日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3疫苗免疫保护性的观察

目的　研究日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白1433(rSj1433)作为血吸虫病疫苗分子的潜能,并探讨rSj1433、rSjGST两种重组蛋白作为疫苗的协同作用及结核杆菌低分子量耐热多肽(Mtb)激活的γδT细胞在抗血吸虫病中的作用。　方法　用SDSPAGE、电洗脱和透析的方法制备rSj1433和rSjGST抗原,将两种抗原(分别用福氏佐剂和Mtb为佐剂)分别免疫BALB/c小鼠后,进行尾蚴攻击感染实验。在攻击感染6wk后,剖杀小鼠计算各组的减虫率。　结果　各组的减虫率为rSj1433+福氏佐剂组32.20%,rSj1433+rSjGST+福氏佐剂组31.10%,rSj1433+Mtb佐剂组27.96%,rSj1433+rSjGST+Mtb佐剂组26.00%,rSjGST+Mtb佐剂组27.10%;各组的减卵率分别为(按以上组序)50.40%、53.30%、51.10%、58.60%和51.30%。　结论　rSj1433具有一定的抗血吸虫潜能,有可能成为抗日本血吸虫疫苗,但未见rSj1433和rSjGST的协同作用;Mtb激活扩增的γδT细胞在抗血吸虫免疫中的效果与福氏佐剂产生的免疫作用类似。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3DNA免疫保护作用的观察

目的　研究日本血吸虫 (中国大陆株 )重组信号蛋白 14 - 3- 3(rSj14 - 3- 3)DNA作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能。方法　碱裂解法大量制备rSj14 - 3- 3和rSjGSTDNA ,将两种DNA分别免疫BALB/c小鼠进行攻击感染实验。 结果　在尾蚴攻击感染 6w后 ,剖杀小鼠计算各组的减虫率 ,rSj14 - 3- 3DNA组为 34 2 0 % ,rSj14 - 3- 3+rSjGSTDNA组为32 4 0 % ;减卵率为 (按以上组序 ) 5 0 74 %和 5 5 2 3%。结论　重组Sj14 - 3- 3DNA具有一定的抗血吸虫病潜能 ,有可能作为日本血吸虫病的候选疫苗 ,但未见Sj14 - 3- 3、SjGST两种重组DNA的协同作用。     

日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的免疫保护作用

目的 探讨日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的重组真核表达载体(pcDNA3.1(+)-SjP14)对小鼠血吸虫感染的免疫保护作用.方法 制备无内毒素pcDNA3.1 (+)-SjP14及纳米微球DNA疫苗,将雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组10只,分别为生理盐水对照组、pcDNA3.1(+)-Sj P14组及纳米微球-DNA疫苗组.各组小鼠分别肌肉注射生理盐水和pcDNA3.1(+)-Sj P14、纳米微球DNA疫苗100μg/鼠·次,每2周免疫一次,共3次.末次免疫后2周,尾蚴攻击,6w后处死小鼠,收集成虫,计算减虫率;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率.结果 pcDNA3.1(+)-Sj P14p核酸疫苗能明显提高小鼠的抗血吸虫感染能力,减虫率和减卵率分别达到44.6％和61.6％;纳米微球-DNA疫苗免疫能进一步提高小鼠抗血吸虫感染作用,减虫率和减卵率分别提高至56.2％和73.5％.结论 pcDNA3.1(+)-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用,pcDNA3.1(+)-SjP14-纳米微球复合物疫苗免疫能增强小鼠对血吸虫感染的免疫保护作用.     

日本血吸虫rSj14-3-3疫苗和rSj26 GST疫苗联合免疫保护作用研究

目的观察日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)疫苗和重组M r2600谷胱甘肽S转移酶(rSj26GST)疫苗联合免疫对小鼠的保护作用。方法将含有Sj14-3-3和Sj26GST编码基因的菌株E.coliBL21/p ET28a涂布LB/Kana/IPTG/X-gal平板,培养、收集细菌、超声碎菌、分离、纯化,分别取5μL进行SDS-PAGE,观察纯化结果,采用BCA法测定重组蛋白的浓度。联合免疫组BALB/c小鼠分别在第0、2、4周用rSj14-3-3疫苗rSj26GST疫苗联合免疫;而单独免疫的rSj14-3-3组及rSj26GST组,与上组同步各自免疫3次。末次免疫后2周进行感染攻击,45d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵。同时设PBS对照组。计算各组间的减虫率和减卵率,以及虫卵肉芽肿的大小。结果联合免疫组的减虫率为38.38%,显著高于rSj14-3-3(16.98%)和rSj26GST组(26.80%)(P0.01)。联合免疫组以及rSj14-3-3、rSj26GST组减卵率分别为48.81%、25.27%、41.41%;联合免疫组rSj14-3-3和rSj26GST组,肝组织中每条雌虫平均产卵数显著低于PBS对照组(P0.01)。联合组小鼠虫卵肉芽肿的直径为(173.9±35.0μm),显著小于对照组(267.7±28.6μm)(P0.01),联合组亦明显低于rSj14-3-3和rSj26GST组(P0.01)。结论联合免疫组的保护作用优于rSj14-3-3和rSj26GST单独免疫组。且联合免疫疫苗具有一定的抗虫卵肉芽肿及抗肝纤维化作用。     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的　初步探讨重组信号蛋白 14 3 3及 14 3 3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。　方法　用rSj14 3 3和rSj14 3 3 /SjGST免疫BALB/c小鼠 ,日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染 ,收集实验组与对照组成虫和虫卵 ,计算减虫率和减卵率 ;间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化 ;显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小 ,观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。　结果　上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为 3 1.93 %和 3 4.3 9% ;每克肝组织减卵率分别为 5 3 .2 4%和 60 .0 6% ,每对成虫减卵率分别为 3 3 .3 9%和 40 .48% ;免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性 ,免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组 ;实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降3 5 .2 3 %和 46.13 %。　结论　信号蛋白 14 3 3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用 ,复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的初步探讨重组信号蛋白14-3-3及14-3-3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。方法用rSj14-3-3和rSj14-3-3／SjGST免疫BALB／c小鼠，日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染，收集实验组与对照组成虫和虫卵，计算减虫率和减卵率；间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化；显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小，观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。结果上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为31．93％和34．39％；每克肝组织减卵率分别为53．24％和60．06％，每对成虫减卵率分别为33．39％和40．48％；免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性，免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组；实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降35．23％和46．13％。结论信号蛋白14-3-3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用，复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的免疫保护作用

目的 探讨日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的重组真核表达载体(pcDNA3.1(+)-SjP14)对小鼠血吸虫感染的免疫保护作用.方法 制备无内毒素pcDNA3.1 (+)-SjP14及纳米微球DNA疫苗,将雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组10只,分别为生理盐水对照组、pcDNA3.1(+)-Sj P14组...     

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的　探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法　用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果　免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论　重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其单克隆抗体用于诊断的价值

目的探讨纯化的日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其相应单克隆抗体对日本血吸虫病的诊断价值。方法利用纯化的rSj14-3-3抗原和可溶性虫卵抗原(SEA)间接ELISA方法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清中特异性抗体;以纯化的抗rSj14-3-3单克隆抗体包板,以兔抗rSj14-3-3多抗和酶标羊抗兔多抗为检测系统的酶标夹心法检测患者血清中的循环抗原。结果用rSj14-3-3检测急、慢性血吸虫病患者血清中特异性抗体的阳性率分别为100%和933%,用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原的阳性率分别为100%和956%,两者联合检测的总阳性率分别为100%和978%;经治疗后2、4、6、12个月,抗体转阴率分别为387%、548%、75%、90%,血清循环抗原转阴率分别为177%、419%、55%、85%,两者联合检测的总转阴率分别为452%、63%、85%、90%;对正常人血清的检测未见假阳性反应,与华支睾吸虫病和钩虫病患者血清出现轻微的交叉反应;用SEA检测抗体的阳性率分别为978%和956%,与正常人及华支睾吸虫病和钩虫病患者血清均有不同程度的交叉反应,治疗后2、4、6、12个月阴转率分别为32%、65%、125%、15%。结论rSj14-3-3检测急慢性血吸虫病患者血清中的特异性抗体和利用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原具有高度的特异性和敏感性,抗原和单抗可规模化     

PcDNA3/mIL-18对pcDNA3/VP1疫苗免疫效果的影响

目的观察pcDNA3/mIL-18对pcDNA3/VP1DNA疫苗免疫效果的影响。方法从烫伤小鼠肺部组织细胞中提取总RNA进行RT-PCR扩增;将扩增产物与pGEM-T载体连接,构建mIL-18原核表达质粒pGEM-T/mIL-18,酶切纯化mIL-18片断,构建真核表达质粒pcDNA3/mIL-18,将其作为基因佐剂和pcDNA3/VP1共免疫BALB/c小鼠。结果3次免疫后,共免疫组中和抗体滴度高于pcDNA3/VP1组;而病毒滴度低于pcDNA3/VP1组。用10LD50CVB3攻击后,共免疫组小鼠生存率为35%,高于pcDNA3/VP1组。结论PcDNA3/mIL-18对pcDNA3/VP1DNA疫苗的免疫效果有一定的增强作用。     

日本血吸虫信号蛋白14-3-3在毕赤酵母菌中的分泌表达及其抗原性分析

目的 在毕赤酵母菌（Pichia pastoris）表达系统中表达日本血吸虫信号蛋白14-3-3（Sj14-3-3），并与原核表达rSj14-3-3比较其抗原性。 方法 以重组质粒pET28a-rSj14-3-3为模板，PCR扩增Sj14-3-3基因，将特异片段连接到pMD18-T载体, DNA序列分析后，亚克隆目的片段Sj14-3-3至酵母菌分泌表达载体pPICZαB。测序正确后，重组质粒经电转化转染至毕赤酵母菌X-33菌株，经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达，取诱导上清进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹法(Western blotting) 分析。 用间接ELISA法比较毕赤酵母菌表达的rSj14-3-3和原核表达rSj14-3-3检测血吸虫病患者血清抗体的特异性和敏感性。 结果 目的基因已在酵母菌基因组中得到整合, PCR扩增得到约1 300 bp的片段。 经甲醇诱导，Sj14-3-3表达并分泌到培养上清中。 表达产物经SDS-PAGE 测定为 Mr 35 000。Western blotting 结果显示，Mr 35 000 蛋白可被Sj14-3-3单克隆抗体识别，表明该真核表达产物具有免疫反应性。间接ELISA检测结果表明，该重组蛋白检测36份急性血吸虫病患者血清rSj14-3-3抗体，阳性率为81％。与12份华支睪吸虫感染者血清未见交叉反应, 32份健康人血清假阳性反应率为9.3％。以原核表达的rSj14-3-3为抗原，间接ELISA检测，36份急性血吸虫病患者血清的 rSj14-3-3 抗体阳性率为88.9％；与12份华支睪吸虫感染者的交叉反应率为16.7％, 32份健康人血清假阳性反应率为12.5％，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 在毕赤酵母菌中成功表达了Sj14-3-3，培养上清中产物丰度较高，且免疫反应性良好。     

重组白细胞介素-4增强日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗诱导小鼠的保护力

目的?摇探讨重组白细胞介素－4（IL-4）真核表达质粒增强日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗对小鼠的免疫保护效果。 方法 将小鼠IL-4 基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1以构建小鼠重组IL-4表达质粒， 并联合日本血吸虫组织蛋白酶B的表达质粒DNA (VR1012-Sj31)肌注免疫小鼠，设重组IL-4表达质粒、组织蛋白酶B表达质粒和2种空载体质粒对照组。免疫组化检测IL-4和组织蛋白酶B在小鼠肌细胞内的表达，末次免疫3周后攻击感染，用减虫率及减卵率表示保护力。 结果 重组IL-4和组织蛋白酶B DNA均在小鼠肌细胞表达，重组IL-4和组织蛋白酶B DNA联合免疫小鼠，产生43.2% 的减虫率和76.6% 的减卵率，与组织蛋白酶B DNA单独免疫相比差异有显著性（P<0.01，P<0.05 ）。 结论 重组IL-4 能提高日本血吸虫组织蛋白酶B 核酸疫苗的抗血吸虫保护力作用，具有佐剂的免疫效应。     

日本血吸虫天冬酰胺酰基内肽酶编码基因表达及诊断应用

目的克隆和表达日本血吸虫天冬酰胺酰基内肽酶（Sj32）,探索该重组抗原在动物血吸虫病诊断方面的应用潜能。方法用PCR法从Sj32前体编码基因中克隆编码成熟体的基因片段,以pET-28（a）为表达载体,用大肠埃希菌表达,制备重组抗原（rSj32）;应用ELISA方法检测待检血清,并比较rSj32、日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）以及重组诊断抗原rSj23对人工感染兔、小鼠及水牛血吸虫病的检测效果。结果成功表达了Sj32成熟体,表达产物rSj32的分子量为41 kDa,可用H is柱纯化,得率约为68.8 mg/L培养物。用rSj32检测人工感染兔、小鼠和水牛血清以及对照兔、小鼠和水牛血清,特异性分别为100.0%、96.7%和96.9%,敏感性分别为88.9%、85.0%和71.8%,该抗原对牛血清的敏感性略低于SEA和rSj23,其余检测结果三者相比无显著差异。结论rSj32在诊断动物血吸虫病方面具有研究和应用价值。     

应用重组信号蛋白14-3-3间接ELISA诊断日本血吸虫病

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3与成虫抗原(SjAWA)间接ELISA法分别检测51份急性和49份慢性日本血吸虫病患者和50份正常人血清,以上血清标本同时用SEA致敏的间接血凝试验(SEA-IHA)检测。再以3种方法检测30份华支睾吸虫感染者、24份卫氏并殖吸虫感染者和31份钩虫感染者血清,分析其交叉反应性。结果51份急性和49份慢性血吸虫病患者血清的rSj14-3-3抗体阳性率分别为98.0%和91.8%;SjAWA的检出率分别为96.1%和90.0%;IHA的阳性率分别为98.0%和93.9%。经统计学分析,以上结果无显著性差异(P>0.05)。Sj14-3-3间接ELISA、SjAWA间接ELISA和SEA-IHA对于30份华支睾吸虫感染者的交叉反应性分别为13.3%、20.0%和16.7%,24份卫氏并殖吸虫感染者分别为8.3%、12.5%和12.5%,31份钩虫感染者分别为12.9%、16.1%和12.9%。经统计学分析结果也无显著性差异(P>0.05)。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法诊断日本血吸虫病,具有高度的敏感性和特异性,可用于血吸虫病的免疫诊断。     

日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3的制备及其特性分析

目的制备可溶性重组日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3（rSj14-3-3）,并研究其免疫学特性。方法采用反转录聚合酶链反应方法从日本血吸虫成虫mRNA中制备Sj14-3-3基因cDNA片段,将此cDNA片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-3的谷胱甘肽还原酶的基因下游,构建重组表达质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3。重组质粒转化大肠埃希菌BL21,转化子细菌采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导,表达产物经SDS-PAGE以观察重组GST-Sj14-3-3表达情况。GST-rSj14-3-3经凝血酶消化后,经过Glutathione Sepharose-4B胶亲和层析制备纯化的rSj14-3-3。rSj14-3-3免疫家兔制备免疫兔血清,经免疫印迹试验分析rSj14-3-3免疫原性和反应性。结果日本血吸虫江苏株Sj14-3-3蛋白基因编码序列被成功克隆,开放阅读框的DNA序列与基因库中的登录序列同源性为99.08%。构建的含Sj14-3-3蛋白基因的重组表达质粒经IPTG诱导能表达分子量约为55 kDa的融合蛋白,融合蛋白经凝血酶切割和亲和层析获得纯化的rSj14-3-3。rSj14-3-3能诱导家兔产生高效价的特异性抗体,该抗体可识别重组和天然的14-3-3蛋白。结论本研究成功制备了可溶性rSj14-3-3,其具有良好的免疫原性与反应性。