宫颈永生化细胞和癌细胞胞膜差异蛋白质组学研究

目的建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞（H8细胞株）和宫颈癌细胞（CaSKi细胞株）胞膜蛋白双向电泳图谱,寻找特征性的差异蛋白点。方法提取两种细胞胞膜蛋白质进行双向凝胶电泳（2-dimensronal gel electrophore-sis,2-DE）,建立电泳图谱,然后筛选出差异点进行基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption/i-onization time-of-flight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF-MS/MS）分析,鉴定出蛋白质。结果获得了分辨率和重复性均较好胞膜蛋白2-DE图谱,并分析找出了13个的差异蛋白点,对其中3个显著差异点进行质谱分析和初步鉴定。结论建立了H8和Caski细胞胞膜蛋白2DE图谱,并初步发现LRC8D、EDAR、MTX1蛋白在宫颈癌前病变和宫颈癌细胞胞膜中存在差异表达,为宫颈癌及癌前病变的诊断及癌变机制提供了帮助。     

宫颈永生化细胞和癌细胞的胞浆差异蛋白组学研究

目的:对HPV-16阳性的H8细胞株(宫颈上皮永生化细胞)和Caski细胞株(宫颈癌细胞)胞浆蛋白进行双向电泳和质谱分析,寻找与宫颈癌相关的特异性差异蛋白质.方法:采用双向凝胶电泳(2-dimensronal gel electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(Matrix-assisted laser,desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF-MS/MS)以及SWISS-PROT数据库,对H8和Caski细胞胞浆蛋白进行比较,找出差异蛋白质.结果:通过对宫颈永生化细胞和癌细胞胞浆蛋白2-DE图谱比较和质谱分析,初步鉴定出6个差异蛋白,它们分别为STK3、TRAF5、SLOOP、IKKb、CDK6、TAF2,其中S100P、IKKb、CDK6、TAF2、TRAF5这5种蛋白质在宫颈癌细胞胞浆中高表达,STK3蛋白质在宫颈癌细胞胞浆中表达缺失.结论:初步发现STK3、TRAF5、SLOOP、IKKb、CDK6、TAF2蛋白质在宫颈癌前病变和宫颈癌细胞胞浆中存在差异表达,通过对其功能的了解研究为宫颈癌前病变向癌转变机制的探讨、特异性肿瘤标志物的寻找提供实验依据.     

M2-PK蛋白在宫颈及癌变组织中的差异表达

目的：筛选、验证肿瘤标志物M2 PK在宫颈及癌变组织中的差异表达。 方法：选择永生化的人宫颈粘膜上皮细胞株H8和人宫颈癌细胞株Caski,采用双向凝胶电泳技术通过比较二者的双向电泳图谱筛选明显差异表达的蛋白质,并行MALDI TOF MS质谱鉴定;Western blot法检测差异蛋白质M2 PK在宫颈及癌变组织中的表达。结果：获得H8和Caski细胞的双向电泳图谱;蛋白M2 PK在Caski细胞中的表达量明显高于H8细胞;M2 PK在宫颈的正常组织、癌前病变组织和癌组织中的表达逐渐增加。结论：筛选出H8细胞和Caski细胞间的差异蛋白M2 PK,M2 PK在宫颈及癌变组织中的表达量不同。     

CyclinE干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和蛋白质组的影响

目的:研究siRNA对HepG2细胞株cyclinE表达的抑制及细胞生长的影响,并用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定转染前后细胞内差异表达的蛋白质.方法:构建质粒表达载体pU6-cyclinE-shRNA,稳定转染肝癌HepG2细胞株,获得HepG2-cyclinEshRNA细胞系,RT-PCR检测cyclinE mRNA表达,MTT测定细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期.裂解、抽提HepG2-cyclinEshRNA细胞和Cl期肝癌HepG2细胞全蛋白,用双向电泳技术进行分离后.用Proxpress2D分析软件对两组细胞全蛋白质表达谱进行差异分析,并应用MALDI-TOF-MS和数据库搜索鉴定差异显著的蛋白点.结果:HepG2-cyclinE-shRNA细胞与转染空质粒HepG2细胞和未转染的HepG2细胞相比,生长速度减慢,出现G0/G1期细胞增多,C2/M和S期细胞减少.双向电泳后软件分析G1期肝癌HepG2细胞株平均检测到435±51(n=3)个蛋白点,HepG2-cyclinEshRNA细胞376±44(n=3)个,匹配分析,筛选出两组间差异6倍及以上且出现频率大于等于50%的蛋白点20个.应用质谱鉴定出角蛋白19、波形蛋白、神经多肽113等8个G1期HepG2细胞高表达蛋白点.结论:在HepG2细胞株中,导入eydinE干扰RNA,可有效抑制cyclinE的表达,进而使细胞增殖减缓,逆转其恶性表型.两组细胞蛋白质谱有明显差异,鉴定出G1期HepG2细胞高表达蛋白点8个,这些蛋白的高表达引起肿瘤的基因修饰异常、分化异常、增殖紊乱,肿瘤侵袭转移.     

宫颈永生化细胞和癌细胞的α、β、γ-微管蛋白比较分析

目的：探讨中心体α、β、γ-微管蛋白在人鳞状上皮宫颈永生化细胞（H8细胞株）和癌细胞（Caski细胞株）的表达差异及其在宫颈癌发生发展过程中的作用。方法：采用免疫细胞化学sP法检测中心体α、β-微管蛋白在人宫颈永生化细胞和癌细胞中的表达差异,提取两株细胞的骨架蛋白并用Western blotting对α、β、γ-微管蛋白的表达水平进行半定量分析。结果：Caski细胞中α、β-微管蛋白表达水平高于H8细胞,差异均有统计学意义（P〈0．05）。半定量分析α、β、γ-微管蛋白,Caski细胞中的表达量高于H8细胞。结论：中心体异常可能是宫颈癌细胞恶性表型的特征之一,以中心体微管蛋白为治疗靶点的研究有着可期待的前景。     

肺癌相关蛋白的筛选与鉴定

目的:应用蛋白质组学方法筛选肺癌相关蛋白,为阐明肺癌发生的分子机制和预后研究提供理论依据. 方法: 收集8例手术切除的新鲜肺癌组织及同一患者手术切缘的癌旁组织,提取可溶性总蛋白. 应用等电聚焦(IEF)电泳和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰凝胶电泳(SDS-PAGE)技术将可溶性总蛋白分离,得到肺癌的蛋白质组分析型双向电泳图谱,经PDQuest凝胶图像分析软件分析后找出差异蛋白点. 胶内酶解差异表达的蛋白点,基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得肽质量指纹图谱(PMF),搜寻蛋白质数据库,并运用生物信息学鉴定蛋白质,分析蛋白的生物学意义和生物学功能,作为肺癌标志物的候选蛋白. 结果: 分别将8例肺癌组织及配对的癌旁组织可溶性总蛋白经过重复3次双向电泳,建立了肺癌组织蛋白质表达谱. 经PDQuest凝胶图像分析软件进行分析后, 12个蛋白质斑点只在肺癌组织有表达;6个蛋白质斑点只在癌旁表达. 对高丰度的肺癌特异表达的蛋白点进行鉴定,结果表明这些特异蛋白分别为钙粒蛋白B,Calgizzarin,载脂蛋白A-I,载脂蛋白E,Ras相关蛋白Rab-14,亲环素. 结论: 建立了人肺癌组织和癌旁组织的双向电泳图谱,为建立相应的蛋白质数据库提供了基础数据;鉴定了钙粒蛋白B等肺癌相关蛋白质,为进一步寻找肺癌蛋白标志物奠定了基础,对阐明肺癌发生的分子机制和预后研究有重要理论意义.     

运用激光捕获显微切割对食管鳞状上皮癌蛋白质组的分析

目的分析食管鳞癌与正常食管上皮细胞蛋白质的表达差异,获取鉴别两者的分子标志物。方法激光捕获显微切割技术分离食管鳞癌和正常食管上皮细胞的纯细胞,双向电泳和质谱的方法检测两者表达的差异蛋白。结果48个差异蛋白点,通过质谱鉴定出20种有意义的蛋白,其中11种蛋白如galectin7、14-3-3proteinε等在食管鳞癌细胞表达明显增高,9种蛋白如MTCBP-1等表达下调。结论激光捕获显微切割可以有效地解决组织异质性的问题;食管鳞癌和正常食管上皮细胞的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,提示食管鳞癌的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果。     

Annexin A2蛋白在人体宫颈组织和鳞癌中及其细胞株中的表达差异

目的 研究Annexin A2蛋白在人体正常宫颈组织及宫颈鳞状细胞癌组织中的表达差异,及人宫颈鳞状上皮永生化细胞株（H8）和人宫颈鳞癌细胞株（Caski）的表达以及临床意义。方法 通过免疫组织化学、Western blot法检测人体正常宫颈组织及宫颈鳞状细胞癌中Annexin A2的表达差异,并体外培养人宫颈鳞状上皮永生化细胞株（H8）和人宫颈鳞癌细胞株（Caski）,检测Annexin A2的表达差异。结果 Annexin A2免疫阳性表达产物在人宫颈鳞状细胞癌中其表达量比较高,呈细颗粒状,主要表达于胞浆和胞膜;Annexin A2蛋白在人宫颈鳞状细胞癌组织中表达上调,高于正常宫颈组织（P<0.05）。Annexin A2蛋白免疫阳性表达产物在人宫颈鳞癌细胞株（Caski）表达量较高,主要位于胞浆,淡黄色细小颗粒,分布均匀;Annexin A2蛋白在人宫颈鳞癌细胞株（Caski）中的表达高于人宫颈鳞状上皮永生化细胞株（H8）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 体内、体外实验结果均显示Annexin A2蛋白在肿瘤组织及细胞中的表达是上调的,可能成为临床研究新的诊断与治疗标记靶点。     

人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620及SW480的差异蛋白质组分析

目的 分析比较人大肠癌不同转移潜能细胞株的差异表达蛋白质图谱,筛选并探讨肿瘤转移相关蛋白与大肠癌发生发展转移的关系。方法 利用双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析离子化-飞行时间-质谱技术,分析高低转移性细胞株SW620和SW480蛋白质图谱的差异表达,查询数据库筛选大肠癌转移相关蛋白质。结果 MalenieⅢ软件分析3次相同条件下的2-DE图谱,结果显示重复性、匹配性较好。SW620检测到(1316±62)个蛋白点,平均匹配率82%;SW480检测到(1332±74)个蛋白点,平均匹配率80%;蛋白点分布以PI4~7、相对分子质量20000~70000范围内最多。两种细胞株25个差异蛋白点(SW62014个、SW48011个)胰酶胶内酶解、质谱分析获得23张肽质量指纹谱;数据库查询结果高度匹配已知蛋白质3个,初步匹配已知蛋白质或片段14个。在这些差异表达的蛋白质中,部分与基因转录、细胞周期、信号转导、细胞凋亡有关,可能参与大肠癌的分化、增殖、侵袭、黏附和转移等多种生物学行为。结论 人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620和SW480的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,提示大肠癌转移过程的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果。     

双向电泳蛋白质组技术在残胃癌组织研究中的应用

目的 探讨双向电泳蛋白质组技术在残胃癌组织研究中的应用效果。方法 选取3对残胃癌及癌旁正常胃黏膜组织,利用双向电泳蛋白质组技术对其进行研究。结果 获得了质量良好的胃癌组织蛋白质组双向电泳图谱。分析之后可得,癌旁组织平均984个蛋白点,残胃癌组织凝胶平均1068个蛋白点。一共有112个差异表达的蛋白点,其中,显著差异(表达差异2倍以上)的蛋白点42个。在这42个蛋白点之中,在残胃癌组织里表达上调的一共有17个点;在残胃癌组织里表达下调的一共有14个点;在残胃癌组织中失表达的一共有8个点;仅在残胃癌组织中表达的一共有3个点。结论 利用双向电泳蛋白质组技术对残胃癌组织进行研究可以获得良好的应用效果。     

印迹基因IGF2与p53在子宫颈鳞癌、子宫颈上皮内瘤变及子宫颈炎中的表达及意义

目的：探讨IGF2与p53在子宫颈鳞癌、子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia, CIN）及子宫颈炎中的表达及意义。方法采用免疫组化EnVision两步法检测IGF2与p53在45例子宫颈炎、126例CIN、47例子宫颈鳞癌组织中的表达,分析其与临床病理参数间的关系。结果子宫颈鳞癌组织中IGF2阳性表达显著高于CIN 及子宫颈炎（P<0.05）;p53阳性表达显著高于CIN 及子宫颈炎（P<0.0001）。子宫颈鳞癌组织中IGF2的阳性表达与浸润深度以及淋巴结转移呈负相关（P<0.05）。结论 IGF2、p53的异常表达与子宫颈鳞癌的发生密切相关。     

HeLa细胞系中核转录因子-kB与Bcl-2的表达

目的:分析宫颈鳞癌HeLa229细胞中核转录因子(NF-KB)的激活状态及其与抗凋亡基因Bcl-2表达的相关性.方法:采用免疫细胞化学法和Western Blot法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中NF-KB亚单位p50和p65及其下游调控基因Bcl-2的蛋白表达,RT-PCR法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中p50和p65 mRNA的表达.EMSA法检测HeLa229细胞核中NF-KB与DNA的结合活性.结果:宫颈鳞癌HeLa229细胞质中NF-KB的亚单位p50和p65均有表达,p50/p65在细胞核中具有较高的DNA结合活性.RT-PCR结果表明,p50和p65的mRNA在细胞质中也存在表达,并且在HeLa229细胞中也检测到Bcl-2蛋白的表达.结论:在宫颈鳞癌HeLa229细胞中存在有NF-KB及其下游基因Bcl-2的表达,提示激活的NF-KB信号通路可能在宫颈鳞癌发生发展及抗凋亡中起重要作用.     

宫颈脱落细胞蜡块在宫颈病变初筛中的作用

目的 探索价格低廉、制片简便且可长期保存的宫颈脱落细胞蜡块制片在宫颈病变初筛中的临床意义。方法 收集宫颈病理诊断与新柏氏液基细胞学技术（thinprep cytologic test, TCT）诊断相符的TCT剩余样本,分为未见上皮内病变或恶性细胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM)、低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)及鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of cervix, SCC)各30例,将同一样本分别进行TCT制片及细胞蜡块制片,H-E染色法、免疫组织化学法（mmunohistochemistry, IHC）分别检测Ki-67、P16INK4的表达,分析细胞蜡块制片对比TCT制片在宫颈病变初筛中的临床意义。结果 宫颈脱落细胞蜡块制作的成功率约90.8%,H-E染色病理阅片满意度不差于TCT制片;IHC检测Ki-67、P16INK4的表达与TCT制片差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 宫颈脱落细胞蜡块制片用于宫颈病变初筛的技术方法具有临床可行性,结合其优势可考虑替代TCT制片在临床推广。     

宫颈液基细胞学上皮病变与宫颈活检的临床病理分析

目的 探讨宫颈液基薄层细胞学检测阳性结果 与组织活检结果 的符合情况,分析其临床应用价值.方法 选取213例细胞学筛查阳性并进一步做组织活检的患者的临床病理资料进行回顾性分析,并分年龄组对比细胞学与活检结果 的符合情况.结果 液基细胞学阳性结果 中ASC-US有85例,ASC-H有19例,LSIL有64例,HSIL有45例.相应宫颈活检结果 中慢性宫颈炎有41例,低级别上皮内瘤变有86例,高级别上皮内瘤变有82例,浸润癌有4例.两者检测宫颈上皮内病变高发年龄为30~49岁,浸润癌发生在50~59岁.结论 液基细胞学检测与宫颈活检有较高的符合率;阴道镜下多点活检有利于早期发现宫颈上皮内瘤变;细胞学发现宫颈上皮内病变者需进一步活检确诊.     

金属硫蛋白在宫颈癌中表达及其意义

目的探讨金属硫蛋白(MT)在宫颈鳞状细胞癌中的表达状况。方法对66例宫颈鳞状细胞癌(CSC)和30例宫颈上皮内瘤样增生(CIN)标本,进行免疫组化检。结果表明 MT在CSC中阳性率为68.18％(45/66),在CIN中阳性率为29.03％(8/30),正常对照组阳性率为8.00％(2/25)。MT表达与癌组织分化程度有关。结论 MT在CSC中有比较高的表达,检测MT对化疗方案制定有指导意义。     

子宫颈鳞癌患者预后影响因素及临床意义

目的分析子宫颈鳞癌Ib-IIa期手术后患者预后影响因素,建立预后预测系统,以探讨其在术后辅助治疗中的作用。方法回顾性分析74例手术治疗的Ib-IIa期宫颈鳞癌患者的临床病理资料,对其预后的因素进行分析。结果74例患者的5年生存率为74.32%,淋巴结转移、深肌层浸润、宫旁组织浸润是影响其预后的独立危险因素(P<0.05)。结论根据预后影响因素,建立预后预测系统有助于指导术后辅助治疗。