白念珠菌RAS1基因高表达菌株的构建及鉴定

目的：构建白念珠菌RAS1基因高表达菌株pCaEXP?RAS1?CAI4。方法：将白念珠菌RAS1基因的开放阅读框（ ORF）置于高表达载体pCaEXP的启动子MET3之后，构建高表达质粒载体pCaEXP?RAS1。将整合的重组质粒转化进入大肠杆菌DH5α，经扩增后采用质粒抽提试剂盒大量制备pCaEXP?RAS1质粒。单酶切线性化质粒，将线性化的pCaEXP?RAS1经醋酸锂法转化入白念珠菌CAI4细胞内，随后在SD?ura?met?cys选择性培养基获得转化子，构建pCaEXP?RAS1?CAI4菌株。挑取单克隆菌落，经菌落PCR验证阳性转化子，并采用实时定量PCR检验RAS1基因在pCaEXP?RAS1?CAI4菌株的表达水平。结果：酶切及测序鉴定表明高表达质粒载体pCaEXP?RAS1构建成功，实时定量PCR检验转化子RAS1基因在pCaEXP?RAS1?CAI4菌株的表达水平，表明pCaEXP?RAS1?CAI4菌株构建成功。结论：通过高表达质粒载体pCaEXP?RAS1可以成功构建pCaEXP?RAS1?CAI4菌株。     

变异链球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的:构建一个含有抗卡那霉素基因和变异链球菌luxS基因上下游区同源序列的重组质粒,以便以后转化入变异链球菌进行luxS的敲除.方法:设计引物,以质粒pEGFP-N1为模板,进行PCR得到抗卡那霉素的DNA片断,再以变异链球菌的DNA为模板,PCR得到luxS基因上下游序列,最后将这3 段DNA片断分别按顺序插入到pMD19-T载体的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,通过在卡那霉素和氨苄青霉素的培养基进行筛选.结果:kana 基因和luxS基因两侧同源序列成功连入到pMD19-T载体相应酶切位点,酶切、测序结果正确.结论:成功构建变异链球菌luxS基因敲除重组质粒,为将来构建变异链球菌luxS突变株打下基础.     

多药耐药草绿色链球菌LuxS基因同源重组质粒的构建

目的:构建一个含有红霉素抗性基因和多药耐药草绿色链球菌LuxS基因上下游区同源序列的重组质粒,为后续进行LuxS基因敲除实验做准备。方法:设计合成引物,分别以质粒PMG36E、草绿色链球菌DNA为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增得到红霉素抗性基因DNA片断和LuxS基因上下游序列,经双酶切反应插入pUC19质粒的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,氨苄青霉和红霉素培养基筛选。结果:红霉素抗性基因和LuxS基因两侧同源序列成功连入到Puc19质粒相应酶切位点,PCR凝胶电泳、测序结果正确。结论:成功构建多药耐药草绿色链球菌LuxS基因敲除同源重组质粒,为进一步构建LuxS突变株打下基础。     

变形链球菌gcp基因突变菌株的构建及鉴定

目的:构建变形链球菌gcp基因突变菌株,以便研究变形链球菌gcp基因功能。方法:厌氧培养变形链球菌UA159,以前期研究中pMD19T-gcp为模板,PCR扩增gcp基因内部序列,连接自杀载体pVA8912,酶切鉴定;将鉴定正确的质粒转化变形链球菌UA159,挑取阳性克隆,提取基因组DNA,用PCR结合酶切鉴定。结果:发现PCR产物及插入片段大小与预期值相符,表明成功构建了重组质粒pVA8912/gcp;经PCR鉴定:gcp基因失活株基因组中gcp基因内部成功插入了重组载体片段。结论:成功构建了变形链球菌gcp基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础。     

粪肠球菌luxS基因缺陷菌株的构建

目的通过同源重组方法构建粪肠球菌密度感应调控基因luxS基因缺陷突变菌株。方法利用PCR扩增粪肠球菌luxS基因的上、下游片段（up、dn）和红霉素抗性基因片段（erm）,依次采用相应的双酶切反应,将这些片段连接入载体pUC18,以构建目的质粒Puemrd重组载体。采用同源重组方法,将红霉素耐药基因erm置换粪肠球菌基因组中的luxS基因,并在含抗性标记的选择性培养基中筛选出阳性克隆。结果经酶切鉴定,目的质粒各片段插入无误,插入片段的测序报告也显示碱基无错配,成功构建粪肠球菌luxS基因缺陷株。结论本研究成功构建的粪肠球菌luxS基因突变株,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制提供了技术平台。     

构建EIF5 A2基因敲除Cal27细胞株及功能分析

目的运用CRISPR/Cas9技术构建EIF5A2基因敲除Cal27细胞系,观察EIF5A2在口腔鳞状细胞癌增殖与迁移中的作用。方法根据EIF5A2基因结构域,设计2个CRISPR靶向位点,利用pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin构建2个导向RNA(sgRNA)质粒。将sgRNA质粒与pST1374-NLS-flag-linker-Cas9共转染至Cal27细胞中,用嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选,并挑取单克隆。将单克隆细胞的DNA进行目的片段扩增,经凝胶电泳及测序鉴定后筛选出大片段敲除细胞株Cal27-2C5及碱基突变株Cal27-2D1。real time PCR及WesternBlot鉴定两株细胞系中EIF5A2的表达情况。用Transwell实验及CCK8分别检测EIF5A2敲除对Cal27细胞的体外迁移能力及体外增殖能力的影响。结果与对照组相比,Cal27-2C5及Cal27-2D1细胞株中EIF5A2在mRNA水平上表达均明显降低。在蛋白水平上,Cal27-2C5及Cal27-2D1细胞株中EIF5A2蛋白均基本不表达。敲除EIF5A2可明显降低Cal27细胞的体外迁移能力,而对Cal27细胞体外增殖能力没有明显影响。结论成功构建EIF5A2基因敲除Cal27细胞株Cal27-2C5和Cal27-2D1,并初步验证EIF5A2可以影响Cal27细胞的体外迁移能力。     

Design and preparation of cloned DNA fragment from pac gene of Streptococcus mutans

目的 :为克隆构建DNA防龋疫苗制备出表达片段。方法 :酶切电泳鉴定含pac基因的重组质粒 ;用计算机辅助选定pac基因中重要区域并设计引物 ,对其进行PCR扩增 ,酶切电泳鉴定扩增产物。结果 :pPC4 1重组质粒包含pac基因 ;自pac基因中选定的核苷酸序列为模板所扩增的DNA片段为预期目的片段。结论 :对含pac基因重要抗原决定簇区域的成功扩增为构建基因重组防龋疫苗完成了重要的准备工作。     

CRISPR/Cas9系统在腺样囊性癌细胞中编辑纤连蛋白基因EDA片段的研究

目的 利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(associated proteins,Cas)编辑纤连蛋白(fibronectin)基因抑制其可变剪接片段基因外显子A(extra domain A,EDA),并观察对腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)的促肿瘤作用.方法 根据纤连蛋白序列设计两段互补于EDA上游和一段与下游互补的引导RNA (single guide RNA,sgRNA,20 bp),分别连接至PX330质粒的U6启动子下游.质粒转染至ACC细胞系SACC-83,PCR扩增基因组并测序验证其定点敲除EDA结果及效率.质粒转染后的细胞进行稳定株的筛选及鉴定,将筛选后的稳定株作为EDA敲除实验组,SACC-83细胞为对照组,进行CCK-8细胞增殖和Transwell侵袭能力检测,每组实验重复3次.结果 sgRNA连接至PX330质粒U6启动子下游,成功构建了质粒敲除模型;SACC-83的基因组EDA外显子被敲除,敲除效率达70％以上,但纤连蛋白总量未发生明显变化.筛选出3株EDA敲除稳定株(A+C-2、A+C-6、B+C-10),并通过PCR鉴定证实其可靠性.划痕实验中实验组细胞运动速率[A+C-2 (21.67±1.87) μm/h;A+C-6(12.22±2.13) μm/h;B+C-10(20.00±2.56) μm/h]相对对照组[(27.78±3.20) μm/h]降低;增殖实验显示EDA敲除组细胞倍增时间增加[对照组SACC-83 (38.52±4.26)h,实验组A+C-2(62.05±5.80)h,A+C-6(46.32±6.35)h,B+C-10(40.7±3.88)h].结论 在sgRNA的引导下,CRISPR/Cas系统能简洁、高效地敲除细胞基因组中的EDA可变剪接外显子,EDA敲除对肿瘤细胞运动和侵袭有明显抑制作用.     

变形链球菌AI-2活性测定及luxS基因同源重组质粒的构建

目的构建用于转化变形链球菌的luxS基因缺失的同源重组克隆载体。方法利用哈氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170作为报告菌株，对变形链球菌在不同生长时期诱导生物发光的能力进行测定，然后分别PCR扩增变链菌luxS基因上下游片段及质粒PJT10的红霉素抗性基因片段，采用分子克隆技术将基因片段依次双酶切后连接人载体pUC19，构建luxS基因缺失的重组质粒，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞经筛选后，抽提重组质粒，进行酶切鉴定。结果变链菌国际标准株可诱导哈氏弧菌BB170的生物发光现象，提示变链菌中存在AI-2数量感应通路。构建的重组质粒pUCluxKO经PstI-BamHI双酶切，产物电泳在大约1000bp和5000bp处各见一条特异条带；经BamHI—KpnI双酶切，产物电泳在大约1500bp和4500bp处各见一条特异条带；经KpnI—EcoRI双酶切后，产物电泳在大约1000bp和5000bp处各见一条特异条带。结论变链菌luxS基因同源重组质粒构建成功，为进一步通过同源重组法构建变链菌luxS基因缺陷株奠定基础。