肝癌细胞冻融抗原负载树突状细胞瘤苗的制备与活化

目的: 探讨制备肝癌树突状细胞(DCs)瘤苗和体外诱导DCs活化的优化方法。方法: 取健康人新鲜血50mL, Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC), 制备肝癌细胞冻融抗原, 采用不同因子组合培养PBMC, 诱导和激活DCs, A组: rhGM-CSF+IL-4; B组: rhGM-CSF+IL-4+冻融抗原负载;C组:rhGM-CSF+IL-4+TNF-α; D组: rhGM-CSF+IL-4+TNF-α+冻融抗原负载。结果: 各组均诱导出DCs, 并高表达CD11c和CD54, 冻融抗原可明显上调CD86、CD80、HLA-DR表达和IL-12 p40分泌(P<0.01), TNF-α促进CD86表达的作用更显著, 但对IL-12分泌无影响, 依次用TNF-α诱导和冻融抗原负载可进一步促进CD86表达和IL12 p40分泌(P<0.05)。CD54和HLA-DR双标记免疫细胞化学染色显示, 各组DCs大多为CD54⁺。表达HLA-DR的DCs均为CD54⁺HLA-DR⁺, 其中, A组CD54⁺HLA-DR⁺细胞数量最少, D组最多, 平均每个细胞HLA-DR的表达水平也与此对应。结论: 采用rhGM-CSF、IL-4诱导的未成熟DCs, 依次使用TNF-α刺激与肝癌细胞冻融抗原修饰可有效促进DCs的活化与成熟。     

同种异型抗原冲击不成熟CD8α+DCs抑制T细胞增殖的体外实验

目的: 探索同种异基因抗原体外冲击后小鼠优势不成熟CD8α⁺树突状细胞(DCs)体外抑制T细胞增殖的最佳条件。方法: 取SPF级C57BL/6(H-2b)小鼠的骨髓细胞,GM-CSF +IL-4 +SCF +Flt3L诱导制备优势不成熟CD8α⁺DCs,于培养最后1 d加入梯度蛋白浓度(0、2.5、5、10和20 mg/L)同种异基因(H-2d)小鼠脾细胞抗原冲击DCs。经抗原冲击后的DCs分别与同系T细胞按1∶ 1、2∶ 1、4∶ 1比例共培养,MTT法观察T细胞增殖情况。ELISA法检测上清中细胞因子(IFN-γ和IL-10)的含量。以GM-CSF +IL-4 +TNF-α诱导的成熟DCs作为对照。结果: 优势不成熟CD8α⁺DCs与T细胞1∶ 1共培养时不能有效刺激T细胞增殖,与2∶ 1及4∶ 1组相比刺激能力最弱(P<0.05);上清中IFN-γ的分泌明显低于成熟DCs对照组,且经小剂量抗原(＜2.5 mg/L)冲击时IL-10的分泌高于对照组。结论: 经小剂量(2.5 mg/L)同种异基因抗原冲击后的优势不成熟CD8α⁺DCs,与T细胞1∶ 1混合,是抑制T细胞增殖的最佳条件。     

粒细胞集落刺激因子动员对供者外周血细胞树突状细胞亚群的影响

目的：研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员对外周血单个核细胞（PBMNC）中树突状细胞（DC）亚群及其功能的影响。方法：以CD34^-Lin^- HLA-DR⁺细胞群设门4色荧光分析方法检测25例无关供者G-CSF动员前、后外周血细胞DC亚群；ELISA检测其血清相关细胞因子IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4活性，并分析DC₁/DC₂（CD11c⁺CD123^- /CD11c^-CD123⁺）比值与CD34⁺细胞含量的相关性。结果：G-CSF动员后, 供者PBMNC 的DC₁/DC₂比值显著低于动员前（P<0.05）；DC₁/DC₂与CD34⁺细胞含量呈负相关（r=-0.438, P<0.05），CD34⁺细胞/MNC≥0.4%时， DC₁/DC₂倒置；而血清相关细胞因子IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4水平无显著改变（P>0.05）； DC₂ HLA-DR表达上调而CD83不表达。结论： G-CSF动员后，供者外周血CD34⁺细胞数量增加的同时，DC₂数量也增加，这些DC₂尽管HLA-DR表达上调，但仍处前体细胞状态，不直接分泌或调节Th2细胞分泌免疫抑制因子。     

人骨髓间充质干细胞对不稳定型心绞痛患者树突状细胞功能的影响

目的:研究人骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)对不稳定型心绞痛患者树突状细胞(dendritic cells,DCs)功能的影响,探讨hMSCs对不稳定型心绞痛患者异常激活的DCs功能是否存在抑制作用.方法:以Friedenstein法[1]分离培养人骨髓间充质干细胞,密度梯度离心法分离UAP患者和正常人外周血单个核细胞,在含人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和人重组白介素4(rhIL-4)的培养条件下制备DCs,实验分为UAP组,hMSCs处理组,正常对照组.实验组将UAP患者组中加入hMSCs共培养48小时.用流式细胞仪检测实验各组DCs表面共刺激分子CD86(B7-2),成熟标记物CD83和抗原呈递分子HLA-DR的表达,混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR)检测各组DCs对同种异体T淋巴细胞的刺激能力,ELISA法检测各组MLR中细胞因子IL-10,IL-12,INF-γ的表达.结果:与正常对照组比较,UAP组DCs表面CD86和CD83以及HLA-DR表达明显增高;对T淋巴细胞刺激的能力增强;经DCs刺激的淋巴细胞分泌致炎细胞因子(IL-12,INF-γ)增多,抑炎细胞因子(IL-10)减少.hMSCs处理组DCs表面CD86,CD83以及HLA-DR表达较处理前明显下降,对T淋巴细胞的刺激能力减弱,分泌致炎细胞因子(IL-12,INF-γ,TNF-α)减少,而抑炎细胞因子(IL-10)增加.结论:本实验表明,人骨髓间充质干细胞能显著抑制不稳定心绞痛患者DCs功能,从而为应用人骨髓间充质干细胞治疗炎症性疾病提供实验证据.     

人外周血单核细胞来源树突状细胞的成熟诱导

目的：探讨诱导树突状细胞成熟的最优方法。方法：以细胞因子GM-CSF和IL-4体外诱导人单核细胞来源的树突状细胞，分别采用CD40L、LPS、TNF-α、细胞因子鸡尾酒法（TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2）诱导成熟，24小时后收获DCs以流式细胞仪检测其成熟表型CD80、CD83、CD86、HLA-DR和FITC-Dextran的内吞能力，ELISA法检测其IL-12的分泌，MTT法检测其刺激淋巴细胞增殖活性。结果：CD40L、LPS、TNF-α、鸡尾酒法均可诱导DCs的成熟，其中以鸡尾酒法诱导成熟的效果最优，CD83的表达率为66.91%（P〈0.05）；成熟DCsFITC-Dextran的内吞能力明显下降；成熟DCsIL-12分泌量明显高于未成熟DCs，其中鸡尾酒法诱导成熟的DCs的IL-12分泌量最高，成熟的DCs有较强的刺激淋巴细胞增殖能力。结论：细胞因子鸡尾酒法是诱导DCs成熟的最佳方法。     

白细胞介素-18干预诱导的树突状细胞表型和活性研究

目的：研究白细胞介素-18（IL-18）干预诱导的树突状细胞（DC）的表型和活性。方法:自人外周血单核细胞诱导DC，第5 d起分为IL-18组、TNF-α组和IL-18+TNF-α组，分别加IL-18、TNF-α及IL-18+TNF-α促成熟，用ELISA法测定上清中IL-12含量；用流式细胞仪测定培养8 d DC的CD1a、HLA-DR、CD83及CD86的表达；用MTT法检测3组DC诱导T细胞增殖的作用。用ELISA法测定3组DC刺激T细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)的量。结果:IL-18组与TNF-α组CD1a、HLA-DR、CD83及CD86表达无差异，IL-18+TNF-α组CD1a、CD83及HLA-DR阳性率高于IL-18组。IL-18+TNF-α组IL-12量高于IL-18组和TNF-α组(P＜0.05)。IL-18组与TNF-α组DC刺激T细胞增殖作用无差异，IL-18+TNF-α组DC的作用强于IL-18组和TNF-α组。IL-18组和TNF-α组IFN-γ量无显著差异，IL-18+TNF-α组IFN-γ的量高于IL-18组和TNF-α组(P＜0.05)。结论:IL-18干预诱导的DC高表达表面分子，具有明显的免疫刺激活性，IL-18与 TNF-α合用作用更强。     

肾癌细胞冻融抗原负载树突状细胞瘤苗的活化

目的: 探索体外诱导DCs活化的方法和制备肾癌树突状细胞(DCs)瘤苗。方法: 制备肾癌细胞冻融抗原；取健康人新鲜血分离外周血单个核细胞(PBMC),应用GM-CSF+IL-4刺激，诱导PBMC为iDCs,然后进行分组，采用不同因子刺激iDCs转化为mDCs,其中Ａ组:冻融抗原负载；Ｂ组: TNF-α+冻融抗原负载；Ｃ组: IL-1β+冻融抗原负载；Ｄ组: TNF-α+IL-1β+冻融抗原负载。 结果:各组均可诱导iDCs的成熟,并高表达CD86、CD80和HLA-DR；相对于其它组，D组DCs 更显著上调CD83和CD54表达(P<0.05)和IL-12分泌(P<0.01)，且D组mDCs更有效地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05)。 结论: TNF-α+IL-1β与肾癌细胞冻融抗原协同可有效促进DCs成熟、增强诱导淋巴细胞活化的能力。     

CD40配基化的肿瘤特异性树突状细胞介导Th1细胞分化的研究

目的：探讨CD40配基化的肿瘤特异性DCs在介导Th1细胞分化中的作用。方法：采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导小鼠髓系DCs，并利用mCD40L-CHO和TNF-α分别刺激凋亡肿瘤细胞负载的DCs制备DCs瘤莆；^3H-TdR掺入试验检测DCs对T淋巴细胞的促增殖效应；ELISA测定细胞培养上清中IL-10、IFN-1、IL-12的含量；胞内染色和流式细胞术检测经成熟DCs活化的T细胞中CD4^＋IFN-γ^＋T和CD4^＋IL-4^＋T的比例。结果：体外刺激T细胞增殖能力在CD40配基化DCs组最高（P〈0．05），CD40配基化DCs能更有效地促进活化T细胞分泌IFN-γ和介导CD4^＋IFN-γ^＋T细胞的分化（P〈0．05）。同时，CD40配基化DCs分泌IL-12的量也明显高于TNF-α组（P〈0．05）。结论：CD40配基化的肿瘤特异性DCs体外能有效介导Th1细胞的分化。     

通过肿瘤致敏的DCs活化的CD8+ T细胞可有效地杀死肿瘤细胞

目的：探索肿瘤裂解物负载的DCs诱导活化的初始T细胞介导细胞免疫及活化的T细胞杀死肿瘤细胞的能力。方法:应用黏附法分离外周血中的淋巴细胞和单核细胞,应用GM-CSF+IL-4刺激单核细胞并诱导为iDCs,然后进行分组，应用相应的细胞因子等刺激iDCs转化为mDCs,其中肿瘤裂解物冲击DCs组:冻融抗原负载+TNF-α+IL-1β; 无肿瘤裂解物冲击组: TNF-α+IL-1β。再分别用上述DCs与淋巴细胞进行混合培养以刺激混合淋巴细胞中的T细胞转化为细胞毒性T细胞, 并进行分组, 肿瘤裂解物冲击DCs组: 肿瘤裂解物冲击DCs+IL-2+IL-7；无肿瘤裂解物冲击DCs组: 无肿瘤裂解物冲击DCs+IL-2+IL-7；对照组: IL-2+IL-7。结果:成功获得iDCs,并高表达CD86、CD80和HLA-DR；相对于其它组，肿瘤裂解物冲击DCs组mDCs更显著上调CD83，且更有效地刺激淋巴细胞增殖； 肿瘤裂解物冲击DCs组的CTLs也高表达CD95(Fas)且TNF-α和IFN-γ的表达水平显著提高(P<0.05)。结论: 肿瘤裂解物冲击DCs可有效促进T细胞活化、增殖；并显著增强相应CTLs的杀死靶细胞的能力，这为发展DCs+CTLs的免疫治疗肿瘤提供了一种新而且简便的生物治疗模式。     

肝细胞癌患者树突状细胞免疫功能的研究

 目的：研究肝细胞癌患者树突状细胞(DCs)的免疫功能变化。方法：从人外周血中分离单个核细胞（PBMC），用GM-CSF和IL-4体外诱导、培养和扩增DCs，流式细胞仪测定DCs表面分子的表达，分别用ELISA、ELISPOT、MTT法测定HCC患者和健康人的DCs分泌IL-12；T淋巴细胞分泌IFN-γ和T淋巴细胞的增殖反应。结果：GM-CSF和IL-4能成功地体外诱导、培养和扩增DCs。HCC患者DCs的CD86表达明显低于健康对照者（91.7％ vs83.5%, P<0.05）。HCC患者DCs分泌IL-12与健康者差异不显著［（324.6±171.0）ng/L vs（436.5±142.7）ng/L, P>0.05］，接受内毒素LPS刺激后，差异更明显［（478.6±142.7）ng/L vs（630.0±151.9）ng/L, P<0.05］。DCs刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ 的量在HCC患者明显低于健康者［（133.4±51.2）103U/L vs (183.0± 60.2)103U/L, P<0.05］，DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力在HCC患者明显低于健康者（2.3±0.7 vs3.5±0.8, P<0.01）。CTL杀伤实验表明，当效靶比为 10∶〖KG-*2〗1 和 20∶〖KG-*2〗1 时，HCC组的CTL对肝癌细胞Hep G2的杀伤活性明显低于健康组。结论： HCC患者DCs功能和T淋巴细胞功能低于健康者，HCC患者DCs诱导的CTL杀伤活性亦明显低于健康者。     

CD34-derived dendritic cells transfected ex vivo with HIV-Gag mRNA induce polyfunctional T-cell responses in nonhuman primates

The pivotal role of DCs in initiating immune responses led to their use as vaccine vectors. However, the relationship between DC subsets involved in antigen presentation and the type of elicited immune responses underlined the need for the characterization of the DCs generated in vitro. The phenotypes of tissue-derived APCs from a cynomolgus macaque model for human vaccine development were compared with ex vivo-derived DCs. Monocyte/macrophages predominated in bone marrow (BM) and blood. Myeloid DCs (mDCs) were present in all tested tissues and were more highly represented than plasmacytoid DCs (pDCs). As in human skin, Langerhans cells (LCs) resided exclusively in the macaque epidermis, expressing CD11c, high levels of CD1a and langerin (CD207). Most DC subsets were endowed with tissue-specific combinations of PRRs. DCs generated from CD34(+) BM cells (CD34-DCs) were heterogeneous in phenotype. CD34-DCs shared properties (differentiation and PRR) of dermal and epidermal DCs. After injection into macaques, CD34-DCs expressing HIV-Gag induced Gag-specific CD4(+) and CD8(+) T cells producing IFN-γ, TNF-α, MIP-1β, or IL-2. In high responding animals, the numbers of polyfunctional CD8(+) T cells increased with the number of booster injections. This DC-based vaccine strategy elicited immune responses relevant to the DC subsets generated in vitro.     

雷公藤内酯醇对系统性红斑狼疮患者DC细胞功能及成熟的影响

目的 通过体外实验研究雷公藤内酯醇(triptolide)对系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者树突状细胞(dendritic cell,DC)功能及成熟的影响,为进一步阐明雷公藤内酯醇的免疫学活性提供依据.方法 从SLE患者外周血分离单个核细胞,流式细胞仪分选DC,加入0、5、10、30μg/L的雷公藤内酯醇共孵育,24h后收集上清液,ELISA检测IFN-α、IL-6、TNF-α量,5d后收集细胞,流式细胞仪检测DC表型CD11c、CD80、CD86阳性率,光镜观察DC的形态,扫描电镜观察DC的超微结构.结果 雷公藤内酯醇显著减低活动期与非活动期SLE患者IFN-α、IL-6、TNF-α量,并呈雷公藤内酯醇浓度依赖性(P＜0.05);雷公藤内酯醇可抑制SLE患者DC的分化和成熟,并呈雷公藤内酯醇浓度依赖性(P＜0.05).结论 雷公藤内酯醇能够减弱SLE患者DC的功能,并抑制其分化和成熟.     

IL-24基因修饰增强CIK细胞对HL-60细胞的细胞毒作用

目的:研究IL-24基因修饰的CIK细胞与同源树突状细胞共培养后对白血病细胞的杀伤作用及其机制.方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导DC和CIK 细胞,电穿孔法将IL-24基因导入CIK细胞中(获得细胞为CIK-IL24),RT-PCR 和ELISA法检测CIK细胞中IL-24基因的表达,FCM和ELISA法检测转基因前后CIK表型及分泌细胞因子能力的变化,将CIK 细胞和同源DC共培养,FCM法检测共培养的DC-CIK细胞对HL-60细胞细胞毒活性的变化.结果:通过电穿孔法成功将IL-24基因导入CIK细胞,与对照组相比,转IL-24基因后CIK细胞中CD3~+、CD3~+CD56~+细胞的比例无明显改变,CD4~+CD25~+细胞比例显著下降.IL-24可上调CD3+CD56+细胞表面粘附分子CD54、CXCR4的表达,转染IL-24基因后CIK分泌TNF-α和IFN-γ的能力显著增强,与DC共同作用HL-60细胞时转染IL-24基因后的CIK细胞细胞毒活性明显增强.结论:通过IL-24基因修饰,明显增强了CIK细胞对HL-60细胞的杀伤能力,其机制与IL-24促进CIK分泌TNF-α、IFN-γ,上调CIK细胞表面粘附分子的表达,减少CD4~+CD25~+调节性T细胞比例等密切相关.     

MCF-7 乳腺癌细胞培养上清对树突状细胞抑制作用的研究

目的:应用MCF-7乳腺癌细胞分泌的上清液培养正常外周血树突状细胞,探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌因子对正常树突状细胞分化、成熟及功能的影响.方法:应用MCF-7 乳腺癌细胞的培养上清和GM-CSF、IL-4及TNF-α培养正常外周血单个核细胞,检测所诱导的树突状细胞(DC)及其致敏的CTL活性.结果:MCF-7 乳腺癌细胞培养上清能够明显抑制正常树突状细胞的分化成熟及抗原提呈能力,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达明显降低,与正常对照差异显著(P＜0.01);CTL对MCF-7细胞杀伤活性为17.35%与对照组56.14%比较差异显著(P＜0.01);IL-12分泌和共刺激T淋巴细胞所分泌的IFN-γ明显降低(P＜0.01).结论:MCF-7 乳腺癌细胞上清明显抑制所共培养的树突状细胞的分化、成熟及抗原提呈能力.     

缺氧/复氧对小鼠骨髓树突状细胞表型及生物学活性的影响

目的 探讨缺氧/复氧对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表型及生物学活性的影响.方法 培养小鼠骨髓源性DC,分为对照组及缺氧/复氧组,对照组在正常培养条件下培养,缺氧/复氧组给予缺氧气体培养4 h,然后在正常培养条件下继续培养1 d.应用流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、MHC Ⅱ分子的变化,ELISA法检测DC分泌TNF-α、IFN-γ和IL-12的浓度,混合淋巴细胞培养检测T细胞增殖能力,免疫细胞化学检测Dc核因子-κB(NF-κB)的表达.结果 缺氧/复氧可促进DC高表达CD80、CD86、MHC Ⅱ分子,促进Th1型细胞因子释放、NF-κB高表达及核移位,并诱导T细胞增殖.结论 缺氧/复氧可刺激DC高表达表面分子,具有明显的免疫刺激活性.     

Induction of IL-10 producing CD4+ T cells with regulatory activities by stimulation with IL-10 gene-modified bone marrow derived dendritic cells

Dendritic cells (DCs) can induce both tolergenic as well as effective immune responses in the lung. Pulmonary DCs producing interleukin (IL)-10 mediated tolerance induced by respiratory exposure to antigen. IL-10 is an important immunosuppressive cytokine, which inhibits maturation and function of DC. To assess whether IL-10 producing DCs can exert the tolergenic effect through the differentiation of regulatory T cells, bone marrow derived DCs were genetically modified by IL-10 expressing adenovirus. IL-10 gene modified DCs (Ad-IL-10-DC) displayed a characteristic phenotype of immature DCs. Here we showed that in vitro repetitive stimulation of naïve DO11·10 CD4⁺ T cells with Ad-IL-10-DCs resulted in a development of IL-10 producing T-cell regulatory cells. These T cells could not proliferate well but also lost their ability to produce interferon-γ upon restimulation with irradiated splenocytes and ovalbumin peptide. Furthermore, in co-culture experiments these T cells inhibited the antigen-driven proliferation of naïve CD4+ T cells in a dose-dependent manner. Our findings demonstrated that IL-10 producing DCs had the potential to induce the differentiation of Tr1-like cells and suggested their therapeutic use.     

单元型相同骨髓移植后患者单核细胞来源的DC表面分子的检测

对单元型相同骨髓移植患者造血重建后的外周血单个核细胞加GM-CSF、IL-4进行DC诱导,7d后加入TNF-α于培养DC中,继续诱导3d。测定DC的表型、混合淋巴细胞反应对T细胞增殖能力的测定,并与健康志愿者外周血来源的DC进行比较。探讨单元型相同造血干细胞移植后患者单个核细胞来源的DC的生物学特性。结果显示,单元型相同造血干细胞移植患者外周血单个核细胞和正常人外周血单个核细胞来源的DC均高表达CD1α、CD83、CD80、CD86和HLA-DR等DC的相关抗原和共刺激分子,患者的未成熟DC经TNF-α诱导后,成为成熟和有功能的DC,单元型相同造血干细胞移植患者单个核细胞来源的DC在体外具有激发同种异体外周血T细胞增殖的能力,与健康人外周血来源DC组相比均无统计学意义(P>0.05)。