贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因的生物信息学分析

目的 用生物信息学软件分析贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白的多种蛋白质性质,获取该基因的相关因素.方法 利用Protparam,GOR4,ProtScale,Protfun和NetPhos软件预测和分析贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白的氨基酸组成、理论等电点、结构域、活性位点、卷曲螺旋、疏水性、糖基化位点、磷酸化位点及二级结构.结果 推测贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白分子式为:C1910H3056N508O565S18,理论等电点pI 6.12;并含有一个查尔酮合成酶活性位点:156 - 172( RLmMyQqGCFAGGTvLR).该蛋白含有163个α-螺旋,81个延伸链,145个无规则卷曲,1个N-糖基化位点,1个O-糖基化位点,17个磷酸化位点,包括8个丝氨酸磷酸化位点,8个苏氨酸磷酸化位点和1个酪氨酸磷酸化位点.结论 该蛋白推测是一个疏水性稳定蛋白,属于连接酶.     

高良姜查尔酮合成酶基因的生物信息学和表达分析

目的获取高良姜查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）编码基因cDNA 序列,明确其序列和功能特征 以及在高良姜中的表达模式。方法在前期高良姜转录组测序数据中挖掘CHS 的cDNA 全长及其编码区,利 用生物信息学方法对该基因蛋白的特征和功能进行分析,运用ClustalX1.83 和MEGA4.0 软件进行同源性比对 和系统进化树构建,采用实时荧光定量PCR（qPCR）分析CHS 在高良姜不同组织中的表达差异。结果高良姜 CHS 编码区为1 173 bp,编码391 个氨基酸。其编码蛋白是分子量为94.5 kDa 的亲水性蛋白,不含有信号 肽、转运肽、靶肽和跨膜结构域,具有CHS 保守功能域并归属于CHS 超级家族。CHS 在高良姜不同组织中的 表达模式为：根茎> 茎> 叶。结论成功获得高良姜CHS 序列,并分析其特征和表达模式,可为高良姜黄酮 类有效成分的生物合成研究提供参考。     

红花黄酮醇合成酶基因片段的克隆及表达分析

目的克隆红花花瓣中的黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)基因并研究其在不同开花时期的表达量。方法根据红花花瓣转录组测序结果挑选FLS基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增FLS基因片段并连接到PEASY-T1载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果获得了224 bp的序列,将获得的序列在NCBI上进行Blast比对,该基因与其他物种的FLS基因具有较高的同源性。结论克隆了红花FLS基因中间片段,根据FLS基因片段设计引物,对红花不同品种不同开花时期进行荧光定量PCR分析,红花FLS基因在吉红油姊妹系的盛花期表达量最高。     

何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆何首乌苯甲酮合成酶基因并作序列分析.方法 以何首乌Polygonum multiflorum Thunb.为材料,根据其它植物苯甲酮合成酶(Benzalacetone synthase,BAS)基因cDNA序列的保守区域设计引物,利用RT-PCR和3`-RACE,克隆其基因.结果 从何首乌叶cDNA中克隆出了长度为1 049 bp的基因片段.序列分析表明该片段具有典型的CHS基因家族的结构域,为何首乌的BAS基因片段,命名为PmBAS.将得到的序列提交GenBank,序列号为FJ601686.对获得的PmBAS的氨基酸序列进行比较分析,发现PmBAS不含有Phe215,这种差异可能是CHS与BAS催化不同反应的重要原因之一.何首乌BAS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为蓼科的虎杖和掌叶大黄的同源性较近.结论 对利用基因工程技术促进何首乌蒽醌合成具有重要意义.     

白木香查尔酮合酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因AsCHS1编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析。方法:根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有查尔酮合酶保守结构域的CHS基因序列,采用RT-PCR技术,以不同伤害时间白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列,并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。另外,采用qRT-PCR方法,以组蛋白(histones)为内参对AsCHS1基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。结果:序列分析表明,所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框(opening reading frame,ORF)长为1 194 bp,编码397个氨基酸残基,命名为AsCHS1。qRT-PCR实验证明该基因表达量在伤害后12 h最大,说明该基因能够在早期响应伤害胁迫。结论:白木香AsCHS1基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黄酮合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

罗马洋甘菊吉马烯A合成酶基因的克隆与表达分析

目的从罗马洋甘菊Chamaemelum nobile中克隆萜类化合物合成关键酶吉马烯A合成酶(germacrene A synthase,GAS)cDNA全长,并对其进行生物信息学和组织表达分析。方法基于前期对罗马洋甘菊转录组测序结果,设计特异性引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到GAS的cDNA全长,利用生物信息学手段对其核苷酸和编码的氨基酸序列进行分析,并预测其编码的蛋白质的理化性质和功能。通过实时定量PCR技术(qRT-PCR)检测罗马洋甘菊GAS基因(CnGAS)在罗马洋甘菊不同组织的表达水平。结果扩增得到的罗马洋甘菊吉马烯A合成酶基因的cDNA全长为1 785 bp,命名为CnGAS(GenBank登录号为KU589283),包含1个1 683 bp的开放阅读框(ORF),编码561个氨基酸,预测的相对分子质量和等电点分别为6 470和5.21。CnGAS基因编码的氨基酸序列与其他植物的GAS蛋白高度同源,且含有DDxx D保守序列。系统进化树表明CnGAS基因与菊科植物的GAS基因的亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示CnGAS基因在罗马洋甘菊各组织中均有表达,且花中表达量最高。结论从罗马洋甘菊中克隆得到CnGAS基因,分析了该基因在不同组织中的表达水平,为罗马洋甘菊萜类化合物的生物合成代谢途径的研究奠定了基础。     

穿心莲糖苷水解酶基因ApGH的克隆、生物信息学分析及表达研究

目的 对穿心莲糖苷水解酶（ApGH）基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达和相对表达量分析。方法 取穿心莲新鲜叶片,提取RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA）作为模板,以穿心莲转录组中筛选到的糖苷水解酶ApGH基因开放阅读框（ORF）设计特异性引物,进行聚合酶链式反应（PCR）扩增,经测序后获得的基因序列利用生物信息学软件预测基因编码蛋白特征,构建原核表达载体在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白质,并利用实时荧光定量PCR分析ApGH基因的表达模式。结果 克隆所得ApGH基因的ORF全长1734 bp,编码577个氨基酸（GenBank登录号：OR887606）。ApGH为稳定亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,属于糖苷水解酶家族;系统进化分析表明,ApGH归属于GH1家族。将ApGH基因构建到原核表达载体HIS-MBP-pET28a上,在大肠埃希菌Transetta（DE3）中成功表达出重组蛋白质。实时荧光定量PCR检测结果表明,ApGH基因在叶中表达量最高,茎和根中表达量较低。结论 克隆得到穿心莲ApGH基因并对其蛋白质序列特征进行了系统分析,证明其在大肠埃希菌中成功表达重组蛋白质,且主要在穿心莲叶中表达。研究结果为进一步探索穿心莲糖苷水解酶的催化功能提供了依据。     

白木香倍半萜合成酶As-SesTPS1基因的克隆、生物信息学和表达分析

目的基于前期对白木香Aquilaria sinensis转录组测序结果,从白木香总RNA中克隆白木香倍半萜合成酶基因(As-Ses TPS1),并对其进行生物信息学及表达分析。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从白木香总RNA中获得倍半萜合成酶基因As-Ses TPS1的c DNA全长序列;利用生物信息学手段对该序列进行相似性和同源性分析,并预测其编码蛋白的结构和功能;利用q RT-PCR技术检测该基因在白木香不同样品中的表达水平。结果得到倍半萜合成酶基因As-Ses TPS1,开放阅读框(ORF)全长1 671 bp,编码556个氨基酸,其与多条倍半萜合成酶基因具有较高相似性,并含有RRx8W和DDxx D的保守序列;该基因在白木香的沉香样品中高表达。结论 As-Ses TPS1的克隆及其生物信息学和在白木香不同部位表达差异性分析,为白木香倍半萜生物合成代谢途径的研究奠定基础。     

红花DHDPS基因全长cDNA的克隆及植物表达载体构建

目的克隆红花赖氨酸生物合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase DHDPS)基因的全长c DNA序列,构建植物超表达载体。方法根据红花转录组文库注释信息获得红花DHDPS(CtDHDPS)基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆CtDHDPS基因全长c DNA序列。采用DNA重组技术构建p BASTA-CtDHDPS植物超表达载体。结果分离CtDHDPS基因全长1 309 bp,开放阅读框954 bp,编码317个氨基酸,编码蛋白理论等电点为5.93,相对分子质量约为34 750.79。通过DNA重组技术成功构建了植物超表达载体p BASTA-CtDHDPS。结论获得CtDHDPS基因全长c DNA序列并成功构建植物超表达载体,为阐明CtDHDPS基因的生物学功能及其在红花赖氨酸生物合成途径中作用机制提供科学依据。     

红花光调控信号途径关键基因CtHY5的克隆及表达分析

目的 以药用植物红花Carthamus tinctorius为研究对象,克隆光信号途径关键转录因子HY5基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析,为红花HY5基因的功能研究提供参考。方法 以红花转录数据为参考,设计引物,采用PCR扩增方法从红花中克隆得到HY5的全长cDNA和DNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测编码蛋白的结构与功能,并通过荧光定量PCR方法检测CtHY5基因在红花不同组织及花发育不同时期的表达情况。结果 CtHY5基因的cDNA全长为462 bp,编码153个氨基酸,DNA全长为1941 bp,包含4个外显子和3个内含子。生物信息学分析表明,CtHY5为亲水性蛋白,定位于细胞核中。系统进化树及模体结构分析结果表明CtHY5与来自菊科的刺菜蓟、黄花蒿、薇甘菊、向日葵、莴苣中的HY5进化关系较近。定量分析表明,在白色红花和红色红花中,CtHY5基因均在花中表达量最高,其次为茎和苞片,在根中表达量最低。此外,除了根外,CtHY5基因在白色红花各组织中的表达量要明显高于红色红花。结论 首次从红花中克隆得到了光信号途径关键转录因子CtHY5基因,并研究了该基因在不同花色红花品系中的表达模式,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

红花黄酮醇合酶基因的全长cDNA克隆及植物表达载体的构建

黄酮醇合酶(flavonol synthase,FLS)是黄酮化合物代谢途径中的关键酶之一。本文在红花转录组测序结果中获得中间序列的基础上,采用RT-PCR和RACE技术,从我国传统中药材红花花瓣中克隆到黄酮醇合酶基因的全长c DNA。该基因全长1 201 bp,开放阅读框1 011 bp,编码336个氨基酸。系统进化分析表明,红花FLS基因编码氨基酸与同属菊科植物氨基酸具有一定的同源性,其中与金光菊的亲缘关系最近。通过分子生物学方法,成功构建p BASTA-FLS植物表达载体。为后续研究该基因的生物功能及黄酮化合物合成机制奠定了基础。     

布渣叶查耳酮合酶基因全长cDNA克隆及其表达模式分析

目的克隆布渣叶查耳酮合酶基因(Mp CHS)全长c DNA,并对其在不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式进行分析。方法以布渣叶叶片总RNA逆转录合成c DNA为模板,根据其转录组数据设计特异引物序列,PCR扩增Mp CHS基因全长c DNA,经质粒连接、转化、扩培,挑选阳性克隆测序、分析并构建原核表达载体。同时,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对Mp CHS基因的表达模式进行分析。结果成功克隆得到Mp CHS基因全长c DNA(Gen Bank:KY472608)。生物信息学分析表明其开放阅读框为1 176 bp,编码含391个氨基酸的蛋白,其相对分子质量为42 700,理论等电点6.11,具有CHS家族蛋白3个保守的功能活性位点(165 C、304 H和337 N)和特征多肽标签序列RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。系统进化树分析发现Mp CHS与可可、陆地棉等木本植物的亲缘关系比较近。RT-q PCR结果表明,Mp CHS基因在不同部位均有表达,在叶片中的表达量随着生长过程逐步降低。结论首次克隆得到Mp CHS基因,并分析了Mp CHS基因在布渣叶不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式,为Mp CHS基因的原核表达和功能验证奠定了基础,也为进一步解析布渣叶黄酮类生物合成途径提供了参考。     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

红花ERF1转录因子的克隆及植物表达载体的构建

目的克隆1条红花AP2/ERF家族转录因子编码区序列,并构建植物表达载体。方法在红花转录组测序基础上,利用RT-PCR方法克隆1条红花AP2/ERF家族转录因子编码区序列(Ct ERF1)并进行生物信息学分析,利用ClustalW 1.83软件构建系统进化树,在Ct ERF1基因序列两端引入SpeI和XbaI酶切位点,构建含有35S启动子的植物超表达载体p BASTA-Ct ERF1。结果 CtERF1基因编码297个氨基酸,且具有典型的AP2/ERF基因的功能结构域,含有1个AP2区域,为ERF亚族蛋白,亚细胞定位分析推测其定位在细胞质和细胞核上。系统进化分析表明,Ct ERF1基因编码氨基酸与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与杨树和人参的亲缘关系最近。通过分子生物学方法,成功构建p BASTA-CtERF1植物表达载体。结论成功克隆了1条红花AP2/ERF家族转录因子编码区基因Ct ERF1,并构建了植物表达载体p BASTA-Ct ERF1。     

红花单功能反馈抑制敏感型CtAK1基因克隆、序列分析及表达载体构建

目的分离红花天冬氨酸代谢途径关键酶天冬氨酸激酶(AK)基因的全长cDNA序列,进行植物超表达载体构建。方法根据红花种了转录组文库注释和qRT-PCR鉴定的AK基因核心片段及表达分析数据,采用RACE技术获得红花AK(CtAK)基因的全长cDNA,利用DNA重组技术构建植物超表达载体。结果生物信息学分析表明,CtAK基因全长1 703bp,ORF区为1 626 bp,编码541个氨基酸残基,功能结构域分析推测,该基因可能为单功能反馈抑制敏感植物AK1。通过DNA重组技术成功构建以35 S为启动子和Bar抗性基因并含有叶绿体转运肽的pCAMBIA3301-CTP-AK1植物超表达载体。结论获得CtAK1基因的编码序列并构建植物超表达载体,为进一步研究其生物学功能及其在红花氨基酸代谢调控中的作用机制奠定基础。     

西红花与红花的抗血栓作用研究

目的 比较西红花Crocus sativus水提物与红花Carthamus tinctorius水提物及其主要活性成分的抗血栓作用.方法 SD大鼠随机分为对照组、模型组、西红花酸(50 mg/kg)组、羟基红花黄色素A(50 mg/kg)组、西红花水提物(200 mg/kg)组、红花水提物(700 mg/kg)组和阿司...