羟基磷灰石/左旋聚乳酸对人骨髓有核细胞毒性的实验

目的:评价不同浓度羟基磷灰石/左旋聚乳酸与人体骨髓有核细胞复合体体外培养时的细胞毒性及生物相容性。方法:实验于2003-03/05在南方医科大学珠江医院神经外科实验室完成。将自行制备的羟基磷灰石/左旋聚乳酸配制成不同浓度(4,2,1,0.5,0.1g/L)与来自临床志愿者骨髓的人体骨髓有核细胞进行复合体外培养,对照组单纯接种细胞。采用相差显微镜逐日观察细胞生长及与生物材料的附着情况。并采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法于不同培养时间(2,4,6,8d)测定细胞增值率(以酶联仪上570nm处测吸光度值表示),以反映羟基磷灰石/左旋聚乳酸复合材料对骨髓有核细胞的毒性作用。结果:①对照组及不同浓度(4,2,1,0.5,0.1g/L)羟基磷灰石/左旋聚乳酸细胞培养溶液在培养2,4,6,8d时所测得光密度值均比较接近,差异无显著性(F=0.070～0.255,P=0.929～0.996)。②相差显微镜观察细胞增殖形态学变化见骨髓基质细胞与羟基磷灰石/左旋聚乳酸材料复合培养组早期可见培养板内细胞增多,少量细胞向材料移行贴附于材料周边,部分细胞直接贴附于材料表面,随复合培养时间延长,附着的细胞增多,无细胞衰老及异常分裂现象。结论:从形态学观察羟基磷灰石/左旋聚乳酸对人体骨髓有核细胞增殖无明显影响,未见明显细胞毒性。     

新型支架材料羟基磷灰石／聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸复合自体骨髓间充质干细胞修复关节软骨全层缺损

目的：观察自体骨髓间充质干细胞复合新型支架材料羟基磷灰石／聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸修复兔膝关节软骨全层缺损。 方法：实验于2005-03／08在兰州大学骨科研究所完成。①抽取兔骨髓液经过密度梯度离心得到单个核细胞，在经过体外分离培养获得骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞吸附于羟基磷灰石／聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸复合材料上，再移植于兔膝关节全层软骨缺损模型处。②36只健康青紫兰兔被随机分成3组，每组各12只。细胞材料复合物组：将骨髓间充质干细胞与羟基磷灰石／聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸复合物植入双侧股骨髁间窝软骨缺损处；单纯复合材料组：单纯植入羟基磷灰石／聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸；空白对照组：不做任何植入。③分别于术后4，8，12周各处死4只兔子，取材进行大体、组织学及免疫组织化学染色观察。大体及组织学观察结果参照O’driscoll的评分标准进行评分。 结果：36只兔全部进入结果分析。①培养细胞的生物学特性观察：原代培养骨髓细胞7～10d后，多数细胞旋涡状排列。传代6h后细胞开始贴壁，5-7d铺满瓶壁。细胞形态均一呈梭形。②各组兔术后大体观察、股骨组织学检查：细胞材料复合物组术后12周大体评分明显低于单纯复合材料组和空白对照组（修复组织表面结构：0．45&;#177;0．25，1．15&;#177;0．25，2．47&;#177;0．39，P〈0．05；缺损填充深度：0．35&;#177;0．15。1．27&;#177;0．27，2．63&;#177;0．27，P〈0．05；与周围软骨结合情况：0．58&;#177;0．08，1．10&;#177;0．24。1．87&;#177;0．64，P〈0．05）。细胞材料复合物组12周关节软骨表面光滑，光镜下可见已形成正常软骨厚度的软骨层及完整的软骨下骨，与对照组有明显差异。修复组织Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，强度与周围正常软骨无差别。软骨缺损处为透明软骨修复。组织学评分各项（缺损填充深度、与周围软骨结合情况、修复组织表面结构、细胞形态、潮线形成、甲苯胺兰染色）评分均显著低于单纯复合材料组和空白对照组。③各组兔修复组织吸光度值形态分析：修复方法在基质分泌方面优势顺序为：细胞材料复合物组〉单纯复合材料组〉空白对照组。 结论：自体骨髓间充质干细胞复合羟基磷灰石／聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸材料以类透明样软骨组织完整修复缺损，是一种修复软骨缺损的行之有效的方法，羟基磷灰石／聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸可以做为组织工程软骨支架材料。     

三维外消旋聚乳酸／羟基磷灰石材料负载碱性成纤维细胞生长因子修复长骨缺损术

目的：评价羟基磷灰石复合外消旋聚乳酸制备泡沫状材料的体内成骨能力，寻找材料优化机制，探讨碱性成纤维细胞生长因子复合泡沫材料后产生骨诱导的可能性，以得到一种较好的可吸收骨构建材料。 方法：实验于2003—06／2004—02在南方医科大学珠江医院骨科实验室完成。用相同孔径范围150-300μm的三维多孔外消旋聚乳酸、外消旋聚乳酸／碱性成纤维细胞生长因子、外消旋聚乳酸／羟基磷灰石和外消旋聚乳酸／羟基磷灰石／碱性成纤维细胞生长因子材料修复1cm兔桡骨去骨膜缺损，不同时期X射线、组织学及扫描电镜观察骨缺损区骨生成状况。术后8，12周行生物力学测试（三点折弯强度）评价骨生成质量。 结果：12周时外消旋聚乳酸组成骨达75％，外消旋聚乳酸／羟基磷灰石、外消旋聚乳酸／碱性成纤维细胞生长因子和外消旋聚乳酸／羟基磷灰石／碱性成纤维细胞生长因子组成骨达90％，与外消旋聚乳酸组比较差异有显著性意义（P〈0101）。生物力学测定结果表明，12周时单纯外消旋聚乳酸组三点折弯强度（29．83&;#177;3．14）MPa，而外消旋聚乳酸／羟基磷灰石组、外消旋聚乳酸／碱性成纤维细胞生长因子组和外消旋聚乳酸／羟基磷灰石／碱性成纤维细胞生长因子组折弯强度分别为（62．68&;#177;5．56），（47．51&;#177;3．56），（76．35&;#177;4．23）MPa，明显高于外消旋聚乳酸组（F=111．93，P〈0．01）．而外消旋聚乳酸／羟基磷灰石／碱性成纤维细胞生长因子组成骨能力最强。 结论：三维多孔外消旋聚乳酸、外消旋聚乳酸／羟基磷灰石材料能成功承载碱性成纤维细胞生长因子，有效的发挥其诱导成骨的能力，提高生成骨的速度和质量。     

聚乳酸/羟基磷灰石膜与人羊膜基质细胞联合构建骨组织工程细胞/支架复合体

背景：前期研究通过静电纺丝技术获得的聚乳酸/羟基磷灰石膜有利于细胞的贴附和生长。目的：分析电纺聚乳酸/羟基磷灰石膜和人羊膜基质细胞构建骨组织工程细胞/支架复合体的可行性。方法：利用MTT法检测聚乳酸和聚乳酸/羟基磷灰石膜浸提液对人羊膜基质细胞增殖的影响;将第3代人羊膜基质细胞培养于含聚乳酸和聚乳酸/羟基磷灰石膜的成骨诱导培养液中,进行组织学检查及免疫荧光细胞化学染色检测。结果与结论：聚乳酸和聚乳酸/羟基磷灰石膜浸提液对人羊膜基质细胞均无明显细胞毒性。与两种膜材料复合培养后,人羊膜基质细胞细胞增殖明显,可观察到钙化结节的形成,钙化结节处细胞Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶表达阳性,且聚乳酸/羟基磷灰石膜组细胞钙化结节数量及成熟程度优于聚乳酸组。说明电纺聚乳酸/羟基磷灰石膜与人羊膜基质细胞可以共同构建成细胞/支架复合体,具有应用于骨组织工程的潜力。     

低温快速成型亲水改性复合人工骨支架的性能测定

背景：低温快速成型技术具有支架成型可控性、保持材料生物学活性和易于实现支架材料的三维多孔立体结构等优势,被迅速用于骨组织工程支架的制备。目的：采用低温快速成型制备聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石复合支架,并检测其性能。方法：采用低温快速成型设备分别制备聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石与聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石复合支架,通过电镜观察支架超微结构,以介质（乙醇）浸泡法测定支架孔隙率,采用电子试验机检测支架力学性能;将两种支架材料分别与大鼠成骨细胞共培养,培养12 h采用沉淀法检测细胞黏附率,培养1,3,5,7,9,12 d采用CCK-8法检测细胞增殖。结果与结论：两组支架孔径均在理想范围内并具有较高孔隙率,但聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架的孔径波动范围大,孔径均值较聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架小且部分有闭塞现象。聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架的细胞黏附率及表面细胞增殖活性高于聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架（P＜0.05）,力学性能低于聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架（P＜0.05）。表明聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石复合支架具有良好的细胞相容性。     

纳米晶羟基磷灰石/胶原骨与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石，胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨的细胞相容性。设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-09／2006—12在江苏大学医学技术学院完成。材料；纳米晶羟基磷灰石，胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献，受试者对实验内容知情同意。方法：全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞，应用成骨诱导剂（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子）诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨复合培养14d。主要观察指标：通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨上的生长情况。结果：原代培养的骨髓细胞增殖迅速，10～12d左右即可稳定传代，传代细胞7-9d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性，Von Kossa染色阳性，可见钙化的基质沉积，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石／胶原骨共培养模型中，细胞可在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨表面良好贴壁。复合培养8d，分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14d，大量细胞在材料表面和孔隙中生长，细胞之间广泛存在突起连接。结论：纳米晶羟基磷灰石肢原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖，细胞相容性良好。     

兔骨髓基质细胞与陶瓷样异种骨的体外培养实验——兔骨髓基质细胞形态、生长、附着及增殖性能观察

背景：天然异种骨采用适当的理化方法可将其抗原性削弱或消除，且能保留其天然的网状孔隙系统，从而使其结构和组成符合生理要求，可望作为一种骨移植替代材料。目的：采用传代的骨髓基质细胞与陶瓷样异种骨体外复合培养，以了解陶瓷样异种骨对兔骨髓基质细胞形态、生长、附着及增殖的影响。设计：空白对照实验。单位：昆明医学院第一附属医院中心实验室。材料：3个月龄日本大耳白兔5只，体质量1．5-2．0kg，雌雄不限。方法：实验于2003—06／10在昆明医学院第一附属医院中心实验室完成。取市售新鲜猪肋骨经理化处理制备陶瓷样异种骨，采用X射线衍射仪分析证实，其主要成分为羟基磷灰石；经扫描电镜观察证实该材料具有原骨组织的网状孔隙结构系统。取日本大耳白兔5只各抽取骨髓1mL，经PRMI 1640培养液稀释制成骨髓基质细胞悬液，取上层细胞培养。以细胞1&;#215;10^6个／瓶，共接种25mL培养瓶8瓶，按1：1比例传代，并将准备好的陶瓷样异种骨置人培养瓶内，每瓶置5块，共置5瓶，作为实验组．另3瓶（不置陶瓷样异种骨）作为对照组。2周后终止培养，取部分置人材料用于相差显微镜和扫描电镜观察。主要观察指标：相差显微镜和扫描电镜观察陶瓷样异种骨对骨髓基质细胞的形态特征，生长、附着及增殖的影响。结果：①兔骨髓基质细胞活体相差显微观察结果：原代培养：接种后10-14d细胞增殖连接成单层网状结构。传代培养：24h后完全贴壁，实验组与对照组的细胞皆生长良好。实验组陶瓷样异种骨周围的成纤维样细胞排列更密集。②兔骨髓基质细胞扫描电镜观察结果：实验组传代培养2周后可见一些连接呈网状的成纤维样细胞附于陶瓷样异种骨网状孔隙的内壁、孔底及骨小梁表面，细胞多呈梭形、三角形或多角形细胞。结论：陶瓷样异种骨主要成分为羟基磷灰石，且有原骨组织的网状孔隙结构系统．对骨髓基质细胞的形态、生长、附着及增殖均无不良影响，可望与骨髓复合移植修复骨缺损。     

兔骨髓基质干细胞成骨诱导及复合培养的生长状况

目的：研究体外培养的兔骨髓基质干细胞的成骨诱导及复合培养生长状况。方法：体外培养兔骨髓基质干细胞，向成骨细胞方向诱导分化，并接种于三维多孔羟基磷灰石材料上，观察其体外生长状况。结果：体外培养条件下，骨髓基质干细胞容易存活，可向成骨细胞转化，并能在支架材料上贴附生长。结论：骨髓基质干细胞可在体外培养条件下大量增殖，向成骨细胞转化，并能在三维多孔羟基磷灰石材料上贴附生长。     

羟基磷灰石／胶原／聚乳酸三维多孔储存式药物控释载体的制备及其表征

背景：在骨科病的临床治疗中传统的给药方式容易引起血药浓度的较大波动和副作用．而植入式药物载体材料羟基磷灰石的机械性能较差使之难以应用于人体的承重部位，聚乳酸又易降解成酸性产物。研究制备羟基磷灰石／聚乳酸药物载体能仅对病患部位直接持续释放药物同时减少对其他部位的副作用．另外可获得羟基磷灰石和聚乳酸相互补强的功能．并消除组织炎症反应，促进骨组织再生。 目的：观察可吸收靶向式药物控释载体的制备及模拟药物的应用情况。 设计：观察试验 单位：重庆工学院与武汉理工大学。 材料：大白鼠鼠尾及聚乳酸（武汉理工大学生物中心提供），胃蛋白酶（1：10000，Sigma公司），Ca（OH）2．浓磷酸、NaOH．冰醋酸、磷酸盐缓冲液（pH=7．4配制）、1，4-二氧六环．无水乙醇等均为市购分析纯。 方法：实验于2004—05／2006—03在重庆工学院及武汉理工大学完成。①采取酸溶法和碱提纯法制备鼠尾Ⅰ型胶原蛋白，在体外模拟天然骨的生物矿化过程，利用材料的自组装机制合成纳米羟基磷灰石／胶原类骨仿生复合材料，并采用X射线衍射分析和透射电镜观察对材料进行了结构、形貌的表征：②采用热致分相技术将制得的羟基磷灰石／胶原复合材料进一步与聚乳酸复合制备了具备特殊几何形状的三维多孔生物可吸收储存式药物控释载体，同时采用扫描电镜、材料试验机和比重测试法对比下观察孔结构形貌及其力学性能等。③将制得的羟基磷灰石／胶原／聚乳酸药物载体装填模型化合物溴百里酚蓝，在模拟体液中进行体外释放实验研究了其控释特性。 主要观察指标：①羟基磷灰石／胶原类骨仿生复合材料制备后结构、形貌的表征。②羟基磷灰石／胶原／聚乳酸药物载体制备后的性能及制备工艺评估：③模型化     

纳米晶羟基磷灰石与兔骨髓间充质干细胞复合培养回植体内的成骨性能

背景：骨髓间充质干细胞具有自我更新及多向分化的能力，经诱导后能够向成骨细胞分化，与基质材料结合可以具备形态功能良好的骨缺损修复效应。 目的：观察骨髓间充质于细胞与基质材料复合后同体移植修复节段性骨缺损的成骨性能。 设计：开放性实验。 单位：无锡市第三人民医院细胞实验室。 材料：实验于2004—05／2005—03在无锡市第三人民医院细胞实验室完成。选取清洁级6月龄新西兰兔18只，随机数字表法分为细胞支架复合组、单纯支架组、空白对照组，6只／组。支架材料由清华大学材料系生物组提供纳米晶羟基磷灰石胶原材料，具备天然骨微结构特征（组成：羟基磷灰石约57％，胶原约30％，聚乳酸约13％）。 方法：①分离培养兔骨髓间充质干细胞，取生长良好的第2代细胞应用EPICS—ALTRA流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。②支架材料按实验需求切割成6min×6min×4mm大小，^60Co辐照灭菌，使用前DMEM—LG浸润：收集培养两三代的细胞，调整浓度为10^9L^-1，与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养。③各组均建立兔桡骨节段性缺损模型。细胞支架复合组将已备好的复合物采用同体移植的原则嵌入骨缺损中，单纯支架组将空白支架材料嵌入骨缺损中，空白对照组不植入任何材料。各组动物均不作内外固定，严密缝合软组织、皮肤。④扫描电镜下观察各组材料表面结构及细胞附着情况。⑤各组分别于术后4，8，16周行大体观察．组织学分析及X光摄片，了解成骨情况。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定情况。②各组扫描电镜观察结果。③术后各组放射学检测结果。④术后各组大体形态观察结果。⑤术后各组组织学检测结果。 结果：实验选取清洁级新西兰免18只，全部进入结果分析。①原代培养4h后可?