混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞与支架材料复合成牙的体内研究

目的:研究经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与骨形态发生蛋白2 (BMP-2)混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内环境中与不同支架材料复合后的成牙潜能。方法:将取自SD大鼠的BMSCs与牙胚细胞在bFGF和BMP-2混合信号诱导的微环境中共培养后分别接种于明胶海绵和3D打印的PVA/DCCP复合支架材料上,然后回植入同种异体大鼠肾被膜下。在回植后的第1、3、7、14、28天采集回植体样本,用实时定量PCR (RT-PCR) 检测各组样本成牙相关基因成釉蛋白 (AMBN)、牙本质基质蛋白1 (DMP1)、Ⅰ型胶原蛋白 (Collagen-Ⅰ)、以及同源异型盒基因1 (DLX1) mRNA水平。结果:各基因在不同时间点的表达量与完整牙胚(E组)均存在统计学差异(P＜0.05);上述4个成牙相关基因的表达水平在不同支架材料组之间具有显著性差异(P＜0.001);不同成牙诱导信号对各个基因的表达水平也有一定影响。结论:在体内模拟环境下,经bFGF与BMP-2混合信号诱导的大鼠BMSCs与3D打印支架材料复合后能提高成牙基因的表达水平,促进牙体组织的形成。优选支架材料并构建合适的组织工程牙模型对实现非牙胚源性细胞向牙源性细胞的转化同样具有重要意义     

bFGF/BMP-2转染大鼠骨髓干细胞体内成牙的研究

目的: 牙胚细胞和成纤维生长因子(Fibroblast growth factor bFGF)/骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2 BMP-2)联合转染的骨髓间充质干细胞 (bone marrow stem cells,BMSCs)混合培养,复合明胶海绵支架构建牙组织工程植入大鼠体内,探究其成牙能力。方法: 取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;明胶海绵组;细胞团块+明胶海绵组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下。术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行大体组织观察,Masson染色和免疫组化染色。结果: 大体组织和Masson染色:术后5、10、14、28 d形态学观察显示细胞团块+明胶海绵组形成牙样组织。免疫组化:析因分析显示细胞团块+明胶海绵组在5、10、14 d DMP-1、BMP-4、DSP表达量最高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论: 牙胚细胞和基因转染BMSCs混合培养,复合明胶海绵构建牙组织工程的体内实验结果形成牙样组织,为组织工程牙的成功构建奠定了一定的基础。     

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/ BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/ BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。     

PVA与成软骨向诱导后骨髓间充质干细胞复合培养的生物学行为研究

目的：探讨PVA对骨髓间充质干细胞软骨向诱导后黏附、增殖及分化的影响情况。方法：将诱导后的BMSCs用DiI荧光标记并与材料复合培养,甲苯胺蓝染色和免疫组化检测Ⅱ型胶原了解BMSCs成软骨分化,荧光显微镜和扫描电镜观察细胞与材料的粘附和增殖情况。结果：BMSCs诱导后甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化阳性,细胞可在支架材料上粘附生长。结论：细胞诱导后在PVA表面的粘附、增殖情况良好,对诱导后的细胞无影响。PVA可作为软骨修复的支架材料。     

骨形成蛋白-2、4在胎鼠牙胚蕾状期的表达

目的:观察生长因子骨形成蛋白-2、4(BMP-2、4)在牙胚蕾状期的表达,探讨二者的作用及其关系,为牙组织工程研究打下基础。方法:选取14 d SD胎鼠下颌第一磨牙牙胚做石蜡切片,HE染色光镜观察证实牙胚处于鼠胚胎第14天蕾状期后,则取其前后2~3张切片用免疫组化LsAB法检测BMP-2、4在鼠牙胚蕾状期的分布与表达。结果:BMP-4在蕾状期牙上皮和牙间质均有表达;BMP-2在牙上皮有表达而在牙间质表达不明显。结论:BMP-2、4在牙胚蕾状期表达模式相似,但BMP-2的表达比BMP-4晚,反映二者作用各有侧重又相互联系。     

非牙源性上皮与牙胚间充质相互作用诱导模式的筛选

目的：筛选非牙源性上皮向牙源性上皮转化过程中上皮-外胚间充质的最佳诱导模式。方法：体外培养并鉴定出生1d的SD仔鼠的牙胚外胚间充质细胞和富含干细胞的皮肤表皮细胞,并建立4种不同的表皮细胞与牙胚外胚间充质细胞间的诱导模式,通过组织学观察比较不同诱导模式所获得的重组体形成牙齿样结构的能力。结果：所采用的4组方案中,只有细胞-材料组和上皮外胚间充质混合细胞团块体内培养组形成了牙齿样结构,尤其是上皮外胚间充质混合细胞团块体内培养组所形成的牙齿样组织中同时含有牙本质和釉质样结构,而其他2组均无牙齿样结构的形成。结论：上皮外胚间充质混合细胞团块体内培养重组法最有利于牙齿组织的形成,是一种理想的研究非牙源性上皮与牙源性外胚间充质相互作用模式的诱导方法。     

胎盘间充质干细胞牙向分化的体外研究

目的探讨胎盘间充质干细胞牙向分化的可能性。方法双酶(胶原酶和胰蛋白酶)消化法获得SD大鼠胎盘间充质干细胞,免疫细胞化学鉴定其表型、成脂成骨诱导鉴定其多向分化能力。SD大鼠胎鼠牙胚细胞条件培养基诱导胎盘间充质干细胞14 d,免疫细胞化学检测DSP和DMP-1,RT-PCR及凝胶电泳检测DSPP和DMP-1基因。结果胎盘间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD31、C34和CD45。成骨和成脂诱导后形成钙结节以及脂滴。牙向诱导后的胎盘间充质干细胞形态无明显改变,表达成牙本质细胞特异性相关蛋白-DMP-1、DSP和特异性基因-DMP-1和DSPP。结论胎盘间充质干细胞具有牙向分化的潜能。     

经典Wnt通路调节骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化

目的:探讨经典Wnt通路在骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用,以期为临床治疗牙髓损伤提供新策略。方法:用牙胚细胞条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化,培养液内分别加入外源性Wnt激活剂Wnt3a/抑制剂DKK-1,检测经典Wnt通路中β-catenin、LEF1、TCF4及成牙本质样细胞特异表达物DSPP、DMP-1变化。结果:骨髓间充质干细胞经Wnt激活剂/抑制剂处理后,胞浆内β-catenin水平明显上升/下降,其下游核内转录因子LEF1、TCF4基因水平明显上升/下降,而细胞内DSPP、DMP-1的表达明显降低/升高。结论:Wnt信号通路抑制骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化。     

BCOR基因敲除促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的研究BCL6共抑制因子-BCOR对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法利用慢病毒载体的BCORshRNA基因敲除BCOR,进行丧失性功能研究。通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨分化相关基因的表达,观察骨髓间充质干细胞体外成骨分化能力。结果BCOR在牙源性间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的表达无明显差异。基因敲除BCOR促进了骨髓间充质干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨分化相关基因骨涎蛋白、骨钙素的表达。结论BCOR基因表达降低能促进骨髓间充质干细胞成骨分化,证实BCOR是骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制基因。     

Notch1蛋白在小鼠下颌切牙发育中的表达

目的探讨Notch1在小鼠下颌切牙牙胚发育过程中的组织学分布。方法制作ICR小鼠下颌切牙不同发育阶段的冰冻组织切片,对小鼠下颌切牙牙胚自牙胚发育起始期至钟状晚期不同发育阶段组织Notch1的分布情况进行免疫组织化学染色。结果 Notch1在小鼠下颌切牙发育蕾状期牙胚的口腔侧上皮中表达,而在和间充质相邻的牙胚上皮中没有表达。从帽状期至钟状期,Notch1在牙胚的中间层表达,而在内釉上皮中没有表达。钟状期的唇侧颈环部位星网状层和部分牙上皮细胞也表达Notch1。此外,Notch1还在牙胚发育不同时期的间充质、牙乳头和早期牙髓中表达。结论 Notch1可能在小鼠下颌切牙发育过程中的牙上皮,特别是内釉上皮的细胞分化,以及牙囊和牙乳头细胞分化及分化完成后的牙髓干细胞的稳定性方面有重要作用。