成人骨髓间充质干细胞的体外诱导培养及向脂肪细胞的定向分化

目的：确定人骨髓的间充质干细胞(MSCs)体外培养扩增、培养，向脂肪细胞表型转化的方法，并了解其生物学特性变化。方法：用Percoll分离液(1．073g／ml)分离成人MSCs，传代培养。流式细胞仪检测表面标记物CDl4，CD34，CD45，CD44，VLA—1，HLA—DR和细胞周期，用1—甲基—3—异丁基—黄嘌吟、吲哚美辛、牛胰岛素、地塞米松实现向脂肪细胞的定向诱导分化。油红O染色，光镜下观察橙红色脂滴沉着的细胞比例。结果：分离培养获得贴壁细胞，流式细胞仪检测CDl4，CD34，CD45，HLA—DR阴性，CD44阳性，VLA—1表达微弱。G0／G1期细胞约为86％。诱导72h后出现脂墒，第3周油红O染色示85％以上细胞转变为脂肪细胞。结论：从人骨髓分离、体外诱导培养间充质干细胞，可定向促进向脂肪细胞表型转化。     

大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞的实验研究

骨髓中除了造血干细胞外,还有一类来源于中胚层未分化的骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）,其体外培养增殖迅速,不同条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等多种组织细胞。近来研究发现骨质疏松,激素性骨坏死等疾病中骨髓脂肪细胞形成增加,脂肪细胞来源于脂肪前体细胞,脂肪前体细胞又是由间充质干细胞分化而来。本研究建立体外诱导BMSCs分化为脂肪细胞方法,旨在为骨质疏松,激素性骨坏死,肥胖症等疾病的发病机制及防治药物研究提供细胞模型。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经前体细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分化为神经前体细胞的能力。方法:原代:分离培养、鉴定;传代:在细胞因子和氧化剂作用下进行诱导。形态学观察,免疫细胞化学检测和流式细胞分析。结果:成功进行了BMSCs的原代和传代培养,诱导后有神经前体细胞产生,诱导后5小时平均分化率最高,约为49.79%。结论:BMSCs可进行体外分离、扩增,并能诱导分化为神经前体细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。     

兔骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌细胞的实验研究

目的体外诱导兔骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向心肌细胞分化,进一步证实其多向分化特性.方法分离、培养兔的MSCs,将第5代的MSCs在体外经5-氮胞苷诱导4周后,进行免疫组化鉴定和电镜观察.结果5-氮胞苷诱导MSCs4周,部分细胞表达肌钙蛋白T（troponin T）,电镜观察到肌丝形成.结论MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,在体外经5-氮胞苷诱导可转化为心肌细胞.     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及诱导分化

目的：研究兔骨髓间充质干细胞（Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）的体外分离培养,观察其生长特性并探讨其定向诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径,为种子细胞的选择提供一定的实验基础。方法：乌拉坦麻醉下耳缘静脉空气栓塞处死兔子,无菌条件下取出兔股骨,用percoll液密度梯度离心法+全骨髓贴壁培养法相结合进行体外培养、传代,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞向成骨细胞和成脂肪细胞诱导,14 d后成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶,成脂肪细胞诱导组进行油红O染色。结果：percoll密度梯度离心法＋全骨髓贴壁培养法可成功获得rBMSCs,具有活跃的增殖能力。第3代细胞的生物学特征基本一致,并能定向诱导分化为成骨细胞及成脂细胞。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表达呈强阳性,成脂肪细胞诱导组油红O染色见胞浆内出现大量红染脂滴。结论：percoll密度梯度离心法+全骨髓贴壁培养法可成功分离和培养rBMSCs,其生长稳定,增殖力强,能定向诱导分化为成骨细胞及成脂细胞,可见rBMSCs是组织工程的优良种子细胞。     

骨髓间充质干细胞在心肌细胞诱导下的分化研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同心肌细胞微环境作用下,向心肌样细胞分化能力。方法将心肌细胞与BMSCs分为：接触性、非接触性、对照组联合培养;2周后检测各实验组细胞中,心肌特异性蛋白肌钙蛋白T（cTnT）表达情况。结果免疫细胞化学鉴定：1）接触性联合培养组细胞均表达cTnT;2）非接触性联合培养组细胞均表达cTnT;3）对照组细胞不表达cTnT。     

骨髓间充质干细胞的诱导分化研究

随着组织工程学的不断发展，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）被研究证明可以诱导分化为多种组织细胞．尤其是在骨组织工程中得到了很好的应用．有望成为骨组织工程重要种子细胞来源。     

兔骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (bonemarrowmesenchymalstemcells ,BM -MSCs)向神经元定向诱导分化及分化前后体外培养的条件。方法 :无菌条件下收集兔股骨骨髓 ,用相对密度为 1 0 77的淋巴细胞分离液分离出白膜层细胞群 ,贴壁法筛检其中的MSCs ,用DMEM H条件培养基进行原代及传代培养。分别取 5和 10代的MSCs向神经元定向诱导。诱导后更换为神经培养基继续培养 ,并在 1～ 2 0d用免疫细胞化学方法检测分化细胞的特异性表面标志。结果 :兔骨髓MSCs在DMEM H条件培养基中建立高纯度的细胞培养 ,能够稳定地连续传代达 10代以上。不同代数的MSCs诱导后均表达巢蛋白 (nestin)和神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)。诱导后NSCs在神经培养基中继续存活 2 0d以上 ,但未见扩增。结论 :兔骨髓MSCs能够诱导表达神经元特异性标志 ,且诱导前后的MSCs均可在体外培养条件下存活。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

兔骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性

目的：分离培养兔骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法：通过梯度密度离心法分离兔骨髓基质干细胞,体外培养、扩增,观察细胞的大体形态和超微结构;通过绘制细胞生长曲线、四甲基谷氮唑盐（MTT）实验来研究细胞的增殖能力和代谢活性。结果：兔骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆内有丰富的粗面内质网和线粒体,具有很强的增殖能力和代谢活性。结论：本实验方法取材方便,能较容易地获得大量的兔骨髓基质干细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定

目的建立兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分离、培养和鉴定的方法.方法采用贴壁法培养扩增兔BMSCs,通过形态学观察及流式细胞仪鉴定证实得到的细胞为BMSCs.结果倒置相差显微镜可观察到大量梭形、漩涡状贴壁细胞,流式细胞仪鉴定可见所培养的间充质干细胞高表达其表面标记物CD44,低表达CD14和CD45造血细胞表面标志物,初步证实所培养的细胞为兔BMSCs.结论骨髓贴壁分离法培养间充质干细胞是一种方便快捷、经济有效的培养方式.此种细胞培养方法能够得到较纯化的BMSCs.     

成人骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛β细胞的初步研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化成为胰岛β细胞的可能性。方法采用Percoll分离液和差异贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞，在纤维连接蛋白包被。含有表皮生长因子和血小板源性生长因子BB的低浓度血清（2％FBS）培养液中培养，传代后用碱性成纤维细胞生长因子、B27添加剂、尼克酰胺诱导。放免法检测培养液中胰岛素．双硫腙和免疫细胞化学进行鉴定。并进行体外细胞功能测定。结果细胞诱导第二周逐渐聚集成胰岛样细胞团．开始分泌胰岛素，双硫腙染色成猩红色，免疫荧光显示细胞表达胰岛素，体外葡萄糖刺激胰岛素释放试验阳性。结论成人骨髓间充质干细胞可以在体外一定条件下实现向β细胞转分化。     

诱导人骨髓间充质干细胞向运动神经元分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stemcells,hMSCs）在体外诱导向运动神经元分化的潜能。方法用密度梯度离心法分离hMSCs,在含有10%FBS的DMEM/F12培养基中的培养扩增。将传代后的第1代hMSCs分为诱导组和对照组,诱导组的细胞在完全培养基中加入终浓度为10μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预处理24h后,用0.5μg/mL维甲酸（RA）和200ng/mL音速波状蛋白（shh）联合诱导10d。对照组不加上述诱导剂。光镜下观察其分化过程中hMSCs的形态变化,免疫组化检测诱导前后细胞是否表达神经干细胞特异性标志蛋白,用流式细胞仪检测是否产生运动神经元及在总的细胞数种所占比率,并用流式软件分析结果。结果诱导组hMSCs经诱导后能分化为具有典型神经元形态的细胞,部分细胞表达抗人神经巢蛋白（Nestin）,表达率达到（25.0±4.8）%;流式检测诱导后运动神经元特异性标志蛋白HB9表达,表达率达到（50.0±5.3）%。对照组细胞形态无改变,无Nestin表达,HB9表达小于5%。结论hMSCs在体外条件下能诱导分化为运动神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞修复兔皮肤缺损创面的实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞(MSCs)参与皮肤缺损创面修复重建表皮的可能性,为组织工程化皮肤提供新的种子细胞来源。方法自体来源的骨髓MSCs应用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后,以Ⅰ型胶原为载体植入兔背部左侧全层皮肤缺损创面(治疗组),右侧全层皮肤缺损创面仅植以Ⅰ型胶原作为对照组。于术后6、12天观察创面收缩率,记录愈合时间;术后4、5周切取创面中央再生皮肤组织,行常规病理和BrdU免疫组织化学染色检测,进行对比研究。结果创面收缩率,治疗组>对照组(P<0.05);愈合时间,治疗组<对照组(P<0.05)。常规病理检测治疗组再生皮肤表皮层明显增厚,细胞数目显著增多;免疫组化检测,在治疗组再生皮肤附件毛囊内层以及表皮基底层、棘层可见BrdU阳性标记细胞。结论骨髓间充质干细胞在全层皮肤缺损创面可能分化为表皮细胞参与表皮重建并具有促进创面愈合的作用。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外培养大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）,并进行形态学观察、表面分子标记和多向分化能力的检测鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。结果分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。 CD29、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。     

人骨髓间充质干细胞向Leydig细胞或产类固醇激素细胞体外诱导分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向睾丸Leydig细胞分化,并确定诱导条件。方法将分离培养所获得的第3代MSCs细胞经含黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血小板衍化生长因子(PDGF)及白介素-1α(IL-1α)的诱导液诱导,按诱导液中各因子浓度不同分为A、B、C组和对照组,分别于7d、14d、21d时观察细胞形态变化,并行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫细胞化学染色和免疫荧光染色,检测各组细胞3β-HSD的表达。以人睾酮ELISA试剂盒检测诱导细胞分泌类固醇的功能情况。结果诱导10～14d后,细胞具有Leydig细胞的形态特点;免疫细胞化学染色及免疫荧光染色显示,本研究条件下,随着诱导液中各因子浓度加大及诱导时间延长,诱导细胞3β-HSD表达阳性数和阳性率逐渐增多,以A组浓度及21d为最佳诱导浓度及时间(P<0.05),并且A组诱导21d分泌睾酮量最高(P<0.05)。结论人骨髓MSCs经体外诱导后可以分化为Leydig细胞或产类固醇细胞。