蚯蚓纤溶酶研究概述

对具有纤溶活性的物质研究已有多年的发展,但是血栓性疾病仍然是致人死亡或身体机能障碍的主要原因之一。从具有特殊生理功能的生物体中获取活性物质近来受到广泛关注,在蚯蚓消化腺的分泌物中纯化得到一组同工酶,表现出良好的溶栓效果,并被命名为蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzyme,EFE）。本文在多层次上对蚯蚓纤溶酶作一综述,内容包括：蚯蚓纤溶酶的纯化、克隆表达,并详细介绍该酶结构与功能之间的关系以及临床应用等。     

蚯蚓纤溶酶分离及部分生化性质的研究

采用亲合层析法对蚯蚓纤溶酶进行初步纯化,并对其生化特性进行鉴定。结果表明：经纯化的蚯蚓溶酶其分子量在20KD－30KD之间,对人血纤维蛋白平板具有良好的溶解作用,并考察了其热稳定性。纤溶酶能激活血栓中的纤溶酶原,从而使血栓溶解,直接作用于血栓表面,使形成血栓的纤维蛋白溶解成小分子,达到抗血栓之目的。     

蚯蚓纤溶酶部分质量标准的研究

采用亲和层析、凝胶层析对蚯蚓粗提液进行分离、纯化,得到蚯蚓纤溶酶纯化样品,并对其活性、含量、纯度等检测方法进行了试验研究,确定HPLC、SDS-PAGE电泳、280nm紫外吸收、琼脂糖-纤维蛋白平板法分别为蚯蚓纤溶酶的纯度、相对分子量、含量及活性的检测方法.同时又对纯化的蚯蚓纤溶酶进行了N-末端的测序,获得了重要的蚯蚓纤溶酶分子生物学的研究资料.     

蚯蚓纤溶酶部分质量标准的研究

采用亲和层析、凝胶层析对蚯蚓粗提液进行分离、纯化，得到蚯蚓纤溶酶纯化样品，并对其活性、含量、纯度等检测方法进行了试验研究，确定HPLC、SDS—PAGE电泳、280nm紫外吸收、琼脂糖-纤维蛋白平板法分别为蚯蚓纤溶酶的纯度、相对分子量、含量及活性的检测方法。同时又对纯化的蚯蚓纤溶酶进行了N-末端的测序，获得了重要的蚯蚓纤溶酶分子生物学的研究资料。     

纤维蛋白酶谱检测蚯蚓纤溶酶组分

 目的建立鉴定蚯蚓纤溶酶粗酶液中活性组分的方法。方法根据蚯蚓纤溶酶能水解纤维蛋白的性质,建立了纤维蛋白-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Fibrin-SDS-PAGE),优化了电泳条件,电泳后酶所在部位为透明区带。结果分离胶中纤维蛋白终质量浓度为0.4×10^-3mg·L^-1,电泳后胶板用2.5% TritonX-100复性30min,PBS缓冲液(pH7.2)保温30min,考马斯亮蓝R-250染色,7%醋酸脱色,可以得到清晰的酶谱。结论该方法灵敏度高,用2μg样品,就能准确检测出粗酶液中所有纤溶酶组分。     

蚯蚓溶栓酶对大鼠凝血及纤溶指标的影响

低剂量的溶栓酶用于大鼠能引起纤维蛋白原（Ｆｂｇ）平均下降４５％，凝血酶时间（ＴＴ）由１１．１３秒延长到２２．６３秒（Ｐ＜０．０１），而凝血酶原时间（ＰＴ）及白陶土部分凝血活酶时间（ＫＰＴＴ）无显著性变化（Ｐ＞０．０５）。但高剂量的溶栓酶除能明显降低Ｆｂｇ和延长ＴＴ外，而且可使ＰＴ由１６．８２秒延长到７３．４４秒及ＫＰＴＴ由４６．６３秒延长到１２４．１３秒，并能使Ⅱ、Ⅷ因子降解，起到强的抗凝效果     

蚯蚓纤溶酶分离及部分生化性质的研究

采用亲合层析法对蚯蚓纤溶酶进行初步纯化,并对其生化特性进行鉴定.结果表明经纯化的蚯蚓纤溶酶其分子量在20KD-30KD之间,对人血纤维蛋白平板具有良好的溶解作用,并考察了其热稳定性.纤溶酶能激活血栓中的纤溶酶原,从而使血栓溶解,直接作用于血栓表面,使形成血栓的纤维蛋白溶解成小分子,达到抗血栓之目的.     

一种新型蚯蚓纤溶酶的研究

采用加提取剂的匀浆、盐析、超滤及层析方法从一种环毛蚓中获得一种新型纤溶酶。此酶分子量为22000,为单链蛋白。它不仅有强烈的直接溶解血栓及人纤维蛋白活性,而且还有纤溶酶原激活作用;动物试验表明此酶的毒副作用很小。本方法获得的酶的活性、纯度及得率都很高。     

蚯蚓纤溶酶抗肝癌转移作用的实验研究

目的 探讨蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme,EFE)对人肝癌细胞转移的影响.方法 建立裸鼠人肝癌高转移原位移植瘤模型,造模后7 d将裸鼠随机分为模型对照组和EFE高、低剂量组,共3组,每组7只,每天分别给予生理盐水和1600,800 uku/kg EFE灌胃,连续30 d.实验结束时完整剥除种植瘤并称重;肉眼直接观察种植瘤的肝内播散及腹腔种植情况,计算肝内播散率及腹腔种植率;通过病理切片观察肺转移肿瘤灶的数目;采用RT-PCR及Western blot方法检测移植瘤中FAK(focus adhesion kinase)及β1-整合素蛋白的表达.结果 与模型对照组相比,EFE低、高剂量组原位种植瘤瘤重减轻(P＜0.05或P＜0.01);种植瘤肝内播散率和腹腔种植率降低,其中,EFE高剂量组与模型对照组比较,具有显著性差异(P＜0.05);肺转移灶数目明显减少,与模型对照组相比,具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01).在原位种植瘤和移植瘤中FAK及β1-整合素在mRNA及蛋白水平的表达方面,EFE高、低剂量组的表达均明显下降,与模型对照组比较具有非常显著性差异(P＜0.01).结论 EFE具有抗肝癌转移的作用,其机理可能与EFE能够抑制FAK及β1-整合素的表达有关.     

地龙的鲜品和干品可溶性蛋白及纤溶酶活性的对比研究

目的:对比研究地龙的鲜品和干品的可溶性蛋白及纤溶酶活性.方法:采用Bradfold方法测定蛋白含量,SDS-PAGE进行蛋白谱带的分析,并采用琼脂糖-纤维蛋白平板法进行纤溶酶活性的测定.结果:以干燥品计,鲜品的蛋白提取率为( 13.89±0.86)％,蛋白含量为(63.14±0.38)％,体外纤溶酶活性为(8 743 ±17) IU·g-1;干品蛋白提取率为(9.82±0.75)％,蛋白含量为(45.16 ±0.12)％,体外纤溶酶活性为(206±14) IU·g-1;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,鲜品共显示12条蛋白谱带,干品的谱带较少,且不清晰.结论:鲜地龙的可溶性蛋白提取率、含量及体外纤溶酶活性均明显高于干品,且蛋白组分有较大的差异.     

蚯蚓纤溶酶活性影响因子的研究

目的 :对提取过程中影响蚯蚓纤溶酶活性的 5种因子进行了分析 ,以提高纤溶酶的提取活性。方法 :分别采用 0.9%NaCl抽提、10%蔗糖抽提、75%酒精抽提出粗酶。酶活测定方法采用尿激酶琼脂糖 纤维蛋白平板法。硒含量的测定方法采用 3,3′-二氨基联苯胺比色法 ;砷含量的测定方法采用二乙氨基二硫代甲酸银比色法。结果 :饲养在牛粪饵料中的蚯蚓纤溶酶活性比饲养于生活垃圾中的蚯蚓纤溶酶活性更高 ,蚯蚓体内砷的含量与纤溶酶活性呈正相关 ,而蚯蚓体内硒的含量对纤溶酶活性影响不大。在采用 3种不同的蚯蚓纤溶酶的抽提方法中 ,75 %酒精抽提效率最高 ,0.9%氯化钠次之 ,10%蔗糖最低 ;在蚯蚓纤溶酶纯化过程中 ,透析比超滤对蚯蚓纤溶酶的活性影响更小一些。结论 :通过将蚯蚓饲养在适宜的饵料中 ,使用合适的提取手段和提纯方法 ,可以提高蚯蚓纤溶酶的提取活性。     

地龙提取液的活血化瘀作用

为研究地龙的活血化瘀作用及其机制,本实验应用地龙组织提取液给家兔静脉注射,测定其血浆纤维蛋白原含量及优球蛋白溶解时间的变化,结果均明显减少(P<0.01)。将该提取液进一步萃取,制备含多种纤溶酶的酶液,给家兔静脉注射,测定其血液流变学多项指标变化。结果表明血小板聚集百分率、全血及血浆粘度、红细胞刚性指数均显著降低(P<0.01)。说明地龙酶提取液通过促纤溶、抑制血小板聚集、增强红细胞膜稳定性等机制,起到良好的活血化瘀作用。     

蚯蚓用于抗血栓的加工方法

目的:为干品蚯蚓的临床应用提供依据。方法:采用冷冻干燥、晒干、不同温度烘干等方法干燥,以溶栓效价的测定为指标。结果:晒干、40℃烘干、40℃减压干燥的效价与冷冻干燥品效价无差异,温度>50℃则效价显著下降。结论:蚯蚓的干燥方法可确定为晒干或者40℃烘干。     

豆豉纤溶酶的分离纯化及部分酶学性质研究

 目的 从豆豉中分离出具有强纤溶活性的菌株,从该菌株的发酵液中纯化出纤溶酶并对此纤溶酶的部分酶学性质进行研究。方法 利用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephadex G-75凝胶过滤色谱等方法进行纯化;利用N-末端氨基酸序列测定及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对此酶进行鉴定。结果 从发酵液中获得了纤溶酶单一组分,表观相对分子质量为30×10³。该纤溶酶在50 ℃以下和pH 7.0~9.0之间保持稳定,最适温度为35 ℃;最适pH为8.6。N-末端氨基酸序列及飞行时间质谱测定结果都表明该酶与纳豆激酶氨基酸序列有着极高的相似性。结论 获得了纤溶酶单一组分,为纤溶酶发酵产品的大规模纯化和进一步研制开发新的溶栓药物提供重要理论依据。     

五味地龙汤平喘作用研究

目的:探讨五味地龙汤对动物哮喘的作用。方法:采用组胺喷雾致豚鼠哮喘法,肺溢流法,豚鼠离体气管平滑肌过敏性收缩实验法,离体气管片法,豚鼠肺支气管灌流法进行试验。结果:五味地龙汤水煎液对喷入组胺致喘的豚鼠,能使其哮喘潜伏期显著延长(P<0.01),肺溢流量减少(P<0.01),能使豚鼠离体气管平滑肌过敏性收缩有非常显著的抑制作用(P<0.01),对给予组胺后的豚鼠离体气管片引起的收缩有非常显著的舒张作用(P<0.01),能使肺支气管灌流液流速加快,灌流量增加(P<0.01)。结论:五味地龙汤水煎液对由各种过敏介质引起的哮喘,有显著的抑制作用。这可能是因为其对在体、离体气管平滑肌均有松弛作用,并拮抗组胺等过敏介质对气道的炎性反应和具有激动体内β-受体和免疫系统,从而发挥其作用的。     

龙舒泰精制地龙胶囊稳定性研究

目的研究龙舒泰精制地龙胶囊的质量稳定性。方法用尿激酶琼脂糖—纤维平板法,测定供试样品蚓激酶酶活。结果在室温条件下存放1,2,3,4年,在3年内各项指标均保持不变。结论该研究有助于龙舒泰精制地龙胶囊的效期确定。