姜黄素对口腔鳞癌SCC-25细胞EGFR信号通路表达的影响

目的:探讨姜黄素对口腔鳞癌SCC-25细胞EGFR信号通路表达的影响及其相关的分子机制。方法:不同浓度姜黄素作用细胞24 h,MTT法检测姜黄素对细胞增殖作用的影响,Transwell实验检测EGF和姜黄素共同作用下细胞侵袭能力的变化,Western blot检测姜黄素对SCC-25细胞EGFR活性及下游信号分子(Akt、ERK1/2和STAT3)表达的影响。结果:不同浓度姜黄素作用SCC-25细胞24 h后,均可抑制SCC-25细胞增殖,亦可以抑制EGF诱导的细胞侵袭转移。Western blot结果显示姜黄素对SCC-25细胞总EGFR表达无影响,但可以剂量依赖性抑制SCC-25细胞p-EGFR表达,同时可以剂量依赖性抑制EGFR信号通路下游转录因子Akt、ERK1/2和STAT3磷酸化。结论 :姜黄素可剂量依赖性抑制SCC-25细胞EGFR磷酸化活性及其下游信号通路分子(Akt、ERK1/2、STAT3)的磷酸化。     

山奈酚通过mTORC1信号促进牵张力下小鼠骨髓间充质细胞成骨分化机制研究

目的探讨山奈酚(kaempferol,Kae)对周期性单轴牵张力下小鼠骨髓间充质细胞(bone marrow mes?enchymal cells,BMMCs)成骨分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin com?plex 1,mTORC1)信号通路的作用。方法对体外分离培养的小鼠BMMCs施加形变量10%的单轴动态牵张力,通过细胞毒性试验筛选出合适浓度Kae,并添加工具药pp242改变内源性mTOR信号,在牵张后4 h利用化学比色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性变化、ELISA法检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达量,流式细胞仪检测细胞内钙离子相对含量;利用Western Blot检测内源性mTORC1信号通路主要分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal proteinS6 kinases,S6K)、4E/BP1的磷酸化表达及成骨转录因子Runx2和Osterix的表达变化,qRT?PCR检测上述因子mRNA表达水平。结果10μmol/L Kae对细胞的抑制作用较小,且成骨能力最强。加力结束后4 h,Kae能够有效促进BMMCs成骨分化,ALP表达为(153.04±18.72)U/mg,OCN表达为(1.64±0.25)U,成骨转录因子Runx2、Osterix的mRNA水平和蛋白水平表达上调,细胞内钙离子含量下降,同时mTORC1信号通路中mTOR、S6K mRNA水平及蛋白磷酸化表达上调,4E/BP1 mRNA水平及蛋白磷酸化表达下调;在加入pp242抑制mTORC1信号表达后,mTOR、S6K mRNA水平及蛋白磷酸化表达下调,4E/BP1 mRNA水平及蛋白磷酸化表达上调,BMMCs成骨分化效应显著被抑制,Runx2、Osterix的mRNA水平和蛋白表达显著下调,ALP及OCN表达下调,细胞内钙离子含量增高。结论Kae通过mTORC1信号通路促进牵张力下小鼠BMMCs成骨分化。     

PI3K/Akt/mTOR通路在头颈部鳞状细胞癌中的靶向治疗研究进展

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）在全球最常见的恶性肿瘤中位居第六,晚期患者转移并复发率高,预后较差,为患者家庭和社会经济带来严重损失。靶向药物结合经典放化疗的个性化方案有望提高治疗功效并延长生存期。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）在HNSCC中普遍存在过度激活,是控制肿瘤发生、发展及研发靶向药物的重要通路。本文就PI3K/Akt/mTOR通路应用于HNSCC靶向治疗的个体性差异发生的潜在机制,以及临床试验取得的进展与目前所面临的困境进行探讨,拟为HNSCC的临床靶向治疗提供参考思路,从而提高患者的生存质量。     

雷帕霉素抑制口腔鳞癌细胞增殖及其分子机制研究

目的 通过不同浓度雷帕霉素干预口腔鳞癌细胞系SCC-4的增殖情况，检测雷帕霉素干预后p-AKT、p-STAT3、p-S6K1及免疫因子在SCC-4中的表达，探讨雷帕霉素对口腔鳞癌细胞体外生长的抑制作用及其分子机制。方法 采用20、40、80μmol/L雷帕霉素分别干预体外培养的SCC-4，并设含0μmol/L雷帕霉素的培养液作为对照组，作用24h后，通过MTT检测不同浓度雷帕霉素对于SCC-4增殖的影响；使用Western blotting方法检测雷帕霉素对PI3K/AKT/mTOR信号通路相关相关蛋白（AKT,STAT3,S6K1）磷酸化情况变化；通过酶联免疫吸附法检测雷帕霉素对PI3K/AKT/mTOR信号通路下游共刺激因子B7-H1表达的影响。结果 MTT结果显示雷帕霉素对于SCC-4细胞的抑制效应呈明显的浓度依赖关系；酶联免疫吸附法结果表明雷帕霉素能够降低PI3K/AKT/mTOR信号通路下游相关共刺激分子（B7-H1）的浓度；蛋白免疫印迹结果则表明在雷帕霉素干预下SCC-4细胞的PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白p-AKT,p-STAT3,p-S6K1表达水平明显降低...     

平阳霉素引发细胞凋亡与MAPK信号转导通路的关联性

目的 探讨平阳霉素引发细胞凋亡与分裂原激活的蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路的关联性。方法 采用Western印迹法（western blot)检测分裂原激活蛋白激酶的表达。结果 平阳霉素作用KB细胞，随作用时间延长或药物浓度增加，磷酸化细胞外信号调节激酶的表达越不明显；而p-38MAPK蛋白激酶的表达无明显变化。结论 平阳霉素引发细胞凋亡与分裂原激活的蛋白激酶家族信号转导通路有关。     

mTORC1/2信号通路在肿瘤治疗中的应用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是PI3K-Akt信号传导通路的重要下游蛋白激酶。真核生物的mTOR被体内的生长因子、营养及能量等信号激活后,能加速细胞内蛋白质的合成,为肿瘤细胞的生长提供物质基础,所以mTOR通路是治疗癌症的重要靶点。雷帕霉素（西罗莫司）及其衍生物对mTOR具有特异性抑制作用,在临床上被用于多种癌症的治疗。由于肿瘤的高度异质性和复杂性,一些肿瘤对mTOR抑制剂具有耐药性。因此,充分了解mTOR通路对肿瘤增殖和生存的作用机制,对进一步提高肿瘤疗效具有重要意义。     

PTEN下调FAK磷酸化抑制人舌癌细胞增殖与迁移

目的:观察肿瘤抑制基因PTEN对体外培养的人舌癌细胞系Tca 8113增殖、迁移的影响,并探讨其对细胞中黏着斑激酶(FAK)磷酸化水平的影响.方法:体外培养Tca 8113细胞,以腺病毒为载体将野生型PTEN基因瞬时转染细胞;采用MTT法检测细胞增殖;改良的Boyden双腔系统检测细胞迁移;Western blot方法检测细胞PTEN、FAK及p-FAK的表达变化.结果:PTEN高表达可呈时间依赖性地抑制Tca 8113细胞的增殖、迁移,并可下调FAK 397位点磷酸化水平.结论:PTEN可能通过下调FAK 397位点磷酸化水平抑制Tca 8113细胞的增殖、迁移.     

mTOR调控口腔鳞状细胞癌增殖转移的机制研究

目的：研究Toll样受体4（TOLL-like receptor 4,TLR4）分子高表达与口腔鳞状细胞癌预后的关系,探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通过TLR4信号通路间接调控口腔鳞状细胞癌增殖转移的潜在机制。方法：采用免疫组织化学法检测50例口腔鳞状细胞癌患者病理切片中TLR4的表达;使用mTOR抑制剂(雷帕霉素)作用于口腔鳞状细胞癌细胞系CAL27后,再用LPS激活TLR4信号通路,通过MTT法检测CAL27细胞的增殖能力,Transwell法检测CAL27细胞的迁移能力, Western 免疫印迹检测其对肿瘤细胞中NF-κB 及MAPK信号通路的影响。采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析。结果：TLR4分子高表达与口腔鳞状细胞癌预后差显著相关（P<0.05）;雷帕霉素能够显著抑制TLR4激活后的CAL27细胞的增殖和迁移能力（P<0.01）,显著抑制TLR4下游的NF-κB 及MAPK信号通路（P<0.01）。结论： mTOR通过TLR4信号通路调控口腔鳞状细胞癌的增殖与转移,有望成为治疗口腔鳞状细胞癌的新靶点。     

丝/苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70 S6K信号通路在口腔鳞癌中的表达及临床意义

目的 探讨丝/苏氨酸蛋白激酶（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/p70 S6K信号通路在口腔鳞癌组织中的表达情况,为口腔鳞癌的早期诊断和治疗提供参考。方法 收集口腔鳞癌标本51例,癌旁黏膜组织10例,正常口腔黏膜10例。采用免疫组织化学SP法检测口腔鳞癌、癌旁黏膜组织及正常口腔黏膜中p-Akt、p-mTOR及p70 S6K的表达情况,分析三者相互之间表达的相关性。结果 p-Akt、p-mTOR及p70 S6K在口腔鳞癌组中的表达显著高于正常口腔黏膜组和癌旁黏膜组的表达。p-Akt、p-mTOR及p70 S6K在口腔鳞癌的表达与患者的年龄、性别及临床分期无相关性,但与口腔鳞癌的分化程度及有无淋巴结转移有相关性。p-Akt、p-mTOR及p70 S6K在口腔鳞癌的表达相互之间具有较强的正相关关系。结论 Akt/mTOR/p70 S6K信号通路分子在口腔鳞癌中表达活跃,提示可能与口腔鳞癌的发生发展具有重要的相关性。     

哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白及其底物在口腔鳞状细胞癌中的表达

目的　探讨哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其底物对口腔鳞状细胞癌生长的影响。方法　提取 RNA,通过RT-PCR和Western印迹分析观察mTOR及其底物p70 S6激酶(p70 S6k)的α1、α2、β1、β2不同亚型及起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)在口腔鳞状细胞癌中的表达。结果　RT-PCR与Western印迹的结果一致。随着肿瘤恶性度的提高,mTOR、p70 S6K的表达明显增加,而4EBP1的表达则下降。结论　mTOR及其底物表达水平的强弱与口腔鳞状细胞癌的分化程度密切相关,它可能成为未来癌症治疗的重要靶向蛋白。     

血管内皮生长因子-C表达载体的构建和原核表达

目的　探讨从人舌癌组织中克隆到的血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor,VEGF-C) 片段cDNA表达载体在原核细胞中的功能表达,为进一步研究VEGF-C在口腔鳞癌中表达的意义及与淋巴转移的关系打下基础。方法　以RT-PCR法从舌鳞癌组织中克隆的VEGF-C基因功能片段cDNA与表达载体pBK-CMV构建表达质粒,转化并诱导其在大肠杆菌中的表达,并通过SDS-PAGE及Western-blotting进行检测。结果　从人舌癌组织总RNA中克隆到约1·1 kb大小的VEGF-C基因cDNA,与Genbank公布的人VEGF-C基因cDNA序列有99·6% 同源性,以之构建出的重组质粒pBK-VEGF-C转染大肠杆菌经IPTG诱导后,检测到稳定表达的相对分子质量约 56 000的融合蛋白,该融合蛋白与VEGF-C多抗具有强阳性免疫印迹反应。结论　证实克隆得到VEGF-C基因功能片段cDNA可在原核细胞中成功表达,为进一步研究VEGF-C在口腔癌颈淋巴结转移中的功能效应提供了物质基础。     

牙龈卟啉单胞菌入侵血管内皮细胞的实验研究

目的:体外观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖的影响,观察Pg对HUVEC的入侵能力,从而探讨Pg对内皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)发病机制中的作用提供依据。方法:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1:10,1:100PgATCC33277分别干预HUVEC 4h、8h、12h、24h,未受Pg ATCC33277干预的HUVEC作为阴性对照组,倒置显微镜下观察HUVEC形态,CCK-8法测定HUVEC细胞的增殖情况,透射电镜下观察Pg ATCC33277对HUVEC的入侵情况。结果:在24h内,与对照组相比,受Pg ATCC33277感染的HUVEC的细胞形态未见明显影响,仍呈典型的"铺路石"单层贴壁生长,Pg ATCC33277对HUVEC细胞增殖未见明显影响,透射电镜下观察发现Pg ATCC33277可以黏附HUVEC细胞膜表面,入侵HUVEC,直接定植或以空泡的形式存在于细胞的胞质中。结论:Pg可以入侵内皮细胞,以在细胞内定植的方式逃避宿主的防御反应,内皮细胞的形态和增殖未见明显改变,从而形成第二次慢性感染过程,进一步影响内皮细胞正常功能的发挥。     

Circulating Endothelial Progenitor Cells in Periodontitis

Background: Several biologically plausible mechanisms have been proposed to mediate the association between periodontitis and atherosclerotic vascular disease (AVD), including adverse effects on vascular endothelial function. Circulating endothelial progenitor cells (cEPCs) are known to contribute to vascular repair, but limited data are available regarding the relationship between cEPC levels and periodontitis. The aims of this cross‐sectional study are to investigate the levels of hemangioblastic and monocytic cEPCs in patients with periodontitis and periodontally healthy controls and to associate cEPC levels with the extent and severity of periodontitis. Methods: A total of 112 individuals (56 patients with periodontitis and 56 periodontally healthy controls, aged 26 to 65 years; mean age: 43 years) were enrolled. All participants underwent a full‐mouth periodontal examination and provided a blood sample. Hemangioblastic cEPCs were assessed using flow cytometry, and monocytic cEPCs were identified using immunohistochemistry in cultured peripheral blood mononuclear cells. cEPC levels were analyzed in the entire sample, as well as in a subset of 50 pairs of patients with periodontitis/periodontally healthy controls, matched with respect to age, sex, and menstrual cycle. Results: Levels of hemangioblastic cEPCs were approximately 2.3‐fold higher in patients with periodontitis than periodontally healthy controls, after adjustments for age, sex, physical activity, systolic blood pressure, and body mass index (P = 0.001). A non‐significant trend for higher levels of monocytic cEPCs in periodontitis was also observed. The levels of hemangioblastic cEPCs were positively associated with the extent of bleeding on probing, probing depth, and clinical attachment loss. Hemangioblastic and monocytic cEPC levels were not correlated (Spearman correlation coefficient 0.03, P = 0.77), suggesting that they represent independent populations of progenitor cells. Conclusion: These findings further support the notion that oral infections have extraoral effects and document that periodontitis is associated with a mobilization of EPCs from the bone marrow, apparently in response to systemic inflammation and endothelial injury.     

血管内皮祖细胞在构建组织工程骨中的研究进展

<正>组织工程骨将种子细胞与支架材料进行复合,利用生物技术并加入生长因子,具有取材方便、可塑性强、组织相容性好、快速修复缺损等特性,在临床上有广泛的应用前景。但是体外构建的组织工程骨移植入体内后,如果仅依靠周围渗透的组织液只能够营养100μm以内的细胞[1]。植入的种子细胞吸取营养物质(如氧气、葡萄糖、氨基酸等)和清除代谢产物(如二氧化碳、尿素和乳酸)的能力有限,中央的细胞供血和供氧不足,就会出现成骨不良或成     

人淋巴管内皮细胞的分离和鉴定

目的:分离培养人淋巴管内皮细胞(LECs),为研究淋巴管新生在淋巴管瘤复发及肿瘤淋巴结转移中的作用奠定基础。方法:HE染色和免疫组织化学法了解人淋巴管瘤的组织病理特征;胶原酶消化法从淋巴管瘤组织中分离淋巴管内皮细胞;光镜和透射电镜观察淋巴管内皮细胞的形态和超微结构;MTT法检测细胞体外增殖。结果:HE染色显示舌淋巴管瘤中具有大量扩张的管腔,免疫组织化学染色显示管腔内皮细胞表达FLT-4、和LYVE-1;体外培养的淋巴管内皮细胞呈"铺路石"样外观;在透射电子显微镜下,观察到淋巴管内皮细胞特征性细胞器如weibel-palade小体、胞质小突和质膜小泡;MTT结果显示细胞于第3天开始进入增殖活跃期,第5天进入高峰期,第6、7天进入平台期;在Ⅰ型胶原凝胶中细胞形成管腔样结构。结论:应用胶原酶消化法可以有效的从淋巴管瘤组织中分离得到淋巴管内皮细胞。     

In Vitro Analysis of Human Periodontal Microvascular Endothelial Cells

Background: Endothelial cells (ECs) participate in key aspects of vascular biology, such as maintenance of capillary permeability, initiation of coagulation, and regulation of inflammation. According to previous reports, ECs have revealed highly specific characteristics depending on the organs and tissues. However, some reports have described the characteristics of the capillaries formed by human periodontal ECs. Therefore, the aim of the present study is to examine the functional characteristics of the periodontal microvascular ECs in vitro. Methods: Human periodontal ligament‐endothelial cells (HPDL‐ECs) and human gingiva‐endothelial cells (HG‐ECs) were isolated by immunoprecipitation with magnetic beads conjugated to a monoclonal anti‐CD31 antibody. The isolated HPDL‐ECs and HG‐ECs were characterized to definitively demonstrate that these cell cultures represented pure ECs. Human umbilical‐vein ECs and human dermal microvascular ECs were used for comparison. These cells were compared according to the proliferation potential, the formation of capillary‐like tubes, the transendothelial electric resistance (TEER), and the expression of tight junction proteins. Results: HPDL‐ECs and HG‐ECs with characteristic cobblestone monolayer morphology were obtained, as determined by light microscopy at confluence. Furthermore, the HPDL‐ECs and HG‐ECs expressed the EC markers platelet endothelial cell adhesion molecule‐1 (also known as CD31), von Willebrand factor, and Ulex europaeus agglutinin 1, and the cells stained strongly positive for CD31 and CD309. In addition, the HPDL‐ECs and HG‐ECs were observed to form capillary‐like tubes, and they demonstrated uptake of acetylated low‐density lipoprotein. Functional analyses of the HPDL‐ECs and HG‐ECs showed that, compared to the control cells, tube formation persisted for only a brief period of time, and TEER was substantially reduced at confluence. Furthermore, the cells exhibited delocalization of zonula occludens‐1 and occludin at cell–cell contact sites. Conclusions: The present results provide new evidence that HPDL‐ECs and HG‐ECs have characteristics of fenestrated capillaries. Therefore, capillaries in human periodontal tissues have functional characteristics of fenestrated capillaries, which might be related to the onset and the progression of systemic diseases and inflammation.     

复合血管内皮细胞的组织工程骨构建

目的:探讨将血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)与成骨细胞(osteoblast,OB)复合后用于血管化组织工程骨预构的可能性。方法:6只日本大耳白兔分为两组,分别在背阔肌下植入(OB+VEC)/外消旋聚乳酸(PDLLA)、OB/PDLLA。术后4、8周处死动物,大体标本、HE染色镜下观察体内成骨与血管化情况,以及血管化与成骨之间关系。结果:OB/PDLLA、(OB+VEC)/PDLLA两组植入物表面均有大量毛细血管肌纤维长入。OB/PDLLA组植入4周后可见骨组织形成,材料周围可见有小血管长入,随时间延长成骨量及血管化程度均有所增加。OB+VEC/PDLLA组可见在支架内部有大量毛细血管形成,支架周围成骨细胞活跃,成骨能力较强,在体内成骨能力及血管化程度均高于单纯成骨细胞复合支架组。结论:复合血管内皮细胞的组织工程骨成骨能力与血管化程度均高于单纯成骨细胞构建的组织工程骨。     

肿瘤相关血管内皮细胞对单核细胞趋化的影响

目的:探究头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociated macrophage,TAM)的来源和极化机制。方法:用HNSCC的条件培养基将血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)诱导为肿瘤相关VEC,使用显微镜观察肿瘤相关VEC的形态,以RT-qPCR检测单核细胞趋化因子在肿瘤相关内皮细胞的表达,Transwell趋化实验检测肿瘤相关内皮细胞对单核细胞的趋化能力。进一步使用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)将人单核细胞(THP-1)诱导为贴壁的巨噬细胞,与肿瘤相关内皮细胞共培养后,qRT-PCR检测巨噬细胞极化相关基因的表达。结果:HNSCC相关VEC形态呈多角形,细胞间连接疏松,排列紊乱,并分泌多种单核细胞趋化因子将单核细胞趋化至肿瘤微环境,同时将其极化为白细胞介素-10(IL-10)、精氨酸酶1(arginase 1,Arg-1)高表达的M2型TAM。结论:在HNSCC中,肿瘤相关VEC招募单核细胞并将其极化为M2型TAM。     

口腔癌血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的初步观察

目的:探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)与口腔癌癌灶微血管密度改变的关系及其在口腔癌发生发展中的作用。方法:化学研究选择抗VEGF单克隆抗体及抗CD34单克隆抗体为第一抗体,对60例口腔癌组织切片标本行免疫组织化学研究。VEGF及CD34的免疫组化方法采用S-P组化染色法。结果:在60例口腔癌中Ñ、Ò、Ó、Ô期 VEGF阳性表达率无显著性差异。颈淋巴结转移组与无颈淋巴结转移组的VEGF表达,经统计学分析有显著性差异。Ô期病例的微血管密度(IMVD)与Ñ、Ò期病例有显著性差异。随着IMVD的提高,其VEGF阳性级别也随之升高,IMVDÑ级与IMVDÔ级的VEGF阳性表达程度有显著性差异(P<0105)。结论:口腔癌中血管内皮细胞生长因子的改变是导致口腔癌癌灶内微血管密度改变的原因之一。     

血管内皮细胞体外培养及生物学特性的探讨

目的　分离培养脐静脉内皮细胞 ,鉴定其生物学特性。方法　采用 0 2 %胰蛋白酶行脐静脉两次酶灌注消化法获取内皮细胞。分别在倒置相差显微镜、透射电镜下观察 ,SP免疫组化法行Ⅷ因子抗原鉴定。观察血管内皮细胞体外培养的生长情况 ,并绘制细胞生长曲线。结果　 (1)经改良的胰蛋白酶两次消化法获取较高的活细胞百分数 ,且细胞纯度较高。 (2 )透射电镜下发现多数细胞间存在紧密连接结构 ,胞膜的一侧贴有基膜样成分。 (3)血管内皮细胞体外培养融合成单层后 ,形成类似体外血管内皮的内衬结构。结论　透射电镜下细胞特征可作为鉴定血管内皮细胞的辅助手段。