用原代细胞培养和人全基因表达谱芯片筛选鼻咽癌差异表达基因

目的 利用细胞的原代培养技术及人全基因表达谱芯片技术初步筛选出鼻咽癌差异表达基因,以发现与鼻咽癌发生、发展相关的新的候选基因.方法 分别用1例鼻咽癌细胞株C666及5例鼻咽癌培养出的原代细胞和3例鼻咽正常上皮的原代细胞,进行基因表达谱分析,并以荧光定量PCR及免疫组织化学验证芯片结果.结果 原代培养的鼻咽癌细胞和鼻咽正常上皮细胞通过细胞角蛋白的免疫细胞化学染色、EBER1原位杂交和EBV-DNA荧光定量PCR证实;鼻咽癌原代细胞和鼻咽正常上皮原代细胞的基因表达谱有显著差异;4例以上共同表达的差异基因有493个,包括上调基因264个,下调基因229个.荧光定量PCR及免疫组织化学结果和芯片结果一致.结论 用原代培养细胞及人类全基因组基因芯片构建基因表达谱能够准确、高效地筛选出鼻咽癌相关的差异表达基因,该基因表达谱的建立为研究鼻咽癌分子生物学机制、鼻咽癌的分子分型和分子诊断提供了重要的分子依据.     

CASP8在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的探讨CASP8在鼻咽癌中的表达及临床意义。方法利用基因芯片比较了8组鼻咽癌组织与混合的非癌鼻咽组织之
间的差异表达基因。荧光定量PCR和免疫组化鉴定CASP8基因表达结果的可靠性,并分析CASP8在鼻咽癌中的表达与临床
参数之间的相关性。结果荧光定量PCR确证CASP8 mRNA在鼻咽癌组织中表达下调（P<0.0001）,与芯片结果相一致。免疫
组化结果显示,与非癌鼻咽组织相比,CASP8 蛋白在鼻咽癌组织中表达明显下调（P=0.02）,且下调的表达与淋巴结转移（P=
0.002）及临床分期（P=0.026）呈负相关。结论CASP8表达下调作为不利因素促进了鼻咽癌的发生发展。     

CDK4 mRNA在鼻咽癌的表达及临床意义

目的 探讨CDK4 mRNA在鼻咽癌中的表达以及临床意义.方法 cDNA微阵列被使用检测鼻咽癌与鼻咽组织中的差异表达基因.实时荧光定量PCR确证CDK4在鼻咽癌与鼻咽组织中的表达差异.统计分析CDK4 mRNA表达与鼻咽癌患者临床参数之间的意义.结果 基因芯片显示,CDK4在鼻咽癌中的表达上调.实时荧光定量PCR显示,与鼻咽组织相比,CDK4在鼻咽癌中表达上调.此外,CDK4mRNA表达上调与鼻咽肿瘤大小、淋巴结转移以及临床分期呈正向相关趋势.结论 CDK4过表达促进了鼻咽癌的发生及进展.     

转酮酶样基因TKTL1在人类鼻咽癌发生和转移中的作用

目的 探讨转酮酶样基因TKTL1在人类鼻咽癌发生和转移中的作用.方法 对65例鼻咽癌和9例鼻咽部慢性炎症组织中转酮酶活性进行检测;实时定量PCR检测鼻咽癌和鼻咽部慢性炎症组织中转酮酶基因家族(TKT、TKTL1和TKTL2)mRNA表达水平的变化,并分析TKTL1的表达与鼻咽癌发生和转移的关系.结果 鼻咽癌组织中转酮酶活性较鼻咽部慢性炎症组织明显增强(t=4.12,P=0.00);实时定量PCR结果 示鼻咽癌和鼻咽部慢性炎症组织中TKT和TKTL2 mRNA的表达水平差异无统计学意义(t=1.28、1.62,P=0.32、0.26).然而,鼻咽癌组织中TKTL1的表达水平比鼻咽部慢性炎症组织明显上调(t=6.23,P=0.00),且有淋巴结转移的鼻咽癌组织中TKTL1的表达水平较尤淋巴结转移者明显增强,差异有统计学意义(t=3.28,P=0.00).结论 转酮酶样基因TKTL1在人类鼻咽癌的发生和转移中可能起重要作用,TKTL1有望成为肿瘤治疗研究的新靶点.     

Survivin、Bcl－2、Pml m－RNA 在鼻咽癌组织中的表达及意义

目的：探讨凋亡抑制基因生存素（Survivin）、B 细胞淋巴瘤／白血病－2（Bcl－2）和早幼粒细胞白血病（Pml）m－RNA 在鼻咽癌组织中的表达及意义。方法收集60例鼻咽癌组织标本与30例慢性鼻咽粘膜炎症组织标本，以实时荧光定量聚合酶链反应（ PCR）技术检测 Sur－vivin、Bcl－2和 Pml m－RNA 的表达。结果鼻咽癌组织中 Survivin、Bcl－2和 Pml m－RNA 表达量均高于慢性鼻咽粘膜炎症组织（ P ＜0．01）；鼻咽癌 III ～IV 期患者组织标本中 Survivin、Bcl－2和 Pml m－RNA 表达量均高于 I ～II 期（ P ＜0．01）。结论鼻咽癌组织中 Survivin、Bcl－2和 Pml m－RNA 的表达明显上调，并与临床分期密切相关，可能在鼻咽组织癌变中起到重要作用。     

P16和Bcl-2蛋白在鼻咽部鳞状细胞癌的表达及相互关系

目的探讨多发性肿瘤拟制基因（P16）和B细胞淋巴瘤/白血病基因2（Bcl-2）在不同分期鼻咽部鳞状细胞癌组织及鼻咽部炎症组织中的表达情况。方法应用免疫组化SP二步法检测40例不同分期鼻咽部鳞状细胞癌组织和16例鼻咽部慢性炎症组织中P16及Bcl-2蛋白的表达。结果 P16蛋白在鼻咽部炎症组织中高表达,癌组织中低表达,P16的表达与鼻咽癌的临床分期无明显关系,有颈部淋巴结转移的鼻咽癌患者P16基因表达较无颈部淋巴结转移者低,但差异无统计学意义（P〉0.05）。Bcl-2蛋白在癌组织中高表达,炎症组织中低表达。结论 Bcl-2是在鼻咽部鳞状细胞癌组织中高表达的凋亡抑制基因,P16是鼻咽鳞状细胞癌中低表达的抑癌基因。     

鼻咽癌组织照射2 Gy前后基因表达差异研究

目的研究鼻咽癌组织照射2Gy后基因表达谱的变化。方法采用BioStarH-141s（2004）型含14112点的人类全长基因cDNA表达谱芯片,对1例放射敏感的鼻咽癌组织进行放疗前及放疗2Gy后检测,并分析它们之间的基因表达差异。结果鼻咽癌放疗2Gy后与放疗前比较,组织表达差异基因共38个,其中上调28个,下调10个。表达差异基因中改变最明显的功能群是免疫系统相关的基因,如IGLV1-44、SLPI、CXCL14、IL1RN、HLA-DQA1、HLA-DOA等上调。细胞增殖、细胞调亡、细胞周期、DNA修复系统也有部分基因发生明显变化,如MLL5上调、POLR2B下调等。结论提示对鼻咽癌组织照射2Gy后基因表达谱改变的研究可以更好地阐明放射敏感性差异机理,为放疗前或放疗早期寻找到预测放射敏感性分子标志提供理论依据。     

EB病毒miR-BART4*和miR-BART18-3p在鼻咽癌中的表达及意义

目的 分析EB病毒( EBV) miRNAs在鼻咽癌组织中的表达,探索EBV诱发鼻咽癌的分子机制,寻找鼻咽癌防治和诊断的生物分子标志物. 方法 采用实时荧光定量PCR分析 EBV miRNAs ebv-miR-BART4?和 ebv-miR-BART18-3p在36例鼻咽低分化鳞癌组织和32例慢性鼻咽黏膜炎症组织中的表达水平. 结果 ebv-miR-BART4? 和 ebv-miR-BART18-3p的表达水平( Ct 值)在鼻咽癌组织中分别为(26. 97 ± 2. 67)和(27. 02 ± 2. 32),在鼻咽黏膜炎症组织中的表达水平分别为( 38. 49 ± 3. 05 )和( 39. 39 ± 2. 16 ) ,两种EBV miRNAs在鼻咽癌组织中的表达明显高于鼻咽黏膜炎症组织,差异有统计学意义( P<0. 01 ). 结论 EBV可能通过ebv-miR-BART4?和ebv-miR-BART18-3p高表达诱发鼻咽癌,它们是鼻咽癌诊断和防治的潜在生物分子标志物.     

人鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达分析

目的 用cDNA微阵列膜比较鼻咽癌组织及正常组织的基因表达谱,研究鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达,为进一步探讨差异表达基因的调控机制奠定基础.方法 24例鼻咽癌组织总RNA和正常对照总RNA(24例正常鼻咽组织RNA等质量混合)分别经逆转录探针标记与微阵列膜杂交.然后用Pathway4.0软件分析杂交结果,并用RT-PCR反应验证微阵列杂交结果.结果 在1625个鼻咽癌差异表达基因中,共有转录因子相关基因35个,12个基因表达上调,23个基因表达下调.结论 在鼻咽癌组织中,多个转录因子相关基因的表达水平发生了变化,这些转录因子在鼻咽癌组织的基因表达调控中发挥重要作用.     

基因芯片筛选非综合征型唇腭裂差异表达基因的初步研究

目的：利用全基因组表达谱芯片技术,分析非综合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without palate,NSCL/P）患儿与正常儿童基因表达的差异,筛选出非综合征型唇腭相关基因。方法：采用离心柱法分别提取正常儿童和NSCL/P患儿腭部组织各3例的总RNA,经纯化后逆转录为cDNA,利用荧光染料（Cy3）标记aaUTP,转录合成标记的cRNA,经纯化及质检后与Agilent 4 × 44 k人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据进行归一化处理,利用倍数差异和t检验筛选差异表达基因,采用上海博豪生物在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能,选取特定的差异表达基因,应用实时荧光PCR技术验证芯片结果的可靠性。结果：筛选出差异基因共254个,其中表达上调的有151个,表达下调的有103个。选取5条差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证,ADH1C（t=5.132,P=0.000）、RDH10（t=2.960,P=0.039）、HIST1H2BD（t=4.446,P=0.001）3条基因表达下调,KAT2B（t=-4.945,P=0.000）、FOSB（t=-3.666,P=0.005）2条基因表达上调,差异有统计学意义,且与芯片结果表达趋势一致。结论：NSCL/P患儿基因表达与正常儿童存在明显差异,分析这些差异基因,有助于阐明NSCL/P的发病机制,为疾病的预防提供理论依据。     

应用激光捕获显微切割及蛋白质组学技术筛选鼻咽癌间质相关蛋白

目的筛选与鼻咽癌（NPC）发生发展相关的特异性间质蛋白。方法采用激光捕获显微切割技术（LCM）,获取高纯度的NPC间质和正常鼻咽黏膜（NNM）间质,二维凝胶电泳（2-DE）及质谱技术,分离鉴定间质相关蛋白。Western blot及组织芯片免疫组织化学技术,验证差异蛋白S100A9在鼻咽癌间质和正常鼻咽黏膜组织中的表达水平。结果建立了鼻咽癌间质和正常鼻咽间质的2-DE图谱,高通量筛选与肿瘤发生相关的间质蛋白,质谱鉴定得到60个差异蛋白。Western blot及免疫组织化学技术验证结果与蛋白质组学结果一致。结论这些差异表达的蛋白将有助于揭示鼻咽癌细胞和周围间质的关系。对间质蛋白功能的进一步研究,将有助于解析间质在肿瘤发生发展中的作用机制,从间质途径寻找肿瘤治疗的靶标。     

应用激光捕获显微切割和蛋白质组学技术筛选鼻咽癌的差异表达蛋白质

目的:筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的差异表达蛋白质,为寻找NPC的分子标志物提供科学依据. 方法:采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)分别从NPC组织和正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngeal epithelial tissue,NNET)中纯化NPC细胞和正常鼻咽上皮细胞(normal nasopharyngeal epithelial cells,NNEC),应用二维凝胶电泳(2-DE)分离LCM 纯化细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western 印迹和组织芯片(tissue microarray,TMA)免疫组织化学验证差异蛋白鳞状细胞癌抗原1(SCCA1)在两种组织中的表达水平.结果:建立了LCM 纯化的NPC细胞和NNEC的2-DE图谱,质谱鉴定了36个差异蛋白质,其中20个蛋白只在NPC表达或表达上调,16个蛋白在NPC中表达下调或缺失. Western 印迹和组织芯片免疫组织化学结果显示:SCCA1在NPC中的表达水平较NNET明显下调,与比较蛋白质组学结果一致.结论:36个差异蛋白可能与NPC的发病有关,为筛选NPC分子标志物奠定了基础.     

鼻咽癌候选侵袭和转移相关基因的筛选

目的筛选影响鼻咽癌侵袭和转移能力的相关基因。方法利用cDNA基因芯片,比较高转移鼻咽癌细胞株5_8F和非转移鼻咽癌细胞株6-10B之间的差异表达基因,并利用在线Milano程序筛选鼻咽癌侵袭和转移相关基因,GOstat分析这些基因功能,最后荧光定量PCR鉴定差异表达基因。结果芯片分析结果显示,鼻咽癌细胞株5—8F与6-10B之间共有200多个差异表达基因。基于Milano程序分析后,发现与侵袭和转移能力相关的基因有33个,其中27个上调,6个下调。GOstat分析显示,这些基因参与了细胞移动、调节凋亡、细胞黏附等。结论经在线Milano程序分析鉴定的鼻咽癌5—8F和6-10B细胞株之间的这33个差异表达基因可能参与了鼻咽癌的侵袭和转移。     

鼻咽癌中ABC转运蛋白基因表达的研究

目的 探讨10种耐药相关的ABC转运蛋白在鼻咽癌组织中的表达及意义.方法 采用实时荧光定量PCR,检测10种耐药相关的ABC转运蛋白在25例鼻咽癌组织中的表达水平,并与其在正常鼻咽组织中的表达进行比较分析.结果 10种耐药相关的ABC转运蛋白在鼻咽癌组织中均有不同程度的表达,其中ABCA2、ABCC3在鼻咽癌组织及鼻咽正常组织中均高表达;ABCC1、ABCC5及ABCG2在鼻咽癌组织中的表达高于其在正常鼻咽组织中的表达.并有统计学差异;而ABCB1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC6及ABCC11在两类样本中均为低表达.结论 在鼻咽组织中高表达的转运蛋白与鼻咽癌的天然耐药性有关;在鼻咽癌组织中高表达,而在正常鼻咽组织中表达显著降低的ABC转运蛋白很可能在鼻咽癌对化疗的耐药中起着重要作用,在鼻咽癌组织及正常鼻咽组织中均低表达的转运蛋白的转运药物则可能是鼻咽癌化疗的敏感药物.     

LKB1及VEGF-C在鼻咽癌中的表达及意义

目的：探讨LKB1及血管内皮生长因子C（VEGF- C）在鼻咽癌中的表达情况及意义。方法选取鼻咽癌患者50例（观察组）,另择同期鼻咽黏膜慢性炎症患者50例作为对照组。采用RT- PCR法检测两组患者LKB1及VEGF- C mRNA的表达情况,并分析鼻咽癌组织中LKB1及VEGF- C mRNA的表达与临床病理因素（年龄、淋巴结转移、临床分期、肿瘤大小）的关系。结果观察组患者LKB1 mRNA的表达水平明显低于对照组,VEGF- C mRNA的表达水平明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。LKB1及VEGF- C mRNA的表达与淋巴结转移及TNM分期明显相关（均P＜0.05）,而与年龄及肿瘤大小无明显相关性（均P＞0.05）。鼻咽癌组织中LKB1与VEGF- C的表达呈负相关（r=-0.62,P＜0.05）。结论鼻咽癌组织中LKB1与VEGF- C的表达呈负相关, LKB1的低表达及VEGF- C的高表达可能与鼻咽癌的发生、发展及淋巴结转移有关。     

鼻咽癌同期放化疗抵抗细胞株与母细胞株lncRNA的差异表达谱分析

  目的  分析鼻咽癌同期放化疗抵抗细胞株与亲本细胞株间差异表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），探索lncRNA在鼻咽癌同期放化疗抵抗中可能发挥的作用。  方法  体外构建鼻咽癌CEN1和CNE2细胞同期放化疗抵抗模型，诱导鼻咽癌细胞同期放化疗抵抗细胞株CEN1CRR和CNE2CRR，应用高通量测序筛选2组细胞株间差异表达的lncRNAs，对差异表达的lncRNAs的靶基因进行GO和KEGG分析。  结果  以Log2FC > 1或 < -1，FDR < 0.05为差异表达标准，和CNE1相比，CNE1CRR差异表达的lncRNAs2746个（358个上调，2063 个下调）；和CNE2相比，CNE2CRR差异表达的lncRNAs3475个（265个上调，520个下调）；此外，387个lncRNAs在CNE1CRR和CNE2CRR中表达同时下调，49个lncRNAs在CNE1CRR和CNE2CRR中同时上调。在GO分析中发现，2组细胞中差异表达lncRNAs的靶基因在生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞成分（cellular component，CC）等方面均有参与。在KEGG分析结果中发现，CNE1组细胞中，差异lncRNAs的靶基因主要富集的信号通路有细胞凋亡、病毒致癌、代谢途径等。CNE2组细胞中，差异lncRNAs的靶基因主要富集的信号通路有代谢途径（硫辛酸、磷酸戊糖、花生四烯酸、醚脂质）、T细胞受体信号通路、核苷酸切除修复等（P < 0.05）。  结论  同期放化疗抵抗细胞株与亲本细胞株的lncRNA表达谱存在明显差异，这些差异表达的lncRNA可能参与了鼻咽癌的同期放化疗抵抗，并为其机制研究奠定基础。     

鼻咽癌差异表达miRNAs筛选研究

 【目的】应用miRNAs芯片筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达miRNAs，并寻找差异表达miRNAs调控的靶基因，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基础。【方法】运用miRNAs芯片技术筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达miRNAs，同时运用miRNAs特异的引物组对差异表达的miRNAs进行荧光定量RTPCR验证。运用靶基因预测软件并结合全基因组表达谱芯片结果预测差异表达miRNAs可能调控的靶基因，并利用westernblot技术检测预测的靶基因在原代培养的鼻咽癌细胞中的表达。【结果】miRNAs芯片结果显示，鼻咽癌中miR-203、miR-503、miR-424、miR-141和miR-148a表达下调，而miR-25、miR-195和miR-15a表达上调，其差异表达均在2倍以上；荧光定量RTPCR结果与miRNAs芯片的结果较符合；其中miR-203的预测靶基因为CCNG1和SPARC，Western blot结果显示，其在原代培养的鼻咽癌细胞亦高表达。【结论】miR-203、miR-503、miR-424、miR-141、miR-148a、miR-25、miR-195、miR-15a在原代培养的鼻咽癌细胞与正常鼻咽上皮细胞中存在差异表达；CCNG1和SPARC可能是miR-203调控的靶基因，可能参与了鼻咽癌的发生发展。