人原发型肝癌组织cDNA文库的构建

目的 快速构建混合人原发型肝癌组织cDNA文库.方法 从混合人原发型肝癌组织分离总RNA,以含有sfiIB酶切位点的oligo(dT)引物合成第1链cDNA,以含sfiIA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经sfiI(IA & IB)酶切,以CHROMA SPIN-400柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体cDNA文库.结果 经检测共获得3.96×106个重组子,重组率＞93%,文库经扩增后滴度为3.92×109 pfu/ml.结论 用SMART方法构建的原发型肝癌组织cDNA文库质量较高,为以后筛选获取原发型肝癌特异抗原基因或其他相关基因奠定了基础.     

云南个旧肺鳞癌YTMLC细胞cDNA文库构建和鉴定

目的构建云南个旧人肺鳞癌YTMLC-90细胞cDNA文库。方法从培养的人肺鳞癌YTMLC-90细胞株中提取总RNA,利用经修饰的oligo(dr)引物(含S6 ⅠB酶切位点)合成cDNA第一链,同时根据真核生物mRNA5’端帽子结构特点。利用SMART寡核苷酸(含S6 Ⅰ A酶切位点)作为cDNA第一链在mRNA5’端延伸出去的模板,进而以此序列为引物,利用LD-PCR(long-distance PCR)合成双链cDNA,双链cDNA经S6Ⅰ(ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后,克隆入经S6Ⅰ酶切的载体后经体外包装而成cDNA文库。结果人肺癌细胞YTMLC-90的cDNA文库获得1.01×10~6pfu/ml个重组子,重组率为93.2％,文库扩增后,滴度达5.24×10~6pfu/ml,插入cDNA的长度为750～3000bp。结论所构建的cDNA文库具有较好的质量,该文库为进一步筛选、克隆肺癌特异表达基因奠定了基础。     

一种简单快速的cDNA文库构建方法

目的:建立一种以LD-PCR(long-distance-PCR)为基础的cDNA文库的快速构建方法.方法:以鲨鱼再生肝组织为材料获得总RNA,用偶联有Oligo(dT)的磁珠纯化mRNA后,利用含BamH Ⅰ酶切位点的Oligo(dT)16引物在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第一链,进而利用末端转移酶在合成的cDNA第一链的3′末端引入poly-dC尾;以含BamH Ⅰ酶切位点的Oligo(dT)16和含Hind Ⅲ酶切位点的Oligo(dG)10为引物,利用LD-PCR合成双链cDNA,双链cDNA经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同双酶切的pUC19载体后构建成cDNA文库,对文库的容量、重组率以及多样性进行分析.结果:通过本方法构建的cDNA文库容量约为5.84×105个/μg ds-cDNA,重组率为96.7%;对随机提取的30个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得25个不同的cDNA序列,且未见重复序列.结论:本法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的功能基因分析.     

人胃癌混合组织cDNA文库的快速构建和鉴定

目的 :构建人胃癌混合组织cDNA文库 ,筛选克隆胃癌相关基因。方法 :以纯化的 poly(A) + RNA为模板 ,含NotⅠ切点的Oligo (dT) 15为引物 ,利用改良的cDNA快速合成方法 ,反转录合成cDNA第一、二链 ,连接连接子 ,经层析柱纯化去除小片段和多余连接子后 ,重组于噬菌体载体 ,行体外包装后以大肠杆菌Y10 90行滴度测试及扩增后 ,建成cDNA文库。结果 :构建的cDNA文库 ,含 3 2× 10 6重组子 ,重组率为 96 %。扩增后文库的滴度达1 2× 10 12 pfu/L。 结论 :成功地构建了人胃癌混合组织cDNA文库 ,为进一步筛选克隆胃癌的相关癌基因或抑癌基因奠定了基础     

人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库的构建及鉴定

目的:构建人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定基础.方法:用Trizol方法提取人乙型肝炎肝硬化组织总RNA,并用mRNA纯化试剂盒进行mRNA纯化;反转录合成单链cDNA,长距离PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后,用Sfi I酶切;将酶切产物进行分级分离,回收0.4 kb以上的cDNA组分,并与λTripl Ex2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增;鉴定扩增文库的滴度和重组效率;随机挑取11个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量.结果:未扩增文库滴度为1.03×106 pfu/ml,重组效率为97.24%,扩增后文库滴度为1.36×109 pfu/ml,重组效率为99.02%;用载体两端的通用引物进行PCR鉴定,插入片段平均长度为1.02 kb,含1 kb以上的占36.36%,0.5～1 kb的占63.64%.结论:已成功构建一高质量的人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定了基础.     

利用SMART技术构建中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库

目的: 针对人类肝脏蛋白质组计划中大规模基因克隆及构建肝脏蛋白相互作用图谱的研究需要,改造酵母双杂交载体pPC86和pDBleu,并构建中国人肝组织cDNA文库,为肝脏蛋白质组计划的研究奠定基础。 方法: 设计并合成特定寡核苷酸序列,经过处理形成具有黏性末端的双链DNA片段,插入到pPC86、pDBLeu载体相应的酶切位点处,从而获得改造的新载体。利用改造后的载体、中国人正常肝组织mRNA和Clontech公司SMART文库构建试剂盒构建NpDBLeu-cDNA文库。 结果: 酶切鉴定和DNA测序证实改造后载体插入位点和序列正确,成功获得新载体NpPC86和NpDBLeu。滴度测试表明,所构建NpDBLeu肝组织cDNA文库容量为1.93×10⁶ cfu,转化子重组效率为95.2%,扩增文库达到109cfu·mL^-1。 结论: 利用SMART技术成功构建了中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库。     

PTENcDNA抑制子宫内膜癌细胞增殖作用的研究

【目的】研究外源性PTENcDNA对子宫内膜癌细胞生长增殖的影响,探讨子宫内膜癌治疗的新途径。【方法】经携带野生型VIENcDNA的重组腺病毒（Ad—PTEN）介导将PTENcDNA转入人子宫内膜癌细胞RL95—2,用反向聚合酶链反应（RT—PCR）检测出PTENeDNA在R195—2细胞中持续表达,X-gal染色方法测定腺病毒转染效率,台盼蓝染色活细胞计数绘制生长曲线,流式细胞分析仪（FCM）测定细胞周期。受试细胞随机分成（1）Ad—PTEN组：转染复制缺陷型腺病毒Ad—PTEN。（2）Ad—CMV组：转染空载体腺病毒Ad—CMV。（3）对照组：仅用培养基而不加腺病毒。【结果】Ad—PTEN感染RL95—2细胞后,RT—PCR方法检测PTENcDNA在RL95—2细胞中持续表达;X—gal染色方法测得Ad—PTEN最佳感染复数为100。经台盼蓝染色活细胞计数后绘制细胞生长曲线,见经Ad—PTEN感染的细胞生长速度明显低于空载体病毒Ad—CMV感染及未经病毒感染的RL95—2细胞（P〈0．01）,而空载体Ad—CMV感染后的细胞与未经感染的RL95—2细胞比较,生长速度无差异（P〉0．05）;细胞周期分析表明,感染Ad—tWEN后的R195—2细胞G1期细胞比例明显增多,而S期G2-M期的细胞减少（P〈0．05）。【结论】Ad—PTEN介导的PTENcDNA在子宫内膜癌细胞RL95—2中有表达。PTENcDNA在RL95—2的中表达能够抑制细胞的增殖,将细胞周期阻断在G1期。     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

肺癌诊断基因的初步筛选

目的 筛选肺癌细胞恶性转化不同时期差异表达的基因，以期用于肺癌的诊断。方法 应用抑制消减杂交技术(SSH)、测序、cDNA芯片(cDNA Miemarray)、northern blot。结果 利用SSH建立了永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库，其中，A消减文库(BEP2D细胞的cDNA为tester，α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆，B消减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester，BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver)有301个克隆，C消减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester，BEP2D细胞的eDNA为driver)有586个克隆。对文库中107个克隆单向测序发现：19个克隆在GenBank中没有查到对应的同源序列，其它88个克隆共代表了76个不同的已知基因。然后，将3个文库中全部克隆的cDNA制作成cDNA芯片，用该芯片筛选了15例肺癌组织、5例肺癌旁组织和其他8种癌组织(肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、白血病、子宫内膜癌、脑神经角质瘤和结肠癌)中mRNA的表达差异。结果，获得肺癌组织高于肺癌旁组织表达的eDNA26个，肺癌旁组织高于肺癌组织表达的31个，2者高于其他8种癌组织的分别为：肺癌旁组织中63个，肺癌组织中87个。将这208个具较大差异表达的基因重新制作成cDNA芯片，再选用临床上同一鳞癌病人鳞癌和鳞癌癌旁组织各1例与该芯片杂交，发现这些筛选出的基因的确在癌组织和癌旁组织中存在较大差异。结论 这些初步筛选出的差异表达基因有望成为肺癌诊断的侯选基因。     

人胃癌细胞和胃癌组织中胃肠富集Kruppel样因子和肠道富集Kruppel样因子的表达及其临床意义

目的研究人胃癌细胞株和胃癌组织中胃肠富集Kruppel样因子（GKLF）、肠道富集Kruppel样因子（IKLF）的表达及其临床意义。方法采用免疫细胞化学法检测人正常胃上皮细胞株GES-1及胃癌细胞株MKN28、SGC7901、BGC823、HGC27中GKLF、IKLF的表达;采用免疫组织化学法检测96例胃癌组织及其远端正常胃组织中GKLF、IKLF的表达。结果GKLF在人正常胃上皮细胞株内阳性表达,在胃癌细胞株内无表达;IKLF在人正常胃上皮细胞株内无表达,在胃癌细胞株内阳性表达。胃癌组织中GKLF阳性率为20.8%,显著低于远端正常胃组织（64.6%,P〈0.01）,胃癌组织中IKLF阳性率为71.9%,显著高于远端正常胃组织（21.9%,P〈0.01）。GKLF、IKLF表达与胃癌患者的年龄、性别、分化程度、Lauren分型无关（P〉0.05）,但与淋巴结是否有转移及TNM分期显著相关（P〈0.01）。结论GKLF、IKLF在胃癌发生、发展中起一定的作用,检测GKLF、IKLF的表达有助于判断胃癌患者的病情程度和预后。     

小鼠破骨细胞前体细胞酵母双杂交筛选文库的构建

目的为研究巨噬细胞（Macrophage,Mφ）细胞在形成破骨细胞时细胞膜膜蛋白的表达及相互作用机制。方法C57BL/6小鼠长骨骨髓单个核细胞加入M-CSF和RANKL诱导形成破骨细胞,在Mφ细胞开始融合至形成破骨细胞的不同阶段开始收集细胞,提取总RNA,用CloneMiner TM cDNA文库构建试剂盒,采用Gateway非放射标记方法构建小鼠破骨细胞前体细胞全长cDNA文库及酵母表达文库,并将其转化酵母,观察其在酵母中的表达情况。结果构建的小鼠骨髓破骨细胞前体细胞cDNA入门文库滴度为6×106cfu/ml,库容量为3.5×107cfu,重组率为100%,重组子插入cDNA平均片段大小约为1.76kb。利用此入门文库构建的酵母表达文库,重组率100%,插入片段平均长度为1.82kb,绝大多数（87.5%）插入片段在1kb以上,酵母转化实验证实其可在酵母中完整表达。结论 Gateway非放射标记法构建的小鼠骨髓破骨细胞前体细胞cDNA入门文库和酵母表达文库均符合高质量文库要求,且可避免放射性物质的接触。