二甲双胍对EGF信号通路调节机制的研究

目的:探讨二甲双胍联合表皮生长因子受体(EGFR)信号通路阻断剂对子宫内膜癌细胞增殖的影响及相关的作用机制。方法:选取子宫内膜癌Ishikawa及HEC-1A细胞,CCK-8方法检测二甲双胍联合或者不联合EGFR信号通路抑制剂AG1478对子宫内膜癌细胞增殖的影响。RT-PCR检测二甲双胍对EGFR mRNA的影响。Western blotting检测二甲双胍作用下子宫内膜癌细胞磷酸化EGFR/总EGFR和磷酸化ERK/总ERK水平的变化。结果:1AG1478能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖,二甲双胍能够增强其抑制作用;2二甲双胍抑制EGFR mRNA的表达;3二甲双胍能够抑制EGFR及ERK磷酸化蛋白的表达。结论:二甲双胍能够增强EGFR信号通路阻断剂AG1478对子宫内膜癌的抑制作用;并且二甲双胍可能通过抑制EGFR磷酸化蛋白的表达从而抑制ERK蛋白的磷酸化进而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。     

瘦素对子宫内膜癌细胞增殖的影响

目的探讨瘦素对子宫内膜癌细胞增殖的影响。方法荧光倒置显微镜下观测Ishikawa细胞瘦素相关受体(OBRb)的定位。分别使用0、10、50、100、150 ng/ml浓度梯度的瘦素分别在6、12、24 h 3个时间点对Ishikawa细胞进行干预处理,然后采用MTT比色法测定不同处理组细胞的增殖水平。Ishikawa细胞在使用瘦素进行干预后,同时分别加用STAT3通路阻断剂AG490和ERK1/2通路阻断剂PD98059,采用MTT比色法测定两种通路阻断剂对增殖水平的影响。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测100 ng/ml浓度瘦素处理Ishikawa细胞不同时间点(0、20、40、60 min)STAT3和ERK1/2的蛋白磷酸化水平。结果倒置显微镜在Ishikawa细胞中能够观察到瘦素受体表达。Ishikawa细胞在体外经过瘦素干预后,其增殖水平明显增强,并随着药物剂量升高和处理时间延长而增强。在24 h时间点,Ishikawa细胞在100ng/ml浓度的瘦素刺激下其增殖能力达到最高水平,而100 ng/ml组与150 ng/ml组比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同浓度梯度的STAT3通路阻断剂AG490与ERK1/2通路阻断剂PD98059都能明显下调细胞的增殖水平,并且其抑制作用与药物浓度呈正相关;采用100ng/ml浓度的瘦素处Ishikawa细胞后,STAT3和ERK1/2蛋白磷酸化升高水平与处理时间延长呈正相关。结论瘦素可能通过上调激活STAT3和ERK信号传导通路,进而增强子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖能力。     

ERK1/2通路抑制剂PD98059影响卵巢癌细胞SKOV3增殖、侵袭能力的研究

目的:探讨MAPK/ERK信号传导通路抑制剂PD98059对卵巢癌细胞SKOV3的增殖、侵袭能力的影响。初步探讨阻断MAPK/ERK信号传导通路治疗卵巢癌的可能性。方法:体外培养人上皮性卵巢癌细胞SKOV3,采用CCK-8细胞增殖方法检测卵巢癌细胞SKOV3增殖情况,Western blot检测p-ERK蛋白表达,Transwell细胞侵袭实验检测SKOV3细胞的侵袭能力。结果:CCK-8法显示PD98059在一定范围内能够明显抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖,其作用具有时间依赖性及浓度依赖性,PD98059有效浓度为25μmol/L,在此有效浓度作用下有效时间为24h;Western blot法检测结果显示PD98059能够下调pERK1/2,即抑制ERK1/2磷酸化,从而使得ERK1/2信号传导途径失活;Transwell细胞侵袭实验结果显示PD98059在一定浓度范围内能抑制卵巢癌细胞SKOV3的侵袭与转移能力。结论:PD98059可以通过抑制ERK1/2信号途径,抑制人上皮性卵巢癌SKOV3细胞的增殖、侵袭转移。     

三羟异黄酮对人乳腺癌细胞外调节激酶影响

目的探讨三羟异黄酮（genistein）对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞外调节激酶1/2（ERK1/2）MAPK信号转导通路的影响.方法采用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）比色法分别检测三羟异黄酮以及与ERK1/2上游激酶MEK1/2抑制剂联合作用时对MDA-MB-231增殖的抑制作用;应用Western blot蛋白免疫印记法分别检测ERK1/2总蛋白、c-Jun、c-Fos蛋白的表达.结果 MTT结果显示,与对照组相比,三羟异黄酮作用48h后,细胞存活度随浓度增加而降低,合用MEK1/2抑制剂细胞存活度最低;Western blot分析提示,随三羟异黄酮剂量的增加,ERK1/2、c-Jun、c-Fos蛋白表达增加,但合用抑制剂后蛋白表达降低.结论三羟异黄酮可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,并激活了ERK1/2 MAPK信号转导通路;MEK1/2抑制剂可以抑制三羟异黄酮介导的ERK1/2活化,同时提高三羟异黄酮的肿瘤抑制作用.     

大鼠胃黏膜细胞EGFR通过ERK-1/2信号传导通路激活AP-1

目的 探讨大鼠胃黏膜细胞EGFR活化AP—1的信号传导通路。方法 用EGFR配体TGF—α刺激分离的大鼠胃黏膜细胞。Western blot和EMSA方法检测ERK—1／2信号传导通路的活化程度。结果 1nmol／L TGF—α刺激胃黏膜细胞30min不仅显著诱导AP—1的活性，而且明显激活MEK和ERK—1／2；EGFR特异性抑制剂PD153035或MEK特异性抑制剂PD98059能完全阻断TGF—α诱导的胃黏膜细胞AP—1活化。结论 大鼠胃黏膜细胞EGFR通过ERK—1／2信号传导通路激活AP—1。     

碱性成纤维细胞生长因子对卵巢癌的影响

目的观察Ras-Raf-ERK 1/2途径介导的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对卵巢癌细胞系CAOV3细胞增殖和凋亡影响,探讨bFGF及其信号转导途径与卵巢癌发生发展关系。方法以bFGF和促细胞分裂剂激活性蛋白激酶1(MEK1)抑制剂PD98059处理CAOV3细胞,用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,蛋白印迹(Western blot)检测细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的活性。结果bFGF处理后细胞增殖比明显增加,且与bFGF水平呈剂量依赖关系,bFGF浓度为75 ng/ml时细胞增殖比最高为140%;bFGF使无血清诱导的凋亡细胞比例下降[(33.20±5.32)%~(2.38±3.36)%];bFGF诱导ERK1/2活性增高。PD98059可抑制bFGF的这些作用。结论bFGF通过Ras-Raf-ERK 1/2途径介导,促进卵巢癌CAOV3细胞增殖,抵抗无血清诱导凋亡。在卵巢癌发生发展过程中,bFGF信号传递发挥了重要作用。     

Rapamycin抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路对胃癌MGC-803细胞影响

  目的  初步探讨PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路在胃癌细胞生长中的协同作用。  方法  采用不同浓度的PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路抑制剂rapamycin与PD98059分别单独及联合作用于胃癌细胞SGC-7901。采用CCK8法检测SGC-7901细胞增殖情况;实时荧光定量PCR检测关键基因mRNA的表达;蛋白印迹法（WB）检测相关蛋白的表达;流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化。  结果  Rapamycin（12.5、25、50、100、150、200 nmol/L）与PD98059（25、50、100、200、300、400 μmol/L）单独作用可抑制SGC-7901细胞增殖活性,联合作用也可抑制其活性,且联合组的抑制作用强于单独作用（P < 0.05）。与rapamycin、PD98059单独作用相比,联合组对AKT、mTOR、MEK、ERK基因mRNA表达和p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的抑制作用明显增强（P < 0.05）。联合组阻滞于G0/G1期的细胞比例显著增多,且具有更强的促凋亡作用。  结论  PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路在胃癌细胞生长中具有一定的协同调控作用。     

PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路在胃癌细胞生长中协同作用及机制

目的初步探讨PI3K/Akt/m TOR和MAPK/ERK信号通路在胃癌细胞生长中的协同作用。方法采用不同浓度的PI3K/Akt/m TOR和MAPK/ERK信号通路抑制剂rapamycin与PD98059分别单独及联合作用于胃癌细胞SGC-7901。采用CCK8法检测SGC-7901细胞增殖情况;实时荧光定量PCR检测关键基因m RNA的表达;蛋白印迹法(WB)检测相关蛋白的表达;流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化。结果 Rapamycin(12.5、25、50、100、150、200 nmol/L)与PD98059(25、50、100、200、300、400μmol/L)单独作用可抑制SGC-7901细胞增殖活性,联合作用也可抑制其活性,且联合组的抑制作用强于单独作用(P0.05)。与rapamycin、PD98059单独作用相比,联合组对AKT、m TOR、MEK、ERK基因m RNA表达和p-AKT、p-m TOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的抑制作用明显增强(P0.05)。联合组阻滞于G0/G1期的细胞比例显著增多,且具有更强的促凋亡作用。结论 PI3K/Akt/m TOR和MAPK/ERK信号通路在胃癌细胞生长中具有一定的协同调控作用。     

青石棉诱导BEAS-2B细胞ERK1/2磷酸化表达的研究

目的 了解青石棉在致癌过程中引起信号转导蛋白变化的特点.方法 使用人呼吸道上皮细胞株（human bronchial epithelial cell line,BEAS-2B）体外培养,以终浓度100 μg/ml的青石棉和100nmoL/L表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）分别刺激BEAS-2B细胞30和120min,使用特异性抗磷酸化细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK1/2）、ERK激酶（ERK kinase,MEK1/2）和抗总ERK1/2、MEK1/2抗体进行Western免疫印迹,检测相应的蛋白表达水平.结果 青石棉刺激BEAS-2B细胞30 min后,可诱导磷酸化ERK1/2的快速高表达,且此高表达可持续至120 min,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;EGF作为诱导磷酸化ERK1/2的阳性刺激物,在30和120 min两时段内均可诱导ERK1/2的激活,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;任何时间段刺激BEAS-2B,在对照、青石棉和EGF组间,总ERK1/2表达差异无统计学意义（P＞0.05）.青石棉刺激BEAS-2B细胞30、120 min后,可诱导磷酸化MEK1/2的快速高表达,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 青石棉可快速诱导BEAS细胞产生磷酸化ERK1/2、MEK1/2蛋白的高表达,提示MAPKs参与了青石棉所致疾病的过程.     

大鼠子宫内膜异位症的细胞外信号调节激酶信号通路参与机制及来曲唑的改善作用

目的分析大鼠子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路参与机制及来曲唑的改善作用。方法将40只雌性SD大鼠随机分为4组,每组10只,即假手术(Sham)组、子宫内膜异位症模型(EMs)组、PD98059(PD)组及来曲唑(LE)组。自体移植法手术建立EMs模型,PD98059组及来曲唑组进行对应灌胃治疗。采用Western Blotting分析各组大鼠异位组织中ERK信号通路的关键蛋白甲基乙基酮(Methyl Ethyl Ketone,MEK)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、p MEK(extracellular regulated protein kinase)及p ERK1/2蛋白的表达及参与细胞外基质重构的基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP2)及细胞凋亡蛋白Caspase3的表达。结果 EMs模型大鼠的ERK信号通路关键蛋白MEK、p MEK、ERK1/2及p ERK1/2的表达均增高(分别为123.6%、136.4%、144.7%、141.2%);MMP2及Caspase3的表达增强(分别为187.6%、134.7%);来曲唑组大鼠的上述蛋白的异常表达得到显著恢复,且较子宫内膜异位症模型组降低(P0.05)。结论激活的ERK信号通路及其所诱导的细胞外基质重构和细胞凋亡参与了大鼠EMs的发生过程,来曲唑通过抑制激活的ERK通路改善EMs的异常。     

氟对大鼠脑组织α7尼古丁受体和ERK1/2影响

目的 研究氟对α7神经型尼古丁受体和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)通路的影响。方法 SD大鼠随机分为3组,即对照组、低剂量染氟组、高剂量染氟组;实验6个月后,取大鼠脑组织,用蛋白印迹方法及实时荧光定量PCR方法分别检测尼古丁受体α7亚单位、ERK1/2激酶蛋白和mRNA表达。结果 染氟大鼠脑组织中尼古丁受体α7亚单位蛋白表达降低[对照组(100±11.45)%,低剂量染氟组(45.2±9.2)%,高剂量染氟组(29.6±7.6)%];phospho-ERK1/2和total-ERK1/2蛋白表达升高[对照组(100.0±9.6)%、(100.0±11.7)%,低剂量染氟组(125.4±9.6)%、(132.9±2.1)%,高剂量染氟组(175.3±12.4)%、(207.4±7.4)%];染氟组ERK1/2活化率降低[对照组(100.0±12.2)%,低剂量染氟组(82.9±4.9)%,高剂量染氟组(65.9±3.7)%];染氟组尼古丁受体α7亚单位和ERK1/2 mRNA表达水平无明显改变;ERK1/2活化率与尼古丁受体α7亚单位蛋白表达呈正相关(r=0.696,P<0.05)。结论 慢性氟中毒引起的脑组织ERK1/2信号通路改变可能与神经型尼古丁受体表达水平降低有关。     

燃煤型氟中毒大鼠智力与脑ERK1/2表达关系

目的探讨燃煤型氟中毒大鼠智力变化及其发生机制。方法复制燃煤型氟中毒大鼠模型,用Morris水迷宫检测大鼠行为学改变;蛋白印迹及实时荧光定量PCR检测信号转导系统细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)表达水平。结果高、低氟组大鼠逃避潜伏时间分别为(14.44±10.18)和(11.64±7.08)s,较对照组明显延长(P0.05);氟中毒大鼠第7 d穿台次数及逗留平台相限时间均较对照组减少(P0.05);染氟组大鼠脑组织中ERK1/2磷酸化蛋白较对照组升高1.5~2.3倍(P0.05),mRNA表达水平较对照组升高2.0~3.5倍(P0.05),呈剂量-效应关系。结论燃煤型氟中毒可引起大鼠学习、记忆能力降低,其机制可能与脑组织中ERK/MAPK信号转导通路的激活有关。     

慢性铝暴露对大鼠不同组织中ERK1/2蛋白表达的影响

目的 通过观察慢性铝暴露后大鼠学习记忆行为、肝脏、肾脏、和大脑皮层ERK 1/2含量变化,探讨铝暴露对机体毒性的产生机制,并为治疗铝中毒提供实验依据.方法 大鼠自由饮用不同剂量AlC13水溶液(0.2％、0.4％和0.6％)3个月,实行慢性铝暴露,蛋白免疫印迹( Westem-Blot)方法测定各组细胞外信号调节激酶(ERK 1/2)活力及含量变化.结果 与对照组相比较,各个铝暴露组ERK 1/2表达比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 铝暴露可对大鼠身体内重要脏器组织中关键蛋白ERK 1/2产生影响,这可能是铝霉性产生的机制之一.     

女性生殖系统横纹肌肉瘤中C-myc和ERK1表达特征及相关性的初步探讨

[目的]研究横纹肌肉瘤组织中ERK1和C-myc的表达特征及其相关性.[方法]采用免疫组化SP法,对17例女性生殖系统横纹肌肉瘤石蜡标本中ERK1和C-myc的表达进行检测.[结果]C-myc在横纹肌肉瘤组织中高表达率为70.59%;在组织学分级Ⅲ级的肿瘤中C-myc的高表达率为71.43%,Ⅰ级为33.33%（P＜0.05）.ERK1在横纹肌肉瘤中呈现低表达,低表达率为29.41%,与正常横纹肌组织低表达差异无统计学意义.横纹肌肉瘤中C-myc与ERK1的表达无相关性（P＞0.05）.[结论]C-myc在横纹肌肉瘤中普遍高表达,并与肿瘤组织学分级和预后相关;在横纹肌肉瘤中,C-myc的表达可能不依赖Ras-MAPK途径调控.     

DHA诱导3T3-L1前脂肪细胞G2/M期阻滞及ERK1/2通路的作用

目的探讨ERK1/2丝裂素活化蛋白激酶信号转导途径在DHA抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖中的作用。方法四唑盐比色法(MTT法)检测DHA处理24h对体外培养的3T3-L1前脂肪细胞活力的影响,流式细胞术检测细胞周期,蛋白免疫印迹法检测ERK1/2、p-ERK1/2、p21水平。结果 MTT结果显示DHA干预24h可剂量依赖性降低3T3-L1前脂肪细胞的活力,抑制增殖,IC50为100μmol/L;流式细胞术结果表明,DHA可将3T3-L1前脂肪细胞阻滞在G2/M期;蛋白免疫印迹发现,DHA可明显升高3T3-L1前脂肪细胞ERK1/2磷酸化水平、增强p21蛋白表达。结论 DHA可能通过活化ERK1/2通路诱导G2/M期阻滞,进而抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖。     

细胞外信号调节激酶1/2表达与HPV16感染及其交互效应在子宫颈癌变中的作用

目的 探讨细胞外信号调节激酶（p-ERK）1/2表达与HPV16感染在子宫颈癌变中的作用及其交互效应。方法 选取2013年9月至2014年3月在山西省肿瘤医院、山西省妇幼保健院、山西省晋煤集团总医院经组织病理学确诊的正常子宫颈（NC）女性34例、低度子宫颈上皮内瘤变（CINⅠ）患者26例、高度子宫颈上皮内瘤变（CINⅡ/Ⅲ）患者57例和子宫颈鳞状细胞癌（SCC）患者59例为研究对象。采用调查问卷收集研究对象的人口学特征和子宫颈癌相关因素等资料,并采集子宫颈组织标本。采用PCR法检测HPV16感染状况,应用免疫组化法检测子宫颈组织中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表达情况。同时使用ERK抑制剂U0126对子宫颈癌细胞Siha（HPV16阳性）和C33A（HPV阴性）进行抑制,比较抑制前后细胞的增殖、凋亡情况。结果 随着子宫颈癌变的进展,HPV16感染率（趋势χ²=17.99,P<0.001）和p-ERK1/2的表达率（趋势χ²=10.58,P=0.001）均逐渐升高,HPV16感染与p-ERK1/2蛋白表达在CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ、SCC组中均存在正相加交互作用。细胞实验结果显示,ERK抑制后,Siha和C33A细胞均表现为增殖能力降低（Siha：t=6.863,P<0.001;C33A：t=7.092,P<0.001）、凋亡率增高（Siha：t=-5.201,P=0.006;C33A：t=-4.335,P=0.005）。ERK抑制后HPV16阳性Siha细胞较HPV阴性C33A细胞增殖指数高（t=7.066,P<0.001）、凋亡率低（t=-2.431,P=0.057）。结论 p-ERK1/2高表达和HPV16感染均可增加子宫颈癌变风险,两者在子宫颈癌变中存在正相加交互作用。在子宫颈癌细胞增殖凋亡过程中,ERK1/2的活化可能对HPV16感染细胞的作用更为显著。     

ERK1/2在维生素E琥珀酸酯诱导人胃癌细胞凋亡中的作用

为探讨ERK1 2丝裂素活化蛋白激酶 (MAPK)信号转导途径在维生素E琥珀酸酯 (VES)所诱导的人胃癌SGC 790 1细胞凋亡过程中的作用 ,采用DAPI染色法观察VES诱导细胞凋亡的情况 ,采用WesternBlot法分析VES不同剂量和不同作用时间对ERK1 2磷酸化状态的影响。结果表明 ,VES明显诱导SGC 790 1细胞凋亡 ,2 0 μg mlVES作用 2 4h和 48h后凋亡率分别为 14 .2 %和 89.6%。 5、10、2 0 μg mlVES作用 2 4h时明显降低p ERK蛋白的表达 ;而 2 0 μg mlVES作用于细胞时 ,ERK1 2可瞬时被激活 ,2h时表达下降 ,而后又升高 ,12h达峰值。提示ERK1 2途径可能参与了VES诱导的SGC 790 1细胞凋亡 ,但最终参与调节细胞增殖过程