方法学的比较

[目的]建立NMO-IgG/anti-AQP4抗体检测的间接免疫荧光法(IIF),细胞分析法(CBA)和荧光免疫沉淀法(FIPA)法;研究并比较不同的检测方法对中国人群NMO疾病谱的检测效率.[方法]建立3种检测NMO-IgG/anti-AQP4抗体的方法,包括IIF、CBA和FIPA.应用盲法检测病人血清106例,其中视神经脊髓炎(NMO)组24例,纵形扩展性脊髓炎(LETM)组22例,多发性硬化(MS)组30例,健康对照(HC)组30例;对其检测的阳性率进行分析.[结果]通过3种方法检测,发现NMO组NMO-IgG/anti-AQP4抗体阳性率分别为IIF(62.5%,15/24),CBA(91.7%,22/24)及FIPA(75.0%,18/22),LETM组为IIF(59.1%,13/22),CBA(86.4%,19/22)及FIPA(72.3%,16/22),MS组IIF、CBA及FIPA均为(3.3%,1/30).正常对照组未见该抗体阳性表达.NMO组及LETM组血清NMO-IgG/anti-AQP4抗体阳性率明显高于Ms和健康对照组.[结论]在中国人群NMO疾病谱患者中,IIF、CBA和FIPA的检测效率基本和美欧报道一致.IIF是该抗体检测的基础方法;CBA法看起来最为敏感;FIPA检测可以量化该抗体,可用于临床高通量大样品筛查.     

水通道蛋白-4抗体的检测

视神经脊髓炎（neuromyelitis optica， NMO）是一种中枢神经系统的炎症性脱髓鞘性综合征，主要的临床特点包括严重的视力损害和脊髓损害，目前被认为与体液免疫紊乱有关。 NMO体液免疫机制的进展促使了血清中特异性抗体的发现。2004年，美国LENNON等［1］采用小鼠的脑组织作为基质，间接免疫荧光法（ indirect immunofluorescence ）检测出NMO患者血清中的IgG自身抗体。该抗体与分布于软脑膜、软膜下、Virchow-Robin腔及小脑、中脑、脊髓的灰白质交界的抗原结合，称为NMO-IgG抗体，并证实水通道蛋白-4（AQP4）是该抗体的候选抗原［2］。     

视神经脊髓炎临床和核磁共振特点及水通道蛋白4抗体分析

目的探讨视神经脊髓炎(NMO)的临床特征及相关辅助特点。方法回顾性分析16例NMO患者的临床特征、磁共振和水通道蛋白4(AQP4)抗体检查资料。结果首发症状以视觉障碍起病3例,以横贯性脊髓病变起病11例,以视觉障碍及横贯性脊髓病变起病2例;同时少部分患者伴有非脊髓、视神经症状。AQP4抗体阳性14例,其中12例出现复发。脊髓MRI检查发现脊髓病灶≥3个椎体节段13例,呈长T1和长T2信号改变、斑片状强化。头部MRI检查显示颅内病灶8例,主要分布于皮质下、下丘脑、丘脑、第三、第四脑室周围和脑干。急性发作期予大剂量甲泼尼龙冲击治疗,早期症状均有改善。结论 NMO主要表现为横贯性脊髓炎和视神经炎,其脊髓、视神经和颅内MRI具有特征性。在疾病急性期用甲泼尼龙等治疗可改善临床症状。血清AQP4抗体有助于NMO的诊断及预后提示。     

水通道蛋白1、4在培养大鼠星形胶质细胞、BT325细胞及人脑胶质瘤组织中的表达

目的 水通道蛋白作为细胞膜特异性水转运蛋白在脑内分布广泛,参与脑内水平衡调节,与脑肿瘤、脑创伤等多种疾病导致的脑水肿有关.本实验主要研究水通道蛋白1、4在培养大鼠星形胶质细胞、人多形性胶质母细胞瘤系BT325细胞及人脑胶质瘤组织中的表达情况.方法 应用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定培养大鼠星形胶质细胞及BT325细胞.应用反转录PCR法检测GFAP、AQP1及AQP4在不同组织细胞中的表达.结果 实验中培养大鼠星形胶质细胞及BT325细胞GFAP免疫细胞化学染色阳性.体外培养大鼠星形胶质细胞、人胶质母细胞瘤组织及对照组标本均有GFAP表达,同时也有AQP1及AQP4表达.BT325细胞只有GFAP表达,无AQP1及AQP4表达.结论 AQP1、4在培养大鼠星形胶质细胞及胶质瘤组织中均有表达,可能对脑功能的维持及肿瘤性脑水肿的发生、消散有重要影响.     

脑水肿的AQP4调节机制研究进展

水平衡对于机体维持稳态至关重要。机体主要通过水通道蛋白（aquaporins,AQPs）调节水的平衡。哺乳动物有13种水通道蛋白（AQP 0-12）。其中,AQP4主要分布在星形胶质细胞上,是中枢神经系统中最主要的一种,与脑水肿的发生密切相关。AQP4的短时磷酸化修饰和长时表达调节在血管源性和细胞毒性脑水肿中起重要作用。     

水通道蛋白1、3、4、5在内毒素性急性肺损伤小鼠肺组织中的表达

目的:研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)小鼠肺组织中水通道蛋白(AQP)1、3、4、5的表达变化,探讨水通道蛋白1、3、4、5表达与急性肺损伤的关系.方法:40只健康雄性的C57BL/6小鼠随机分为LPS 4 h组、LPS 6 h组、LPS 8 h组、LPS 10 h组(以LPS诱导ALI模型)和对照组,每组8只.采用实时定量PCR测定小鼠AQP-1、AQP-3、AQP-4和AQP-5 mRNA表达,免疫组化和Western印迹法观察AQP-1、AQP-3、AQP-4和AQP-5蛋白表达,同时进行肺湿/千重比值测定以及肺组织病理染色.结果:LPS 4 h、6 h、8 h、10 h组肺湿/干重比值(4.39±0.19、4.58±0.17、4.87±0.21、5.28±0.16)明显高于对照组(3.99±0.25,P＜0.05).LPS灌注后4 h AQP-1蛋白量减少至对照组的(74.1±5.2)%,AQP-5降至对照组的(70.3±7.1)%;LPS灌注后8 h AQP-1蛋白量减少至对照组的(45.2±4.4)%,AQP-5降至对照组的(38.6±8.9)%.AQP-3和AQP-4的表达没有明显变化.结论:AQP-1和AQP-5可能参与ALI液体的异常转运,可能与肺水肿的发病机制有关.AQP-3和AQP-4可能不参与ALI肺水肿的形成过程.     

水通道蛋白4基因克隆及其载体的构建

目的:克隆大鼠水通道蛋白4(AQP4)基因并构建其载体为进一步研究提供理论基础和研究工具。方法:提取正常健康SD大鼠小脑皮质总RNA，采用随机引物法进行逆转录构建大鼠小脑cDNA文库，应用自行设计的AQP4特异性引物，进行AQP4特异性扩增。利用设计的酶切位点进行相应的内切酶酶切后插入pcDNA3．1Zeo( )质粒中。结果:引物扩增出长度为993bp的片段，为AQP4序列的全段，并正确插入到pcDNA3．1Zeo( )质粒中。上海生工生物工程技术公司片段测序结果与U14007报道的序列相同。结论:正确克隆了大鼠AQP4基因并成功构建了其载体，该基因及其载体可以作为进一步研究的工具。     

水通道蛋白-4在正常大鼠脊髓内的分布

目的: 明确正常大鼠脊髓内水通道蛋白-4(AQP4)的表达与分布,为进一步研究其生理功能提供理论依据. 方法: 采用AQP4 mAb,对正常SD大鼠脊髓的冰冻切片进行免疫组织化学染色,检测AQP4蛋白的表达水平. 结果: 免疫组织化学染色结果显示阳性着色细胞包括有胶质细胞、中央管室管膜上皮细胞、脊髓前角运动神经元、软脊膜上皮细胞,着色部位主要在细胞膜,其中在胶质细胞表现出一定的方向性,主要分布在与毛细血管内皮细胞接触的一侧. 结论: AQP4在正常大鼠脊髓内具有广泛的表达,在胶质细胞上其表达分布于与血脑屏障相关的毛细血管内皮细胞的一侧. 其表达的解剖分布提示AQP4在脊髓内主要参与中央管内水代谢以及神经组织间的水代谢调节.     

AQP1、AQP2及AQP3在人腺性膀胱炎组织中的表达

目的：研究水通道蛋白（aquaporin,AQP）1、2、3在人腺性膀胱炎组织中的分布及表达情况。方法：取经尿道腺性膀胱炎电切手术切取的腺性膀胱炎组织及周围正常膀胱组织各30例,应用免疫组织化学S-P法检测AQP1、AQP2及AQP3的分布及表达，并通过计算机对染色结果进行灰度值测定。结果：在腺性膀胱炎组织中AQP1主要表达在微血管内皮细胞，免疫组化阳性指数35.947；AQP2主要表达在炎性膀胱黏膜上皮细胞的胞膜及胞质内，免疫组化阳性指数34.644；AQP3则呈阴性表达。AQP1在正常膀胱组织中主要表达于膀胱黏膜下微血管和小动脉的内皮细胞, AQP2和AQP3表达于膀胱黏膜上皮细胞的细胞膜及胞质中。AQP1、AQP2及AQP3在正常膀胱组织的免疫组化阳性指数分别为57.038、61.425及60.468，与在腺性膀胱炎组织中的表达比较差异有显著性（P<0.01）。结论：腺性膀胱炎时AQPs的表达量明显减低，炎症病变影响AQPs在膀胱组织中的的表达。     

AQP3在人非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的：检测水通道蛋白-3（AQP3）在非小细胞肺癌（NSCLC）组织和血清中的表达,旨在研究其与非小细胞肺癌发生、发展的关系.方法：采用免疫组化法（SP）及酶联免疫法（Elisa）检测42例非小细胞肺癌患者组织和血清中AQP3水平.结果：（1）AQP3在非小细胞肺癌组织中阳性表达率（71.43％）显著高于对照组（30％）（P＜0.05）,AQP3的高表达与病理类型、分化程度、有无淋巴结转移有关,而与性别、年龄、是否吸烟、TNM分期无关.（2）非小细胞肺癌组血清AQP3浓度（3.53±1.39）ng/L,明显高于健康人组（2.80±1.07）ng/L（P＜0.05）,其高表达与病理类型、分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移有关,与性别、年龄、是否吸烟无关.结论：AQP3在非小细胞肺癌组织及血清中的表达异常增高,提示AQP3在非小细胞肺癌发生、发展中发挥作用,血清中AQP3表达水平的检测具有相对无创、标本易得、可动态观察等优点,可作为肺癌的一种检测指标.     

AQP4与Kir4.1在大鼠眼内组织的共表达

目的:探讨AQP4与Kir4.1在大鼠眼内的定位分布及二者的共表达.方法:用免疫组织化学及激光扫描共聚焦显微技术检测AQP4与Kir4.1在大鼠眼内的分布.结果:免疫荧光显示,AQP4与Kir4.1在大鼠视网膜和睫状体内的分布形式相似;免疫荧光双标显示,AQP4与Kir4.1在视网膜Müller细胞及睫状突无色素上皮细胞的顶膜面及基底膜面呈重叠分布.结论:AQP4与Kir4.1在大鼠视网膜Müller细胞及睫状突无色素上皮细胞共表达,提示二者可能具有协同作用,参与房水的产生以及视网膜内水、K 运输平衡的调节.