黄芩甙体外诱导大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞的分化

背景：已有实验表明,骨髓基质细胞具有分化为骨骼、神经干细胞及造血干细胞的巨大潜能,而黄芩甙具有诱导细胞分化的作用。 目的：探讨黄芩甙体外诱导骨髓基质细胞分化为神经干细胞的可能性。 方法：分离培养Wistar纯系大鼠骨髓基质细胞,并将分离的骨髓基质细胞分为实验组和对照组,对照组不干预,实验组用黄芩甙(350~400 μmol/L)诱导,2组的培养环境相同。持续诱导6 d后选取生长良好的细胞进行蛋白质印迹和反转录PCR(RT-PCR)法检测。 结果与结论：黄芩甙诱导 7 d后,骨髓基质细胞形成较典型的神经细胞形态。诱导前骨髓基质细胞不表达神经细胞标记蛋白mRNA和蛋白;诱导 6 d表达神经细胞标记蛋白和mRNA;对照组不表达神经细胞标记蛋白和mRNA。证实黄芩甙在体外可诱导成年大鼠骨髓基质细胞分化为神经样细胞。     

骨髓基质细胞对神经-干细胞分化为神经元的影响

采用细胞共培养方式和免疫化学染色方法,研究骨髓基质细胞对神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞的影响.实验发现,体外培养的中脑神经干细胞在与成年大鼠骨髓基质细胞共培养7 d后,在神经干细胞后代中神经元比例可达38.6%±10.8%,明显高于自然分化组20%,提示骨髓基质细胞提供的微环境可明显提高神经干细胞后代中神经元的比例.     

骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化

背景：近年来研究发现,神经营养因子在骨髓间充质干细胞的分化中发挥重要作用。目前脑组织中具有再生能力的神经干细胞在体外是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用还未见报道。 目的：观察大鼠间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子与神经干细胞共培养两种诱导条件下体外分化成多巴胺能神经元的能力。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分2组培养,一组细胞应用胶质细胞源性神经营养因子单独诱导,另一组细胞与已培养成球的神经干细胞共培养进行诱导,共培养之前行Brdu标记。诱导3 d后以免疫组织化学法检测各组贴壁细胞神经元特异性标志物神经原纤维和多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶的表达,观察间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：胶质细胞源性神经营养因子单独诱导组间充质干细胞在诱导24 h后胞体回缩呈锥形,突起延长且数量增多,有神经元样形态,且细胞间相互连接成网络状,3 d后部分细胞表达神经原纤维,其中少部分同时表达酪氨酸羟化酶。与神经干细胞共培养组神经干细胞球很快解离,迅速贴壁,共培养的贴壁细胞大量增殖且多呈神经元样,胞体细长多突起,相互间连接成网,多数贴壁细胞分别单独表达神经原纤维和酪氨酸羟化酶,少数细胞可见Brdu/神经原纤维,Brdu/胶质纤维酸性蛋白,Brdu/酪氨酸羟化酶双标阳性。提示间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子、神经干细胞存在的情况下可定向转化为神经元,并有向多巴胺能神经元分化的可能。在该实验条件下胶质细胞源性神经营养因子效果好于神经干细胞。     

骨髓基质细胞对神经干细胞分化为神经元的影响

采用细胞共培养方式和免疫化学染色方法 ,研究骨髓基质细胞对神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞的影响。实验发现 ,体外培养的中脑神经干细胞在与成年大鼠骨髓基质细胞共培养 7d后 ,在神经干细胞后代中神经元比例可达 38.6 %± 10 .8% ,明显高于自然分化组 2 0 % ,提示骨髓基质细胞提供的微环境可明显提高神经干细胞后代中神经元的比例。     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景：细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段。 目的：通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化。 方法：取已自然退变的第6代髓核细胞与生长良好的第4代骨髓间充质干细胞按不同比例(75∶25,50∶50和25∶75)体外共培养7 d,单独髓核细胞(100∶0)与单独骨髓间充质干细胞(0∶100)分别作为阳性对照和阴性对照。 结果与结论：RT-PCR检测显示共培养组(75∶25和50∶50)蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组(100∶0),吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组(75∶25和50∶50)胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组(100∶0)。共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多。提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换。     

施万细胞对骨髓基质干细胞向神经组织细胞分化诱导的作用

背景：骨髓基质干细胞具有向神经组织细胞分化的多潜能特性。以往实验以化学试剂作为诱导剂加入细胞培养液中,在体外成功地诱导出神经组织细胞。 目的：观察大鼠施万细胞和骨髓基质干细胞体外共培养后,骨髓基质干细胞能否被诱导向神经组织细胞分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-09/2008-10在南通大学医学院组织学与胚胎学教研室及江苏省神经再生重点实验室完成。 材料：SPF级新生1~3 d龄SD大鼠用于制备施万细胞,SPF级成年雄性SD大鼠用于制备骨髓基质干细胞,动物均由南通大学实验动物中心提供。 方法：将传2代培养的骨髓基质干细胞和施万细胞分别以1×105和1×106的密度接种于transwell双层6孔细胞培养板的皿底和板底,两种细胞间隔以PET膜,其膜孔径为0.4 μm,于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中进行非接触性共培养14 d。另外,将施万细胞培养上清作为条件培养基,培养骨髓基质干细胞14 d。 主要观察指标：光镜下观察共培养后骨髓基质干细胞的形态变化;MTT检测共培养前后骨髓基质干细胞的活性;免疫荧光染色鉴定共培养后骨髓基质干细胞S-100蛋白的表达,流式细胞仪测定S-100蛋白阳性率;免疫荧光染色检测条件培养基培养后骨髓基质干细胞S-100,P75,GFAP的表达。 结果：共培养后的骨髓基质干细胞形态发生改变,原来宽大扁平的胞体开始收缩,细胞胞体呈梭形,部分细胞类似施万细胞呈线性排列。共培养前后及条件培养基培养后,骨髓基质干细胞的活力无明显差异(P > 0.05)。共培养14 d后,骨髓基质干细胞表达施万细胞表面标记S-100蛋白,阳性率达(22.54±2.36)%。条件培养基培养14 d后,骨髓基质干细胞表达施万细胞表面标记S-100蛋白,P75,GFAP。 结论：施万细胞分泌因子可以诱导部分骨髓基质干细胞向神经组织细胞分化,并表达施万细胞表面标记。     

小鼠非黏附骨髓间充质干细胞移植到缺血性脑损伤部位向神经元样细胞的分化**

背景：小鼠非黏附骨髓间充质干细胞在体外可以不断形成成纤维细胞集落形成单位,并且可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,表现出一定的多分化潜能。 目的：探讨小鼠非黏附骨髓间充质干细胞移植到缺血损伤脑内后分化为神经细胞的能力。 方法：取β-Gal转基因小鼠,分离双侧股骨、胫骨,全骨髓法分离总骨髓细胞,采用反复转移非黏附的骨髓细胞培养法收集纯化后的第5代非黏附骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度为1×1012 L-1备用。两组C57BL/6J小鼠均建立大脑中动脉阻塞模型,造模后7 d,细胞移植组将第5代非黏附骨髓间充质干细胞悬液3 μL定向移植到小鼠脑损伤处,模型组注射等量生理盐水。移植8周后观察供体细胞在缺血脑内微环境中的存活、分布及分化能力。 结果与结论：LacZ组织化学染色发现,8周后供体细胞仍可以表达β-Gal蛋白,在缺血侧供体细胞能够存活。免疫组织化学单染和双染后发现,在缺血模型的坏死区及坏死边缘区均可检测到β-Gal阳性的供体细胞,部分细胞还同时表达神经细胞特异性蛋白NeuN及神经胶质细胞特异性标记GFAP。提示小鼠非黏附骨髓间充质干细胞在缺血动物模型的脑内能够存活、迁移,部分细胞还能分化为成熟的神经元样细胞或神经胶质细胞,参与脑损伤修复。     

预诱导与全反式维甲酸并脑源性神经营养因子体外诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：骨髓基质干细胞可定向诱导分化为神经元样细胞,但目前培养的方法尚不统一。 目的：采用预诱导与全反式维甲酸和脑源性神经营养因子为培养体系,拟在体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-12/2008-06在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠2只,由新疆医科大学动物试验中心提供。 方法：采用贴壁法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,经反复传代细胞逐渐纯化。取生长状态良好的第3代骨髓基质干细胞,按8×107 L-1密度接种后,改换含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子的神经干细胞培养体系进行预诱导,48 h后去除预诱导液,加入含10 μg/L脑源性神经生长因子、1 μmol/L全反式维甲酸的神经干细胞培养体系定向诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞。以未诱导的骨髓基质干细胞作为对照。 主要观察指标：流式细胞仪检测第3代骨髓基质干细胞表面标志的表达,诱导后免疫荧光染色和流式细胞仪检测巢蛋白阳性的表达,免疫荧光染色鉴定神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果：第3代骨髓基质干细胞CD29,CD44表达率分别为97.1%,99%,CD45表达率为0.5%,CD34呈阴性表达。预诱导48 h后巢蛋白阳性率为24%,而对照组仅为4.6%。诱导48 h后,巢蛋白染色呈阳性,并可见大量神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞出现;对照组均呈阴性表达。 结论：神经干细胞培养体系联合全反式维甲酸与脑源性神经生长因子,可在体外高效、稳定地诱导骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞,并进一步向神经元和神经胶质细胞方向分化。     

猫骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的实验研究

目的观察猫骨髓基质细胞体外培养及诱导分化情况。方法从猫的骨髓中分离得到骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal cells．BMSC），在体外给予神经干细胞培养基培养，增殖后用分化诱导因子(维甲酸，Retinoic acid，RA)进行诱导分化．倒置相差显微镜下观察活细胞及免疫细胞化学染色情况。结果猫骨髓基质细胞在体外培养中胞体增大，镜下可见丰富的胞浆颗粒，继之出芽，贴壁生长，可形成克隆团，同时可传代培养。这些具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达神经干细胞特异性抗原nestin，而且能分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞。结论猫骨髓基质细胞具有干细胞特征，在合适的条件下可扩增、形成克隆并诱导分化出神经胶质细胞和神经元特征细胞，它们可考虑作为神经系统功能缺失细胞移植治疗的种子细胞来源。     

骨髓间充质干细胞神经分化的体内外研究

目的研究骨髓间充质干细胞在体内外向神经细胞分化的潜能。方法(1)分离培养：从水囊引产胎儿的四肢骨中分离培养骨髓基质细胞，再通过贴壁方法将间充质干细胞从骨髓来源的单个核细胞中分离出，利用流式细胞仪进行间充质干细胞免疫表型测定。(2)体外分化观察：将间充质干细胞在二甲基亚砜(DMSO)和丁羟茴醚(BHA)中作用5h后，行神经元特异性烯醇化酶、神经微丝等免疫组化染色。(3)体内分化观察：将用5一溴脱氧尿核苷(BrDU)标记的间充质干细胞通过立体定向的方法移植于顶叶皮质区，然后再行烯醇化酶、神经微丝及胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色。结果(1)生物学特性：间充质干细胞贴壁生长，细胞表现为梭形细胞形态，骨髓来源的间充质干细胞CD34、HLA—DR的表达为阴性，而CD44、CD29、CD13的表达为阳性。(2)体外分化：间充质干细胞在体外被DMSO／BHA处理后，胞浆向细胞核方向收缩，形成一个收缩的胞体，外周是细胞膜的突起，呈现出典型的神经元表型，并且免疫组化染色呈现神经元特异性烯醇化酶及神经微丝染色阳性。(3)体内分化：间充质干细胞被立体定向移植后，在移植部位可见BrDU染色阳性的细胞团，同时可见BrDU阳性细胞迁移到周围宿主的皮质中。免疫组化染色显示，在移植物中及邻近宿主皮质中的移植细胞呈神经元标记烯醇化酶染色阳性，星形细胞标记胶质纤维酸性蛋白染色阳性。结论问充质干细胞有能力分化为非间充质细胞，特别是神经元。     

脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力*☆

背景：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞具有很多相似的生物学特性。 目的：比较脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞与受损PC12细胞分别共培养后定向分化能力的差异。 方法：分别分离培养脂肪组织来源和骨髓组织来源的基质干细胞,取第5代细胞进行实验,2种细胞分别与正常或受损PC12细胞培养上清液共培养,或仅单独培养。 结果与结论：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞均表达较高水平的CD44和CD29,而后者表达的CD45、CD56在前者几乎未检测到。单独培养的2种细胞均表达较高水平的Nanog、Oct4、Sox2,不表达神经元特异性烯醇酶。其中经受损PC12细胞干预的2种细胞Nanog、Oct4、Sox2表达水平显著降低,而脂肪基质干细胞中神经元特异性烯醇酶阳性细胞数更多,提示受损PC12细胞对于脂肪基质干细胞可能具有更强的诱导分化作用。     

人骨髓间充质干细胞移植老年性痴呆大鼠认知能力和海马超微结构的变化

背景：因发病机制不明,目前尚无治愈老年性痴呆的有效方法。现临床上主要是采用药物治疗,而骨髓间充质干细胞的替代治疗尚处于基础研究阶段,其海马移植后对老年性痴呆认知能力的影响未见报道。 目的：探讨人骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆大鼠认知能力和海马超微结构的影响。 方法：老年雄性Wistar大鼠30只,制备自然衰老痴呆模型,造模后随机分为3组,选取双侧海马为移植区,分化细胞移植组注射定向神经细胞诱导分化的人骨髓间充质干细胞悬液4 μL(2×105个细胞),干细胞移植组注射等量常规培养的人骨髓间充质干细胞,模型组注射等量生理盐水。通过Y迷宫试验测定大鼠的学习、记忆能力,透射电镜观察海马区超微结构。 结果与结论：与移植前大鼠学习、记忆分数比较,移植后12周模型组均显著下降(P < 0.01),干细胞移植组均有所提高(P > 0.05),分化细胞移植组均显著提高(P < 0.01)。移植后12周与模型组比较,干细胞移植组、分化细胞移植组大鼠学习、记忆分数均显著提高(P < 0.01)。电镜观察模型组大鼠海马区神经细胞可见明显损伤,干细胞移植组损伤减轻,分化细胞移植组多数神经细胞结构正常。证实骨髓间充质干细胞移植可以提高老年性痴呆大鼠的认知能力,且定向神经诱导分化的骨髓间充质干细胞移植治疗效果优于未分化的骨髓间充质干细胞,提示骨髓间充质干细胞减少海马组织神经细胞变性坏死可能是其改善老年性痴呆大鼠认知功能障碍的作用机制之一。     

全反式视黄酸诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。 目的：探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。 方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4 μmol/L全反式视黄酸预诱导24 h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24 h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。 结果与结论：骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示：全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16 h可见明显的扩增条带,24 h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

猫骨髓源性神经干细胞诱导分化的实验研究

目的探讨猫骨髓分离培养、诱导分化神经干细胞的可行性。方法无菌条件下行骨穿,梯度密度离心获取猫骨髓基质细胞,以“神经干细胞培养基”培养,用分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果猫骨髓基质细胞在相应培养条件下能在体外培养中增殖、分化,克隆形成细胞球(或称“神经球”),这些细胞球能表达神经干细胞特异性抗原nestin,而且能进一步诱导分化出胶质样细胞和神经元样细胞,免疫细胞化学检测可见有胶质源性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原表达。结论猫骨髓基质细胞在一定条件诱导下可分化成神经胶质样和神经元样细胞。     

电针联合骨髓基质细胞移植对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响

背景：研究认为骨髓基质细胞在损伤、缺血的脑脊髓组织中定向神经分化与损伤局部的微环境变化有关,特别是神经营养因子的诱导作用。课题组前期实验已证实,针刺可以通过增加各种细胞因子及营养因子的表达,促进神经的再生及修复。 目的：观察电针联合骨髓基质细胞移植对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2005-03/2006-07在哈尔滨医科大学细胞生物实验室完成。 材料：健康纯系SD大鼠80只,取8只用于骨髓基质细胞的分离培养,剩余72只随机分为4组：空白对照组、细胞移植组、电针组、联合组,18只/组。KWD-808II型脉冲电针仪由江苏武进第三无线电厂生产。 方法：取体外分离培养的第3代骨髓基质细胞,移植前72 h行BrdU标记,调整细胞浓度为1×1011 L-1备用。4组大鼠均建立脊髓损伤模型,造模后细胞移植组将骨髓基质细胞悬液缓慢注入到脊髓损伤临近区域的灰白质交界处,总细胞数6×105个;空白对照组同法注射等量磷酸盐缓冲液;电针组于造模成功后24 h采用脉冲电针仪进行夹脊电针治疗,在距损伤处上下端两个椎体的棘突间隙旁开距中线3.0~4.0 mm处取穴,针刺20 min,1次/d;联合组行骨髓基质细胞移植+夹脊电针治疗。 主要观察指标：移植后 3,7,14 d,应用联合行为评分评估大鼠脊髓损伤后神经功能的改善状况;免疫双标法检测BrdU标记的骨髓基质细胞胶质纤维酸性蛋白、神经元烯醇化酶的表达。 结果：损伤后3,7,14 d与空白对照组比较,细胞移植组、电针组、联合组联合行为评分均有显著性差异(P < 0.05,0.05,0.01);联合组神经功能恢复情况明显优于细胞移植组、电针组(P < 0.05);而细胞移植组、电针组之间比较无明显差异(P > 0.05)。与空白对照组相比,细胞移植组、电针组损伤区脊髓结构相对较完整,联合组脊髓结构更加完整,骨髓基质细胞移植的组织内可见 BrdU标记细胞在损伤区及其周边区明显聚集并存活;移植后14 d细胞移植组神经元烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率分别分7.2%和1.5%,联合组阳性细胞率分别为7.9%和2.1%。 结论：骨髓基质细胞移植后可在宿主体内存活,电针可以促进骨髓基质细胞向神经细胞的分化,电针与骨髓基质细胞移植联合应用可以明显改善脊髓损伤大鼠的运动及感觉功能。     

体外大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞等不同组织细胞多向分化的潜能。方法从SD大鼠股骨骨髓中获得间充质干细胞,原代培养后1∶2传代,传至第5代后分为普通传代培养组、神经细胞诱导组、成骨细胞诱导组和脂肪细胞诱导组。倒置相差显微镜下观察各组细胞生长情况、形态变化以及矿化结节和脂肪细胞的形成;流式细胞检测第5代大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD31、CD34、CD45;免疫组织化学检测普通传代培养组和神经细胞诱导组细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶等神经细胞相关蛋白的表达情况。结果大鼠骨髓间充质干细胞呈贴壁生长,细胞扩增至第5代时形态趋于一致,呈梭形。大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29(99.83%)、CD44(99.77%)、CD90(99.86%)均呈阳性表达,CD31(0.83%)、CD34(1.78%)、CD45(2.90%)无表达。在体外,普通传代培养细胞仅巢蛋白呈阳性表达;由神经细胞诱导的细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,且形态类似神经细胞;由成骨细胞诱导的细胞质内可见矿化结节形成;由脂肪细胞诱导的细胞质内出现多个猩红色呈簇状的脂肪滴。结论大鼠骨髓间充质干细胞易于提取、纯化和扩增,可于体外自发表达神经干细胞标志蛋白,并可通过诱导向神经细胞、成骨细胞及脂肪细胞分化。提示骨髓间充质干细胞不仅具有多向分化潜能,而且可能具有自发向神经干细胞分化的特性。     

新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化

背景：诱导分化的骨髓间充质干细胞或髓核细胞移植都存在一定的局限性,抑制自体髓核细胞的退行性变有望成为未来治疗椎间盘退变的有效方法。 目的：通过建立骨髓间充质干细胞和髓核细胞分层共培养模型,观察骨髓间充质干细胞对髓核细胞分化的影响。 方法：取传至第4代的骨髓间充质干细胞,分为2组：新式分层培养组将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell小室,膜孔0.4 μm,其与骨髓间充质干细胞比例为1∶1;传统分层培养组同法将髓核细胞接种于带有挂臂的Transwell小室。同时设立单独髓核细胞培养组,各组均培养7 d。免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原的表达,35S放射标记渗入放免定量检测蛋白多糖的合成。 结果与结论：与单独髓核细胞培养组比较,传统分层培养组、新式分层培养组Ⅱ型胶原阳性细胞数、蛋白多糖合成量均明显增加(P < 0.05,P < 0.01),且新式分层培养组增高幅度大于传统分层培养组(P < 0.05)。提示骨髓间充质干细胞与髓核细胞接触共培养后,能显著增加髓核细胞分化增殖和特征性物质的表达,且新式分层培养环境优于传统分层培养。     

构建兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型

背景：目前尚缺乏诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞转化的体外模型。 目的：建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的体外模型,为髓核细胞体内移植培养种子细胞提供实验依据。 设计、时间及地点：对比观察,于2008-08/2009-03在青岛大学医学院附属医院骨科研究所和中心实验室完成。 材料：8周龄新西兰大白兔2只用于兔髓核细胞的分离培养;人椎间盘髓核组织为术中取自16岁先天性脊柱侧弯患者T12L1、L1,2椎间盘髓核组织,患者家属知情同意。人骨髓间充质干细胞株为广州赛业生物科技有限公司产品。 方法：将人骨髓间充质干细胞和兔髓核细胞新式分层共培养(应用去掉挂臂、膜孔为0.4 μm的小室,膜底与贴壁细胞相接触,膜上下两种细胞比例为50%∶50%)7 d,同时设立传统的分层培养(带有挂臂的小室)组、单独人骨髓间充质干细胞培养组和髓核细胞培养组为对照。 主要观察指标：反转录-聚合酶链反应和Western blot检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达。 结果：传统分层培养组及单独人骨髓间充质干细胞培养组不表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。新式分层培养组、单独髓核细胞培养组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达均高于传统分层培养组、单独人骨髓间充质干细胞培养组(P < 0.01)。新式分层培养组与单独髓核细胞培养组比较及传统分层培养组与单独人骨髓间充质干细胞培养组比较,差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：新式分层培养人骨髓间充质干细胞能较高的表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,接近椎间盘未退变人的髓核细胞表达水平,表明成功建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型,为椎间盘退变的细胞治疗奠定了基础。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的：已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。 方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。 结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。     

三维共培养兔髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞分化*☆

背景：在椎间盘组织工程研究领域,种子细胞主要有髓核细胞与骨髓间充质干细胞。髓核细胞来源有限,取材不便,增殖能力差,体外培养困难。 目的：利用海藻酸盐微球模拟的三维环境下,将兔髓核细胞与骨髓间充质干细胞共培养,观察骨髓间充质干细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行。 材料：4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心。 方法：应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,应用Ⅱ型胶原酶消化法及贴壁法分离培养兔椎间盘髓核细胞。取传至第3代骨髓间充质干细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选后,分为2组：单独培养组将转染后的骨髓间充质干细胞单独培养,共培养组将其与髓核细胞按1∶1比例于海藻酸盐凝胶微球中进行共培养。共培养14 d后,溶解海藻酸盐凝胶珠,通过流式分选收集骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：利用RT-PCR法和Western blot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达。 结果：共培养14 d后,共培养组有Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA及蛋白的表达,而单独培养组均呈阴性表达。 结论：通过三维共培养,兔椎间盘髓核细胞能够在体外诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞方向分化。