ADAM28在成骨样细胞MC3T3-E1中的表达

目的:研究ADAM28在成骨样细胞MC3T3-E1中的表达。方法:采用细胞培养,免疫组化和免疫荧光染色方法检测ADAM28在成骨细胞中可能存在的机制。结果:ADAM28成功表达于小鼠MC3T3-E1成骨样细胞上,免疫组化和免疫荧光检测显示:ADAM28在MC3T3-E1上表达阳性,对照组与实验组间p<0.01,有显著性差异;荧光显微镜下,可见实验组显示较强的绿色荧光,阳性表达明显。结论:ADAM28可能通过参与成骨细胞的生物学活动来促进其细胞的增殖分化。     

PP-1蛋白稳定高表达MC3T3-E1成骨样细胞系的建立

目的建立稳定高表达蛋白质磷酸酶-1(protein phasphatase-1,PP-1)的MC3T3-E1成骨样细胞系。方法采用RT-PCR技术从MC3T3-E1细胞中扩增蛋白质磷酸酶-1(PP-1)基因,将获得的基因定向插入pCI-neo真核表达质粒中,PCR及双酶切鉴定后用脂质体将表达载体转染入MC3T3-E1细胞,经G418加压有限稀释筛选,建立稳定高表达PP-1的MC3T3-E1成骨样细胞系,采用Western blot法检测PP-1的蛋白表达情况。结果 PCR及双酶切鉴定表明表达载体pCI-neo-PP-1构建正确;Western blot检测结果显示PP-1蛋白能在转染pCI-neo-PP-1的MC3T3-E1细胞中稳定高表达。结论成功建立了稳定高表达PP-1的MC3T3-E1成骨样细胞系,为进一步深入研究PP-1在细胞力学信号转导通路中的功能及作用机制奠定了实验基础。     

MC3T3-E1细胞流体剪切力敏感信号通路的基因芯片研究

目的 探讨适宜流体剪切力力值及作用时间下成骨细胞差异表达基因及相关信号通路。方法 通过平行板流室加力装置对盖玻片培养的MC3T3-E1细胞施加流体剪切力,提取总RNA,进行包括44 170个基因的全功能组表达谱基因芯片检测,对差异表达基因进行Pathway和GO分析,并采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）RTPCR）对芯片结果进行验证。结果 芯片结果显示,差异基因共有884个,其中表达增强基因444个,表达降低基因440个。Pathway分析涉及的信号通路,主要包括Notch信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路等。GO分析主要涉及前列腺素的生物合成、一氧化氮介导的信号传导、钙介导的信号及细胞免疫反应等不同的功能分类。结论 流体剪切力对MC3T3-E1细胞的保护作用可能与激活促进细胞生存及抑制细胞凋亡相关信号通路及生物学过程相关。     

不同浓度葡萄糖对MC3T3-E1细胞影响的实验研究

目的：观察不同浓度的葡萄糖对MC3T3-E1细胞增殖、分化及细胞骨架的影响,探讨高糖环境对种植体周围骨结合影响的机制。方法：实验分为5.5mmol/L、8mmol/L、12mmol/L 3组糖浓度。甲基噻唑基四唑（MTT）法测定1d,3d,5d的细胞增殖数;碱性磷酸酶（ALP）活性检测1d,3d,5d,7d的细胞分化情况;茜素红染色观察14d,21d细胞分泌钙结节的情况;激光共聚焦显微镜观察培养后12h的细胞骨架形态。结果：随糖浓度增大,细胞数量、ALP活性、钙结节数目均显著降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;对于细胞骨架,随糖浓度增大,细胞骨架从不规则多角形逐渐向圆形毛刺状转变,肌动蛋白从清晰的网状排列逐渐变得不清晰,且杂乱排列。结论：高糖能显著抑制成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、矿化、及细胞骨架的排列伸展。     

辐照对MC3T3-E1细胞TGF-β1和Smads基因及蛋白表达的影响

目的:探讨放射线对成骨细胞系MC3T3-E1细胞增殖及TGF-β1和Smad3/P-Smad3表达的影响。方法:以小鼠胚胎成骨细胞系MC3T3-E1为研究对象,4MV直线加速器为放射源,给予单一剂量8Gy照射。照射后以CCK-8检测成骨细胞增殖情况,通过荧光定量PCR和Western免疫印迹分别检测TGF-β1、Smad3基因和蛋白的表达,并分别用2-ΔΔct法及光密度分析法分析基因及蛋白的表达水平。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:单次8Gy剂量照射的细胞组与对照组相比,生长速度明显减慢;Smad3及TGF-β1基因在照射后0.5 h,1 h组与对照组无显著差异(P>0.05),照射后1.5 h组Smad3及TGF-β1基因表达量与对照组存在显著差异(P<0.05);P-Smad3、TGF-β1蛋白表达在第1天明显上调;第3天、第5天照射组与对照组差异逐渐减小。8Gy照射后第1天,P-Smad3蛋白表达量最高,TGF-β1蛋白表达量第3天最高。结论:8Gy照射剂量可抑制MC3T3-E1细胞增殖,短时间内上调TGF-β1和Smad3/P-Smad3在基因及蛋白水平的表达。     

P38MAPK信号通路抑制剂SB203580对高糖状态下成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的影响

目的:探讨P38MAPK信号通路抑制剂SB203580对高糖状态下成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的影响。方法:将培养的MC3T3-E1细胞按培养基内含葡萄糖浓度分为5.5 mmol/L正常对照组,25.5 mmol/L高糖组和25.5 mmol/L+SB203580组,观察细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)、矿化结节(AR-S)、成骨相关基因Runx2和OCN mRNA的表达。结果:高糖培养后,MC3T3-E1细胞增殖明显受到抑制(P<0.05)。高糖组的ALP活性光密度值在各个时间点均低于对照组(P<0.05),OCN mRNA,Runx2 mRNA表达随着葡萄糖浓度升高而明显下降,给予SB203580处理后,细胞增殖仍呈下降趋势,OCN、Runx2 mRNA、ALP活性较未加入抑制剂组升高。结论:SB203580可抑制P38MAPK在高糖状态对MC3T3-E1的作用。     

浓缩生长因子提取液对 MC3T3-E1细胞影响的实验研究

目的:探讨浓缩生长因子提取液(CGFe)对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响。方法:实验组和对照组分别使用含有及不含有CGFe的α-MEM培养液培养MC3T3-E1细胞。培养1、3、5 d后MTT法测定细胞增殖,ALP试剂盒检测碱性磷酸酶活性;培养7、14 d后茜素红染色观察钙结节形成;荧光实时定量PCR测定RUNX2和OSX mRNA的表达。结果:随着培养时间延长,实验组的细胞增殖、碱性磷酸酶活性、钙结节数目及基因表达量均高于对照组(P<0.05)。结论:浓缩生长因子提取液能有效地促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化。     

新型根管封闭剂对MC3T3-E1成骨细胞的细胞毒性评估

目的：评估新型根管封闭剂RealSeal sealer、GuttaFlow对MC3T3-E1成骨细胞的细胞毒性,并与传统的AH Plus比较。方法：制备RealSeal sealer、GuttaFlow和AH Plus（固化7d）的材料浸提液,倍比稀释为4种浓度：100%、50%、25%、12.5%;MC3T3-E1细胞于其中分别培养24h和72h,CCK-8法检测细胞存活率,评价不同材料的细胞毒性。结果：在实验期内,RealSeal sealer组的细胞存活率显著低于AH Plus、GuttaFlow（P〈0.05）,AHPlus、GuttaFlow和阴性对照组间无显著差异。结论：在本实验条件下,RealSeal sealer对MC3T3-E1成骨细胞的毒性最强,而GuttaFlow和AH Plus几乎无细胞毒性。     

持续性静压力对成骨样细胞MC3T3-E1生物学特性的影响

目的 :研究持续性静压力对成骨样细胞MC3T3 -E1生物学特性的影响。方法 :利用已建立的细胞体外加力装置 ,给MC3T3 -E1细胞施加 2atm的持续性静压力 ,应用细胞计数 ,生化分析和放射免疫等方法 ,观察受力后不同时间细胞增殖、碱性磷酸酶活性以及骨钙素表达量等方面的变化。结果 :加力组细胞增殖速度减缓 ,实验组和对照组的细胞群体倍增时间分别为 72 .96h和 63 .3 6h ;随着培养时间的延长 ,细胞碱性磷酸酶活性增强 ,但加力组和对照组无明显差异 (P >0 .0 5 ) ;持续性静压力作用 2 4h后 ,与对照组相比 ,加力组骨钙素分泌的增加有显著差异 (P <0 .0 5 )。结论 :一定大小的持续性静压力在抑制MC3T3 -E1细胞生长的同时促进其分化成熟。     

一氧化氮对成骨细胞样细胞系MC3T3-E1的矿化调控

目的：探讨一氧化氮NO（Nitric Oxide，NO）对成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1的增殖和矿化调控作用。方法：给于成骨细胞样细胞浓度为1×10^-3mmol／L的NO外源性供体S亚硝基N乙酰基青霉胺（S—nitroso—N—acetyl—dl—penicillamine，SNAP）3w，通过成骨细胞DNA含量及碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性变化，以检测NO对细胞生长影响，通过VonKossa染色和骨钙素免疫组化方法，以观察成骨细胞合成钙盐情况；通过WesternBlot方法检测细胞骨唾液酸蛋白（Bone Sialoprotein，BSP）表达变化。结果：和对照组相比，SNAP可明显增加成骨细胞DNA含量和碱性磷酸酶活性；SNAP可刺激成骨细胞于培养2w时生成明显钙化结节，骨钙素蛋白表达，并显著上调骨唾液酸蛋白表达。结论：一定浓度一氧化氮，可加速成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖，并可能通过调控骨唾液酸蛋白表达刺激成骨细胞进一步分化和矿化。     

炎症状态下张应力对成骨细胞基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1表达的影响

目的 观察炎症状态下周期性张应力对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1表达的影响.方法 收集100 ng/ml的经牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.g-LPS)刺激小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)24 h后培养上清液,以20％稀释浓度作用于MC3T3-E1细胞24 h,采用四点弯曲细胞力学加载仪对正常培养与炎症状态下培养的MC3T3-E1细胞分别加载张应力0 h(对照组)、1h、3h、6h,采用荧光定量聚合酶链反应(real time PCR)和免疫组化法检测基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1的mRNA及蛋白水平表达的变化.结果 炎症状态下周期性张应力作用于小鼠成骨细胞后,加力组基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1的mRNA和蛋白表达量较非炎症状态下显著增加,并随着时间的延长而不断增加,且不同时间段的表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 炎症状态下张应力可显著影响成骨细胞基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1的表达,从而为炎症状态与张应力共同作用下基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1参与牙周组织细胞外基质代谢提供了理论依据.     

机械牵张力诱导成骨细胞骨保护素及其配体表达的信号转导途径初探

目的：研究机械牵张力诱导成骨细胞OPG/RANKL表达变化的信号转导途径。方法：在MC3T3-E1细胞加力前半小时加入放线菌酮、吲哚美辛、染料木黄酮、PD098059等抑制剂,通过自制的多通道细胞牵张应力加载系统对细胞施加18%的机械牵张力,细胞的加载作用时间为24h。用RT-PCR方法检测细胞受力前后OPG/RANKL mRNA表达的变化,并进行统计分析。结果：吲哚美辛及染料木黄酮可抑制机械牵张力诱导的MC3T3-E1细胞OPG mRNA表达增加;PD098059可抑制机械牵张力诱导的MC3T3-E1细胞RANKL mRNA表达减少。结论：机械牵张力诱导的OPG表达增加可能是通过环氧合酶或者前列腺素合成途径,也可能是通过酪氨酸磷酸化途径,机械牵张力诱导RANKL表达的减少可能是通过ERK-MAPK途径。     

Differential gene expression of collagen-binding small leucine-rich proteoglycans and lysyl hydroxylases, during mineralization by MC3T3-E1 cells cultured on titanium implant material

Titanium implants create a unique ultrastructure (composed of a collagenous zone with relatively disorganized fibril morphology) at the bone-implant interface. The objective of this study was to investigate the temporal mRNA expression patterns, using real-time polymerase chain reaction, of type I collagen (COLI) and regulators for collagen fibrillogenesis, collagen-binding small leucine-rich proteoglycans (SLRPs) and lysyl hydroxylases (LHs), during mineralization, by MC3T3-E1 cells cultured on titanium (Ti). Lysates of the cultures on Ti and on plastic wells (Pl) for 10-50 d were used for the quantification of calcium and mRNA. Although the onset of calcium accumulation in the cultures on Ti (30-40 d) was slower than that of cultures on Pl (20-30 d), the gene expression patterns during mineralization were similar in cells cultured on either material. COLI and fibromodulin were up-regulated just before the onset of mineralization and then down-regulated. Lumican and LH1 were up-regulated just before the onset of mineralization and then returned to the baseline level. Decorin and LH2 were up-regulated at the late mineralization stage. Biglycan was down-regulated once at the early mineralization stage and then returned to the original level. LH3 was maintained at a steady level throughout. This study suggests actual but distinct roles of SLRPs and LHs in the formation of a unique ultrastructure at the bone-implant interface.     

辐射对体外培养MC3T3-E1成骨前体细胞增殖和分化的影响

目的 观察60Co γ射线对MC3T3-E1成骨前体细胞增殖和分化能力的影响。方法 MC3T3-E1细胞接种24 h后进行60Co γ射线照射,单次照射剂量分别为0、4、8 Gy。辐射后第 1、3、5、7天,采用噻唑蓝比色法检测细胞的增殖能力;辐射后第12天,用黏胶纤维红染色法检测细胞的胶原分泌情况;第16天,用实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞成骨相关基因mRNA的表达;第28天,采用茜素红染色及定量分析检测细胞基质的矿化能力。结果 与对照组（0 Gy）相比,4、8 Gy剂量的射线可以明显降低MC3T3-E1细胞的增殖,并下调其Osterix和骨钙素基因的表达;8 Gy剂量的射线可以明显抑制细胞的胶原分泌和基质矿化能力。结论 60Co γ射线可以降低MC3T3-E1细胞的增殖、胶原分泌及基质矿化能力,并下调其成骨相关基因表达,且随辐射剂量增加,其作用增强。     

不同大小机械牵张力对成骨细胞MMP-13/TIMP-1表达的影响

目的:研究不同大小机械牵张力对成骨细胞MMP-13/TIMP-1表达的影响.方法:通过自制的多通道细胞牵张应力加载系统对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1同时施加0%、6%、12%和18%的机械牵张力,作用24h后,用RT-PCR方法检测细胞受力后MMP-13/TIMP-1 mRNA表达的变化,用免疫印迹法检测其蛋白表达的变化.结果:细胞受力后,MMP-13 mRNA/TIMP-1 mRNA及蛋白表达随牵张力值的增大明显增加.结论:不同大小机械牵张力可以影响成骨细胞的MMP-13/TIMP-1表达,进而影响骨改建.