真核过表达载体共转染3个胰岛发育关键基因在小鼠胎肝细胞内的表达

背景:大量文献表明,向肝脏细胞引入一个多个胰岛发育的关键因子(如Pdx1、MafA及Ngn3)可以使肝细胞向胰岛细胞的方向进行转化。目的:构建以pcDNA3.1(+)为骨架的质粒载体并共同转染胰十二指肠同源框蛋白(Pdx1)、神经源素3(Ngn3)及V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)至小鼠胎肝细胞并检测其表达情况。方法:以基因组或小鼠胰腺cDNA为模板扩增Pdx1、MafA及Ngn3三个目的基因,应用分子生物学技术,将3个目的片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中,构建小鼠系列真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafAORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3ORF通过Lipofectamine2000介导的脂质体转染小鼠胎肝细胞系BNLCL.2,用反转录PCR以及间接免疫荧光法检测3个目的基因的表达情况。结果与结论:目的基因克隆正确,反转录PCR,间接免疫荧光法证实了脂质体转染后小鼠胎肝细胞中有Pdx1、Ngn3以及MafA的表达。结果表明,真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafAORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3ORF可成功构建,并能够将Pdx1、Ngn3以及MafA三个基因转至小鼠胎肝细胞进行表达。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的构建含有乙型肝炎病毒(HBV)X基因的真核表达载体,并对其表达进行鉴定。方法用聚合酶链反应(PCR)方法扩增X基因序列,对pcDNA6(+)载体及X基因PCR产物双酶切并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HBV X基因真核表达载体pcDNA6(+)-HBx。以多聚乙烯酰胺(PEI)法将其转染到HepG2细胞,Western Blot鉴定目的蛋白。结果 pcDNA6-HBx酶切后,琼脂糖电泳可见到HBx基因片段,经序列测定其含有完整的X基因片段;Western Blot结果显示pcDNA6(+)-HBx能在HepG2细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA6(+)-HBx,并能在HepG2细胞中表达X蛋白,为进一步研究HBV X基因与慢性乙型肝炎及肝癌的关系提供便利条件。     

有利于创伤修复愈合的人血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的真核表达质粒pcDNA3-VEGF.方法采用PCR技术和DNA重组技术,将编码人VEGF的cDNA序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)上,挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.结果从HepG2细胞中克隆出VEGF121基因的cDNA片段,该序列由Kozak序列,翻译起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.DNA测序表明,VEGF121基因的cDNA序列正向插入到pcDNA3.1(+)的多克隆位点上.结论本研究获得了VEGF121基因的真核达质粒pcDNA3-VEGF,为进一步研究VEGF的转基因治疗奠定基础.     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

HSV-TK单基因及其与hIL-12融合基因表达载体的构建

目的构建HSV-TK单基因和TK/hIL12融合基因的真核表达载体。方法 PCR扩增质粒pGT60-hIL12中HSV-TK与hIL12治疗基因片段,同时引入pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点,构建HSV-TK单基因及其与hIL12融合基因的真核表达载体。结果 DNA测序分析、限制性双酶切鉴定证实构建的真核表达载体中治疗基因的序列、大小和方向正确。结论成功构建了pcDNA3.1-TK和pcDNA3.1-TK/hIL12真核表达载体,为进一步探索HSV-TK与hIL12基因的协同抗瘤作用提供实验基础。     

肺表面活性物质相关蛋白C真核表达载体的构建及体外表达

目的 克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(SP-C)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/SP-C,并检测其在体外的表达,为SP-C的批量生产提供可靠的方法.方法 提取肺癌手术患者病灶周围正常肺组织总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得SP-C cDNA序列.用NotI和XhoI内切酶双酶切SP-C cDNA序列和质粒pcDNA3.1(+),胶回收后体外连接.酶切和测序后,用脂质体包裹转染人乳腺癌细胞株MCF-7,采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测SP-C的表达.结果 能够正确克隆人SP-C基因并插入至质粒pcDNA3.1(+)中;重组质粒体外转染MCF-7细胞后可以表达SP-C蛋白.结论 采用体外重组技术,成功构建了人SP-C真核表达载体 pcDNA3.1(+)/SP-C,并能在体外表达SP-C,为下一步构建人SP-C乳腺特异表达载体,利用乳腺生物反应器大量生产SP-C奠定了基础.     

小鼠结缔组织生长因子基因克隆及其真核表达载体构建

背景:研究证实结缔组织生长因子在动脉粥样硬化血管平滑肌中呈高表达,构建结缔组织生长因子真核表达载体以特异性上调结缔组织生长因子在血管平滑肌内的表达是进一步通过细胞及动物实验研究其作用机制的基础.目的:克隆小鼠结缔组织生长因子基因、构建其真核表达载体,并在血管平滑肌细胞中瞬时表达.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-09/2008-04在辽宁医学院省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室完成.材料:1个月龄昆明小鼠10只.真核表达载体{pcDNA3.1(+)由辽宁医学院分子生物学实验室保存.方法:以小鼠肾脏总RNA为模板,通过反转录-聚合酶链反应方法获得结缔组织生长因子(CTGF)目的基因,连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定测序,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体.主要观察指标:酶切测序鉴定重组体pcDNA3.1(+)-CTGF.将pcDNA3.1(+)-CTGF转入血管平滑肌细胞,Western观察结缔组织生长因子蛋白表达.结果:酶切、测序鉴定证实成功扩增出小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,Western检测证实,重组体转入血管平滑肌细胞后,细胞内高表达结缔组织生长因子蛋白.结论:成功克隆小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,重组体能在血管平滑肌中表达.     

人紧密连接蛋白claudin-6真核表达载体的构建

目的构建人紧密连接蛋白claudin-6的cDNA真核表达载体。方法应用RT-PCR、T-A克隆、限制性内切酶切及亚克隆等技术将claudin-6基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结果酶切鉴定、PCR扩增以及序列分析表明已经将claudin-6基因全长序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结论获得了人claudin-6基因的全长cDNA片段,构建了claudin-6原核克隆载体和真核表达载体。实验中发现,中国人claudin-6基因的461位点碱基为A,而GeneBank中西班牙人claudin-6基因的461位点碱基为G,说明claudin-6基因461位点可能存在多态性。     

NLRC3真核表达载体的构建及转染

目的构建含基因NLRC3的重组真核载体pcDNA3.1/myc-hisA-NLRC3。方法利用基因重组技术将NLRC3基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA中,经酶切,PCR,测序及Western确定重组体质粒构建成功并转染。结果重组真核载体pcDNA3.1/myc-hisA-NLRC3构建成功。并将重组体转染至hUMSC细胞中并进行单克隆筛选扩增。结论重组真核载体pcDNA3.1/myc-hisA-NLRC3构建成功,并成功转染到hUMSC中,为下一步研究NLRC3的转染研究奠定基础。     

小鼠Cdc14A基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠pcDNA3.1-MYC-细胞分裂周期14A(Cdc14A)真核表达载体,并观察和验证其在真核细胞中的表达。方法将化学合成的目的基因Cdc14A定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定正确后,采用脂质体法转染HEK293细胞,通过Western blot检测细胞内Cdc14A的表达,并检测Cdc14A基因序列。结果 pcDNA3.1-MYC-Cdc14A真核表达载体构建成功,将其转染HEK293细胞48h,提取细胞蛋白,采用Western blot检测到细胞内Cdc14A的表达,并且测序结果与预期结果一致。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A,为研究Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换中的作用奠定了基础。     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受.推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用.目的:构建大鼠Deltal基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达.方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上.利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达.结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的Hindlll和Xbal双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Deltal送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确.转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Deltal的表达显著增高.实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白.     

重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。     

构建pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体及Lefty A的稳定表达细胞系

背景:Leffy基因可能通过拮抗转化生长因子β1,信号通路发挥抗肾纤维化作用.目的:为验证其抗纤维化作用,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeffyA真核表达载体,并建立LeftyA稳定表达细胞系.设计、时间及地点:基因克隆构建,单一样本观察,于2008-04/07在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:人肾小管上皮细胞株购于中国协和医科大学细胞库;真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)由美国纽约州石溪大学SiamakTabibzadeh教授惠赠;Leffy A克隆载体pCMV-SPORT6购自武汉晶赛公司.方法:以pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得Leffy A编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建Leffy A真核表达载体;通过LipofectamineTM2000将此重组质粒转染入人肾小管上皮细胞中,通过Hygromycin筛选挑取阳性表达克隆从而构建Leffy A稳定表达细胞系.主要观察指标:PCR扩增产物电泳鉴定结果.重组质粒的酶切鉴定结果.重组质粒基因测序结果.Leffy A稳定表达细胞系的筛选及其细胞内Leffy A mRNA表达.结果:pCMV-SPORT6经针对人Leffy A基因编码区序列的上下游引物PCR扩增后,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在10 kb条带处出现稍大于1.0 kb的特异性扩增条带,与预期1.1 kb目的片段大小相符.重组质粒分别被Hind Ⅲ、BamH Ⅰ单酶切后所得片段大小一致,均为6.7 kb,与重组质粒理论大小一致;经双酶切后得到大小分别为5.6 kb和1.1 kb的2条片段,与pcDNA3.1/Hygro(+)及Leffy A片段大小相符.将酶切鉴定阳性重组质粒测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现与人Leffy A基因编码区序列完全一致.稳定转染Leffy A重组质粒的人肾小管上皮细胞高表达Leffy A mRNA.结论:pcDNA3.1/Hygro(+)-Leffy A真核表达载体构建成功,并建立了Lefty A稳定表达细胞系.     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达。结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

人FOXC2真核表达载体的构建及稳定转染C-33A细胞系的建立

目的构建人FOXC2真核表达载体,并转染人宫颈癌C-33A细胞,建立稳定转染的细胞系。方法应用PCR方法从人FOXC2克隆中扩增其cDNA编码区序列,并将其构建于pcDNA3.1（-）真核表达载体。经PCR和测序鉴定后,利用脂质体进行宫颈癌C-33A细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达FOXC2的细胞系,通过RT-PCR及Westernblot法检测FOXC2的表达情况。结果成功构建pcDNA3.1（-）/FOXC2真核表达载体,建立稳定转染FOXC2的C-33A细胞系,并鉴定了FOXC2目的基因在C-33A细胞中的过表达。结论FOXC2真核表达载体的成功构建为进一步研究FOXC2基因在宫颈癌中的功能奠定了良好的实验基础。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA4真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA4引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4。结果PCR扩增GRA4基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA4,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

HBV preS2真核载体的构建及其表达

【目的】扩增乙型肝炎病毒（HBV）前S2基因（preS2）,并构建其真核表达载体,为研究HBV树突状细胞疫苗奠定实验基础。【方法】从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBVDNA,用聚合酶链反应技术扩增全长preS2基因,将其克隆到真核载体pcDNA3．1（＋）上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定筛选阳性克隆,构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）preS2,并将其转染巨噬细胞48h后,ELISA检测细胞裂解液中preS2的表达。【结果】从慢性乙型肝炎患者血清抽提的DNA中扩增得到约860bp大小的目的片段,preS2基因片段正确插入pcDNA3．1（＋）载体,得到HBVpreS2真核表达载体pcDNA3．1（＋）-pre2。【结论】成功地构建了舍preS2基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-preS2,并能在巨噬细胞中表达目的蛋白HBVpreS2。     

人上皮细胞黏附分子的真核表达及鉴定

目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒,研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM,转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测对转染后细胞内EpCAM蛋白的表达进行鉴定。结果双酶切鉴定结果表明重组质粒构建成功。免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测结果一致表明,转染后EpCAM基因在HepG2细胞中表达成功。结论成功构建了人EpCAM的真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,为研究高表达人EpCAM的肝癌细胞的功能打下基础。     

人乙酰肝素酶全长编码cDNA的克隆

目的 克隆乙酰肝素酶(HPA)全长编码cDNA并构建其真核表达载体.方法 培养HepG2细胞后,收集细胞,提取HepG2细胞总mRNA,反转录合成cDNA.以cDNA作为模板通过PCR法扩增HPA蛋白全长编码cDNA;构建真核表达载体.结果 所获得的乙酰肝素酶cDNA序列共1632 bp,与已报道的人乙酰肝素酶编码基因全长cDNA序列一致,并构建了以pcDNA3.1(+)为载体的真核表达质粒.结论 本实验克隆出了人乙酰肝素酶编码cDNA序列,并成功构建了真核表达载体.     

家蚕素Ⅱ基因真核表达载体的构建

目的构建（BbxⅡ）基因真核表达载体,为研究家蚕素Ⅱ在哺乳动物细胞中的生物学作用奠定基础。方法以含有BbxⅡcDNA的PUC57质粒为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增BbxⅡcDNA片段。真核表达载体PcD-NA3.1及PCR产物经双酶切后连接,转化大肠杆菌DH-5α感受态菌,获得重组载体PcDNA3.1-Bbx/His,进行酶切鉴定和测序鉴定。结果 PCR获得与预期大小一致约300 bp的特异性DNA,重组载体PcDNA3.1-BbxⅡ/His经双酶切及测序鉴定证实,BbxⅡ基因的cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论成功构建含有家蚕素基因Ⅱ的真核表达载体。