混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞与支架材料复合成牙的体内研究

目的:研究经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与骨形态发生蛋白2 (BMP-2)混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内环境中与不同支架材料复合后的成牙潜能。方法:将取自SD大鼠的BMSCs与牙胚细胞在bFGF和BMP-2混合信号诱导的微环境中共培养后分别接种于明胶海绵和3D打印的PVA/DCCP复合支架材料上,然后回植入同种异体大鼠肾被膜下。在回植后的第1、3、7、14、28天采集回植体样本,用实时定量PCR (RT-PCR) 检测各组样本成牙相关基因成釉蛋白 (AMBN)、牙本质基质蛋白1 (DMP1)、Ⅰ型胶原蛋白 (Collagen-Ⅰ)、以及同源异型盒基因1 (DLX1) mRNA水平。结果:各基因在不同时间点的表达量与完整牙胚(E组)均存在统计学差异(P＜0.05);上述4个成牙相关基因的表达水平在不同支架材料组之间具有显著性差异(P＜0.001);不同成牙诱导信号对各个基因的表达水平也有一定影响。结论:在体内模拟环境下,经bFGF与BMP-2混合信号诱导的大鼠BMSCs与3D打印支架材料复合后能提高成牙基因的表达水平,促进牙体组织的形成。优选支架材料并构建合适的组织工程牙模型对实现非牙胚源性细胞向牙源性细胞的转化同样具有重要意义     

bFGF/BMP-2转染大鼠骨髓干细胞体内成牙的研究

目的: 牙胚细胞和成纤维生长因子(Fibroblast growth factor bFGF)/骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2 BMP-2)联合转染的骨髓间充质干细胞 (bone marrow stem cells,BMSCs)混合培养,复合明胶海绵支架构建牙组织工程植入大鼠体内,探究其成牙能力。方法: 取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;明胶海绵组;细胞团块+明胶海绵组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下。术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行大体组织观察,Masson染色和免疫组化染色。结果: 大体组织和Masson染色:术后5、10、14、28 d形态学观察显示细胞团块+明胶海绵组形成牙样组织。免疫组化:析因分析显示细胞团块+明胶海绵组在5、10、14 d DMP-1、BMP-4、DSP表达量最高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论: 牙胚细胞和基因转染BMSCs混合培养,复合明胶海绵构建牙组织工程的体内实验结果形成牙样组织,为组织工程牙的成功构建奠定了一定的基础。     

应用细胞片层技术构建功能性组织工程骨的动物实验研究

目的 细胞片层技术与传统的骨组织工程方法相结合构建功能性组织工程骨.方法 密度梯度离心法分离培养犬骨髓基质干细胞(BMSCs);将向成骨细胞诱导后的BMSCs接种至温度反应性培养皿中,37 ℃、5%CO<,2>饱和湿度培养,然后降温至20℃制备BMSCs细胞片层;制备犬脱钙骨基质(DBM)及富血小板血浆(PRP);将D...     

组织工程牙再生发育的研究进展

组织工程牙的再生发育是国内外学者正致力研究的重大课题。本文对近年来国内外组织工程化牙胚、釉质、牙本质牙髓复合体、牙根、牙周膜、牙骨质的相关研究成果做一综述,并对临床修复缺失牙的应用前景做一分析。     

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/ BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/ BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。     

牙再生研究中干细胞的分离、培养和鉴定技术

日趋成熟的成体干细胞体外分离、培养、定向诱导分化和鉴定技术,使牙再生研究取得了显著进展.继牙髓干细胞成功分离培养并用于牙再生研究之后,相继利用牙周膜干细胞、牙囊干细胞、牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞作为牙再生的种子细胞,取得了令人瞩目的 成果.本综述从上述种子细胞的分离、培养、鉴定等方面阐述牙再生研究中的干细胞技术.     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经胶质样细胞的实验研究

目的：观察体外以不同方法诱导的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)分化为神经胶质样细胞，探讨MSCs作为组织工程周围神经种子细胞的可行性。方法：以大鼠MSCs为研究对象，分化学诱导组，共培养诱导组，未经诱导的MSCs作为对照组。通过体外动态观察细胞形态，免疫细胞化学，western blot，RT-PCR等手段对各组诱导后的细胞进行鉴定。结果：形态学观察显示两种诱导过程中的部分MSCs细胞都出现明显的神经胶质细胞的形态，共培养诱导组的MSCs在诱导后仍可继续传代培养，对照组细胞形态无变化。细胞免疫组织化学染色，western blot和RT-PCR结果显示两个诱导组细胞都能够表达神经干细胞标志性抗体(Nestin)、神经胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和S-100抗体。结论：我们推断MSCs很有可能成为TEPN的理想种子细胞来源。     

组织工程骨修复兔下颌骨缺损的实验研究

目的:探讨以兔骨髓基质细胞(BMSCs)为种子细胞、纳米羟基磷灰石/胶原(nHAC)为支架材料、兔自体富血小板血浆(PRP)为生长因子,构建组织工程骨修复兔下颌骨缺损能力。方法:兔下颌骨体部15mm×15mm全层骨缺损分别采取:A组,组织工程骨;B组,自体髂骨;C组,单纯nHAC材料;D组,对照组修复。术后1、3、6个月行放射性核素骨检测、骨密度测定及组织学观察。结果:放射性核素骨检测:术后1、3个月,A、B组成骨代谢能力明显优于C、D组,术后6个月时,各组之间骨代谢能力无明显差异;骨密度测定:A、B、C组骨缺损区域骨密度逐渐增加明显高于D组,术后3个月A组、B组骨密度较C组明显提高;组织学检查:A组术后1个月可见小片状类骨质出现,nHAC开始降解,术后3个月时新生骨成大片状结构,术后6个月nHAC几乎全部降解,缺损由骨组织修复,其成骨量与B组无明显差异却明显大于C组,D组仅为纤维组织修复。结论:本实验构建的组织工程骨修复颌骨缺损能力与自体髂骨相似而强于单独使用nHAC,且nHAC材料于体内可完全降解,因此BMSCs与nHAC及自体PRP复合所构建的组织工程骨是一种良好的骨缺损替代材料。     

组织工程牙周膜细胞片的体内实验研究

目的:探索一种形成组织工程牙周膜的新方法并建立动物模型,为牙周组织工程奠定基础。方法:原代分离培养人牙周膜细胞,部分细胞复合明胶海绵设为对照组;另一部分细胞经特殊条件连续培养成细胞膜片设为实验组。2组实验结果择优复合支架材料后植入裸鼠皮下,4周后取材行组织病理检测。结果:经特殊条件连续培养的牙周膜细胞层叠交错相连形成具有良好的机械加工性能的生物膜片,该膜片经裸鼠体内培养形成牙周膜样组织,并在近羟基磷灰石支架侧有矿化的牙骨质样结构生成。结论:该方法制备的牙周膜细胞片在牙周组织工程具有良好的应用前景。     

BMP-2 and bFGF in an irradiated bone model.

INTRODUCTION: Basic fibroblast growth factor (bFGF) is considered to enhance angiogenesis and to support bone formation in the presence of vital bone cells. Bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) is known to induce bone formation. The aim of this study was to analyze the effect of bFGF and rhBMP-2 in the irradiated mandible. MATERIAL AND METHODS: The right mandibles of 24 rats were irradiated with a single dose of 20 Gy at a high-dose-rate (HDR) after loading machine (bio effective equivalent dose to ca. 45 x 2 Gy). After 12 weeks 100 microg rhBMP-2 (n=6 animals, group 1), 100 microg bFGF (n=6 animals, group 2) and 100 microg rhBMP-2 plus 100 microg bFGF (n=6 animals, group 3) were injected along the right mandible (left mandible: no irradiation, no growth factor). Another 6 animals (group 4) remained untreated after the irradiation. After another 7 weeks the specimens were examined by non-decalcified histology. RESULTS: Bone apposition of the experimental versus control sides was not statistically significantly different when one of the growth factors was applied alone (rhBMP-2: p=0.917; bFGF: p=0.345). Average bone apposition was significantly decreased on the experimental sides of group 3 (rhBMP-2+bFGF: p=0.046) and group 4 (p=0.008). Average bone densities were unaffected in all settings (for all p>0.1). CONCLUSIONS: The application of bFGF and the application of rhBMP-2 alone did result in predictable bone generation in the irradiated mandible with the bone apposition being equal to that of the non-irradiated side. The application of both growth factors together or none at all after irradiation results in significantly reduced bone apposition.     

关于牙齿近中移动的实验研究

目的　通过动物实验对牙齿近中移动的发生机制进行探讨。方法　以五指山系小型猪上下颌第一磨牙为实验对象 ,通过模型测量分析实验牙近中移动情况 ,以二甲酚橙和盐酸四环素作荧光标记进行组织学观察。结果　下颌有、无对实验牙 ,16周移动量分别为 0 14mm和 1 2 1mm ,上颌实验牙 2 4周移动量分别为 1 36mm和 2 0 8mm。实验牙远中牙槽骨可见荧光标记 ;无对实验牙在垂直方向上有牙槽骨改建发生 ;下颌无对实验牙较有对实验牙远中牙槽骨荧光带间距离大 ;近远中牙骨质都有荧光带形成。结论　实验结果不支持越隔纤维作用或磨牙萌出力作用引起牙齿近中移动的观点 ;牙齿近中移动与颌骨内应力分布有关 ,牙槽骨改建的量与牙齿近中移动量呈正相关     

Dynamics of bone tissue formation in tooth extraction sites. An experimental study in dogs

OBJECTIVES: The aim of the present experiment was to study events involved in the healing of marginal, central and apical compartments of an extraction socket, from the formation of a blood clot, to bone tissue formation and remodeling of the newly formed hard tissue. MATERIAL AND METHODS: Nine mongrel dogs were used for the experiment. The fourth mandibular premolars were selected for study and were divided into one mesial and one distal portion. The distal root was removed and the socket with surrounding soft and mineralized tissue was denoted "experimental unit". The dogs were killed 1, 3, 7, 14, 30, 60, 90, 120 and 180 days after the root extractions. Biopsies including the experimental units were demineralized in EDTA, dehydrated in ethanol and embedded in paraffin. Serial sections 7 microm thick were cut in a mesio-distal plane. From each biopsy, three sections representing the central part of the socket were selected for histological examination. Morphometric measurements were performed to determine the volume occupied by different types of tissues in the marginal, central and apical compartments of the extraction socket at different intervals. RESULTS: During the first 3 days of healing, a blood clot was found to occupy most of the extraction site. After seven days this clot was in part replaced with a provisional matrix (PCT). On day 14, the tissue of the socket was comprised of PM and woven bone. On day 30, mineralized bone occupied 88% of the socket volume. This tissue had decreased to 15% on day 180. The portion occupied by bone marrow (BM) in the day 60 specimens was about 75%, but had increased to 85% on day 180. CONCLUSION: The healing of an extraction socket involved a series of events including the formation of a coagulum that was replaced by (i) a provisional connective tissue matrix, (ii) woven bone, and (iii) lamellar bone and BM. During the healing process a hard tissue bridge--cortical bone--formed, which "closed" the socket.     

�����ƶ������й���̬��������-1��Noggin��������֯����о�

目的探讨牙齿移动过程中骨形态发生蛋白（BMP）-1与Noggin在牙周组织中的表达及作用。方法2010年7月至2011年3月在大连医科大学附属第二医院分别建立以大鼠切牙及种植体为支抗的正畸牙齿移动模型,测量磨牙移动距离,用苏木精-伊红（HE）染色观察被移动磨牙牙周组织形态学变化,应用免疫组化方法检测BMP-1与Noggin在牙周组织改建过程中的表达情况。结果以种植体为支抗的正畸牙齿移动模型,其磨牙的移动距离和速度优于以切牙为支抗组。BMP-1与Noggin在牙周组织的分布及表达在空间和时间上具有明显的一致性：均表现为实验组表达明显强于对照组,张力侧表达强于压力侧;二者在牙周组织中的表达水平均在第7天组最强,到第28天组便基本接近对照组的水平。结论以种植体为支抗的正畸牙齿移动模型优于传统方法。BMP-1与Noggin均参与了牙周组织的改建过程,且可能在该过程中发挥重要的调节作用。     

个体化假体复合组织工程技术修复兔下颌骨缺损

目的研究快速成型（RP）技术辅助下制作的个体化假体复合珊瑚羟基磷灰石（CHA）、重组人骨形成蛋白2（rhBMP-2）修复兔下颌骨缺损的成骨效果。 方法以27只新西兰大白兔为实验对象,随机数字表法平均分成3组（每组9只）,全部建立下颌骨连续性缺损模型,并在兔下颌骨缺损区分别植入个体化假体+自体骨（A组）、个体化假体+CHA（B组）、个体化假体+CHA+rhBMP-2（C组）。分别于术后4、12、24周3个时间点处死动物取材,进行大体标本观察,以及骨钙素（OC）、Ⅰ型胶原（COL-1）的免疫组化观察,分别比较各组修复骨缺损的能力,并对实验数据进行重复测量设计资料的单因素方差分析。 结果术后24周各组实验兔外形均对称,通过OC及COL-1的吸光度检测,骨缺损区均有大量新骨形成,A组（0.537 ± 0.010）、C组（0.530 ± 0.010）可见大量骨小梁及编织骨结构,缺损区的新骨OC、COL-1的免疫组化观察基本一致,差异无统计学意义（t = 0.007,P>0.05）;但A组强于B组（0.415 ± 0.009,t = 0.122,P<0.001）;C组也强于B组（t = 0.121,P<0.001）,差异均有统计学意义。 结论在兔下颌骨缺损修复中,通过RP技术和组织工程技术相结合,CHA复合rhBMP-2后成骨能力明显增强,成骨效能肯定,为后期的临床应用提供可靠的实验基础。     

多西环素对大鼠正畸移动牙根吸收影响的研究

目的：建立正畸牙根吸收动物模型,研究多西环素（DOXY）对根吸收组织的影响。方法：选用SD大鼠36只建立正畸牙移动根吸收动物模型,随机分为空白对照组（A组）、注射DOXY对照组（B组）、正常牙加力组（C组）、注射DOXY加力组（D组）。在加力的0、7、10、14 d分别处死各组大鼠。并取相应时段的标本制作组织切片,进行HE染色和TRAP染色,检测多西环素对根吸收组织的影响。用计算机图像分析技术定量比较上述实验结果。结果：①在所有实验周期内（除第14 d）,D组根吸收明显少于C组（P＜0．05）。 D组根吸收的平均值缓慢增加,而C组14 d时显示减少。②C组、D组牙根面的TRAP阳性细胞数均在第10 d到达峰值,第14 d开始下降。然而D组在受力10 d后根面的TRAP阳性细胞数明显少于C组（P＜0．05）。结论：多西环素可能对正畸牙根吸收及破骨细胞的募集有抑制作用。     

An in vivo and in vitro study of dissociated tooth germs of rats

Single-cell suspensions of dissociated rat molar tooth germs were grown in vitro in modified Rose chambers and in vivo in diffusion chambers implanted subcutaneously in host rats. Using phase contrast microscopy and time lapse cinemicrophotography, the cells were observed in vitro to form aggregates consisting of groups of mesenchyme-like and epithelium-like cells. In material from the in vivo study, it was also observed that the dissociated cells re-aggregated to form sheets of epithelial and mesenchymal cells and sometimes to form more organized structures resembling epithelial cell rests of Malassez. Storage of the tooth germs at ?196 °C for 3 weeks prior to trypsinization aided dissociation and appeared to have no deleterious effect on the subsequent viability and behaviour of the stored cells.