自噬调节药物对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的:探讨自噬调节药物包括自噬激活剂(雷帕霉素)、自噬抑制剂(羟氯喹和3-甲基腺嘌呤)对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和自噬的影响。方法:采用不同浓度雷帕霉素(RAPA)、羟氯喹(HCQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理RPMI 8226细胞,用CCK-8法检测药物对细胞增殖的作用,流式细胞术检测药物作用24 h后细胞凋亡率,应用单丹磺酰戊二胺(MDC)染色观察自噬小体数量,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC-3b和凋亡相关蛋白(caspase-3、PARP和BCL-2)的表达情况。结果:RAPA和HCQ可呈时间及剂量依赖性抑制RPMI8226细胞的增殖,并增加细胞的凋亡,而3-MA无明显抑制细胞增殖作用,也无诱导凋亡作用。MDC染色结果显示,细胞内自噬泡数量随着RAPA浓度的提高逐渐增多,而随着HCQ和3-MA浓度升高自噬泡数量却逐渐减少。Western blot结果显示,RAPA可诱导自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和凋亡蛋白caspase-3及PARP表达上调,但抑制抗凋亡蛋白BCL-2表达;HCQ抑制LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和BCL-2表达,但可上调caspase-3和PARP表达;3-MA可下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达,但对caspase-3、PARP及BCL-2表达均未显示明显影响。结论:RAPA能抑制RPMI8226细胞增殖,诱导RPMI8226细胞凋亡和自噬,HCQ则在抑制自噬和增殖的同时也可诱导凋亡,3-MA可抑制细胞自噬但对细胞增殖和凋亡影响不大。     

雷帕霉素对K562细胞survivin、caspase-3表达及超微结构的影响

目的:探讨雷帕霉素对K562细胞survivin、caspase-3在mRNA水平的表达和对K562细胞超微结构的影响。方法:用不同浓度雷帕霉素处理慢性髓系白血病K562细胞,应用CCK8的方法检测雷帕霉素对K562细胞的增殖抑制率,应用电子显微镜观察K562细胞形态学的改变,应用RT-PCR的方法检测不同浓度雷帕霉素作用K562细胞后survivin,caspase-3在mRNA水平的表达情况。结果:雷帕霉素对K562细胞的增殖有明显的抑制作用;电子显微镜显示,随着雷帕霉素浓度的增高K562细胞的凋亡程度加重;随着雷帕霉素浓度的增高caspase-3在mRNA表达水平上升,而survivin在mRNA水平表达下降。结论:雷帕霉素通过上调caspase-3的水平,可以降低survivin水平而促进K562细胞的凋亡。     

高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的时间节律性及其机制研究

本研究旨在观察高三尖杉酯碱（HHT）作用于K562细胞后不同时间点凋亡率的变化及其机制。HHT10ng／ml作用K562细胞后,用MTT法检测不同时间点的细胞增殖活力,Westernblot法检测caspase-3凋亡蛋白表达;流式细胞术检测BCL-2蛋白表达;应用透射电子显微镜观测细胞自噬。结果表明,HHT10ng／ml处理后的前5d,K562细胞增殖活性逐渐下降,但在第6天以后增殖活性又逐渐上升;同时激活型caspase-3蛋白从第1天至第7天逐渐增高,而在第8天明显降低（P〈0．05）;BCL-2蛋白表达水平则呈现先降低后升高（P〈0．05）的特点。细胞自噬体在HHT作用第8天明显增多。结论：HHT作用后,K562细胞凋亡水平变化呈现先升高后下降的特点,其机制与HHT作用后期K562细胞自噬水平升高有关。     

细胞自噬对高三尖杉酯碱作用K562细胞的影响

目的:探讨高三尖杉酯碱(HHT)单用或与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联用对K562细胞凋亡及自噬的影响。方法:K562细胞在HHT(10 ng/ml)作用下1-8 d,采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用RT-PCR法、Western blot法和透射电子显微镜检测细胞自噬。结果:在HHT作用前期K562细胞凋亡率逐渐升高,而在后期则下降。HHT作用后,K562细胞的Beclin1表达及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值先下降后升高。HHT单用时,激活型caspase-3蛋白表达前期逐渐上升,而在后期下降。与自噬抑制剂3-MA联用组的K562细胞的Beclin1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值持续下降,而激活型caspase-3蛋白表达则逐渐升高。结论:HHT可诱导K562细胞凋亡,但HHT持续作用可诱导K562细胞发生自噬,与3-MA联用则增强HHT的细胞毒作用。     

CPEB4对慢性髓系白血病细胞增殖与凋亡的影响

目的:探索CPEB4在K562细胞中的表达、生物学活性及其可能的分子机制。方法:采用Western blot检测正常白细胞和K562细胞中CPEB4的表达情况;再将过表达质粒pcDNA3.1(+)-His-CPEB4、沉默质粒pPLK+Puro-CPEB4 shRNA电穿孔转染K562细胞,改变CPEB4在K562细胞中的表达量,应用Western blot检测转染效率;最后应用CCK-8和流式细胞术检测不同处理的细胞增殖和凋亡情况,并用Western blot法检测增殖与凋亡标志蛋白(AKT、p-AKT、caspase-3、BCL-2)的表达变化。结果:与正常白细胞相比,K562细胞中CPEB4蛋白表达量较高(P0.01);CPEB4沉默的K562细胞与对照组相比,细胞增殖水平显著增高(P0.001),细胞凋亡数显著减少,AKT、p-AKT、BCL-2蛋白表达水平明显增高,而caspase-3蛋白表达显著降低;CPEB4过表达后的K562细胞增殖减慢(P0.05),细胞凋亡数明显增加,AKT、p-AKT和BCL-2蛋白表达显著降低,caspase-3蛋白表达增高。结论:CPEB4可抑制K562细胞增殖,促进K562细胞凋亡,而AKT、p-AKT、BCL-2和Caspase-3等分子参与调控机制。     

高三尖杉酯碱通过mTOR通路诱导慢性髓系白血病K562细胞凋亡

目的:观察高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)对人CML细胞株K562的增殖及凋亡的影响,并从mTOR通路探索HHT抗CM L效应的作用机制。方法:采用不同浓度HHT或联合mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)处理K562细胞,用CCK-8法检测细胞增殖抑制活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测BCL-6、Caspase-3及mTOR通路相关蛋白的表达水平,RT-PCR法检测BCL-6 mRNA表达水平。结果:HHT可抑制K562细胞的增殖并促进其凋亡,且呈浓度依赖性(r=0.970)。随着HHT作用浓度的增加,mTOR通路相关蛋白表达水平升高(r=0.908),而BCL-6 mRNA及蛋白的表达水平下降(r_(mRNA)=-0.961,r_(protein)=-0.981)。与HHT单用组相比,联用RAPA可显著下调mTOR及Caspase-3的表达,并上调BCL-6表达。结论:HHT可通过激活mTOR通路抑制抗凋亡BCL-6蛋白的表达,进而诱导CML细胞凋亡。     

三氧化二砷对K562/ADM耐药细胞凋亡抑制的逆转作用

目的:研究三氧化二砷(As2O3)诱导白血病K562/ADM耐药细胞凋亡的分子机制。方法:采用MTT比色法检测K562/ADM耐药细胞增殖活性,细胞形态学和annexinV /PI双染色检测细胞凋亡,RT-PCR检测mdr1、bcl-2和caspase-3基因mRNA的表达水平,流式细胞法(FCM)测定P-糖蛋白(P -glycoprotein,P-gp)和bcl-2蛋白表达及caspase-3活性。结果:As2O3显著抑制K562/ADM耐药细胞的增殖;经 As2O3处理后细胞形态上出现典型的凋亡改变,annexinV /PI双染显示凋亡细胞明显增加;mdr1mRNA表达和P-gp合成明显降低,凋亡抑制基因bcl-2mRNA及其蛋白bcl-2表达下调, caspase-3mRNA表达和caspase-3活性显著增强。结论:As2O3诱导K562/ADM耐药细胞凋亡,其主要机制可能为As2O3抑制 mdr1和bcl-2基因表达,逆转耐药白血病细胞因bcl-2和P-gp高表达所介导的凋亡抑制。     

大黄素可能通过Akt-Caspase 3信号通路诱导K562/Adr细胞凋亡

目的:观察大黄素(emodin)对多药耐药白血病细胞株K562/Adr凋亡的影响及Akt-Caspase 3信号通路在其中的作用。方法:采用Annexin V/PI双染的流式细胞术和DNA倍体分析法检测细胞凋亡;Western blot法检测大黄素作用后不同时间段caspase-3前体蛋白、PARA、Akt、p-Akt表达水平的变化。结果:大黄素能够诱导K562/Adr细胞凋亡,并呈量效关系。大黄素作用K562/Adr细胞后caspase-3前体蛋白、Akt、p-Akt、PARA 116 KD表达水平下调,PARP 85 KD表达水平增加,并呈时效关系。结论:Akt-Caspase 3信号通路可能参与大黄素诱导K562/Adr细胞凋亡的过程。     

大黄素对K562细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用

本研究观察中药大黄素（emodin）对人慢性髓系白血病K562细胞株的增殖及凋亡影响,探讨P210融合蛋白和caspase-3激活在其中的作用。采用MTT法、集落形成试验观察大黄素对K562增殖的影响;AnnexinV FITC／PI法、DNA倍体分析及DNA凝胶电泳法检测细胞凋亡;Westem blot检测大黄素作用后不同时间段P210、磷酸化P210、caspase。3前体蛋白及PARP表达水平的变化。结果表明,大黄素能抑制K562细胞增殖,作用48小时的半数抑制浓度（IC50）为38．25μmol/L;Annexin V FITC／PI法、亚二倍体峰（凋亡峰）及DNA片段化检测证实,大黄素能诱导K562细胞凋亡,并呈量效关系。大黄素作用飚62细胞后P210、磷酸化P210、caspase-3前体蛋白表达水平均有不同程度下调,PARP的活性片段85kD表达增加,这些变化呈时效关系。结论：大黄素能够有效抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡。P210磷酸化抑制,P210表达下调和caspase-3激活可能参与了该过程。     

自噬在硼替佐米诱导的肾癌细胞凋亡中作用的研究

目的探讨自噬在硼替佐米诱导的肾癌细胞凋亡中的作用。方法采用MTT检测硼替佐米对人肾癌ACHN细胞增值率的影响;通过Western Blotting检测硼替佐米对人肾癌ACHN细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及自噬相关蛋白LC3表达水平的影响;联用自噬抑制剂3-MA后,MTT检测细胞增殖率,Western Blotting检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平。结果硼替佐米对肾癌ACHN细胞的增殖有抑制作用,并且增加人肾癌ACHN细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平及自噬相关蛋白LC3表达水平,呈一定的浓度依赖性;联用3-MA可增加硼替佐米诱导的肾癌ACHN细胞的增殖抑制作用,并可增加硼替佐米诱导的肾癌ACHN细胞cleaved caspase-3表达水平。结论硼替佐米可诱导肾癌细胞凋亡并诱导肾癌细胞发生自噬,抑制自噬可以明显增强硼替佐米的肾癌细胞毒作用。     

Manumycin对白血病细胞生长及survivin基因表达的影响

目的:观察不同浓度的Manumycin对白血病K562细胞生长及survivin基因表达的影响,初步探讨其诱导细胞凋亡的分子机制.方法:体外培养K562细胞,采用不同浓度的Manumycin(0、0.5、1、2、4、8 μmol/L)掺入细胞,作用48 h后采用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测凋亡率,RT-PCR检测细胞中survivin mRNA表达.结果:MTT法显示,1～8 μmol/L组对K562细胞具有明显的增殖抑制作用.流式细胞术结果显示,1～8μmol/L组均可诱导细胞凋亡(P＜0.01).RT-PCR结果显示1～8 μmol/L组细胞的survivin mRNA水平明显低于空白对照组(P＜0.01).结论:Manumycin可有效抑制K562细胞的增殖,诱导其凋亡,分子机制可能与下调survivin的表达有关.     

5-溴汉防己甲素和柔红霉素对K562/A02细胞凋亡和survivin基因表达的影响

本研究探讨5-溴汉防己甲素(BrTet)联合柔红霉素(DNR)治疗耐药慢性髓系白血病的潜在可能性及其相关机制。采用流式细胞术检测DNR,BrTet或DNR和BrTet联合作用K562/A02细胞48小时后凋亡率情况;采用RT-PCR法检测对照组K562细胞、耐药K562/A02细胞及DNR或(和)BrTet作用于K562/A02细胞48小时后存活蛋白(survivin)mRNA表达水平;采用Western blot法检测各组细胞survivin蛋白表达水平。结果表明:BrTet与DNR联合作用对K562/A02细胞的诱导凋亡率较其余各组显著升高,同时联合用药组K562/A02细胞survivin mRNA和蛋白的表达较空白对照组和单药组下调,K562/A02细胞survivin表达较K562细胞升高。结论:BrTet联合DNR能有效逆转耐药,促进K562/A02细胞凋亡,其机制可能与survivin表达下调有关。     

艰难梭菌毒素A诱导K562细胞凋亡及其机制研究

本研究探索艰难梭菌毒素A(Tcd A)对人慢性髓系白血病细胞株K562细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。采用MTT法检测Tcd A的细胞毒作用,用Hoechst33342染色和流式细胞术观察细胞凋亡,免疫细胞化学法检测BCL-2、BAX蛋白表达水平,比色法检测caspase-3活性。结果表明,Tcd A能明显抑制K562细胞增殖,具有浓度和时间依赖性;荧光染色和流式细胞术检测到细胞凋亡;Tcd A作用后BCL-2蛋白表达下降,而BAX蛋白表达明显增加,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05);caspase-3活性增强,差异有统计学意义(p<0.05)。结论 :Tcd A能明显抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与上调BAX蛋白表达,激活caspase-3有关。     

靶向血管内皮生长因子siRNA对K562细胞凋亡及survivin表达的影响

目的 应用腺病毒介导的血管内皮生长因子(VEGF) siRNA沉默K562细胞中VEGF的表达,观察其对K562细胞凋亡及凋亡抑制基因survivin表达的影响.方法 应用成功构建的携带特异性VEGF siRNA的重组腺病毒(Ad5-VEGF siRNA)感染K562细胞,实验分为3组:实验组(K562/Ad5-VEGF siRNA组)、空载体组(K562/Ad5组)、对照组(K562组).通过RT-PCR法检测细胞内VEGF及survivin mRNA的表达,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF蛋白表达,Western blot法检测细胞survivin蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 实验组细胞VEGF及survivin mRNA表达水平较对照组均有明显降低(P＜0.01),且细胞培养上清中VEGF蛋白表达水平[(1121±15)pg/ml]低于空载体组[(1290±28)pg/ml]和对照组[(1303±28)pg/ml](P＜0.01).Western blot法检测结果显示,实验组survivin蛋白表达水平(0.26 ± 0.11)较对照组(0.74±0.10)也显著降低(P＜0.01).实验组细胞凋亡率与对照组比较明显增加(P＜0.01).结论 应用RNA干扰沉默K562细胞中VEGF基因表达后,survivin的表达也随之降低,同时细胞凋亡率相应增加.VEGF可诱导K562细胞中survivin基因表达,可能是survivin基因表达的上游调控因子.     

2-甲氧基雌二醇对慢性髓系白血病K562细胞Caspase-3及Survivin表达的影响

本研究探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对慢性髓系白血病（CML）K562细胞caspase-3和survivin表达的影响。实验分3组：对照组,培养基中不含2-ME;实验组,分别用1、2、4、8及16μmol／L的2-ME处理K562细胞;阴性对照组,培养液中以不合RNase的灭菌蒸馏水代替K562细胞。应用TUNEL、流式细胞术（FCM）、半定量RT—PCR分别检测K562细胞凋亡率、caspase-3及survivin蛋白及其基因表达水平。结果表明：2-ME在一定的浓度范围内呈剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,与对照组比较差异均有统计学意义（P均〈0．01）,且TUNEL和FCM方法检测的K562细胞凋亡率呈正相关（γ=0．845,P=0．034）。随着2-ME浓度增加,caspase-3蛋白表达量逐渐增加,而survivin蛋白表达量逐渐降低,两者与对照组比较差异均有统计学意义（P均〈0．05）;且caspase-3与survivin蛋白表达量之间呈负相关（γ=-0．956,P=0．001）。随着2-ME浓度增加,caspase-3基因表达量逐渐增加,而survivin基因表达量逐渐降低,两者与对照组比较差异均有统计学意义（p均〈0．01）,且caspase-3与survivin基因表达量之间呈负相关（γ=0．966,P=0．001）。结论：2-ME能够以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,显示了其对CML有潜在的治疗价值。     

高压氧和三氧化二砷对K562细胞增殖抑制及相关机制研究

本研究旨在探讨高压氧联合三氧化二砷(As2O3)对K562细胞增殖、凋亡及低氧诱导因子-1a(HIF-1a)、血管内皮生长因子(VEGF)及caspase-3 mRNA表达的影响。用MTT法检测各组K562细胞在药物作用各时间点(24、48、72 h)的增殖率;AnnexinⅤ/PI荧光标记法检测K562细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR检测K562细胞HIF-1a、VEGF、caspase-3 mRNA的表达。结果表明:与单用As2O3比较,As2O3联合高压氧可使K562细胞的增殖抑制率增加,凋亡作用明显加强,并可明显下调HIF-1a、VEGF的表达,上调caspase-3的表达,两者联用具有协同作用,效果明显优于单用As2O3(P<0.05)。结论:高压氧联合As2O3对K562细胞抑制增殖及加速凋亡的作用优于单独应用As2O3;二者联合后HIF-1a、VEGF mRNA的表达减弱,而Caspase-3 mRNA的表达增强。HIF-1a、VEGF、caspase-3mRNA表达的变化可能是As2O3与高压氧联合产生抗白血病细胞协同作用的分子机制之一。     

高三尖杉酯碱对K562细胞NF-κB和BCL-2蛋白表达的影响

本研究旨在探讨高三尖杉酯碱（HHT）对K562细胞增殖、凋亡及BCL-2和NF-κB蛋白表达的影响。不同浓度HHT作用K562细胞后用MTT法、流式细胞仪、Western blot等方法分别检测细胞增殖、凋亡、BCL-2及NF-κB蛋白表达水平。结果表明,HHT作用48h,浓度依赖性抑制K562细胞增殖,Ic50为43．89rig／ml。HHT10ng／ml作用48h,K562细胞凋亡率明显增高;细胞周期阻滞于G0／G1期;BCL-2和NF-κB蛋白表达水平明显低于对照组（P〈0．05）。结论：HHT对K562细胞有显著的增殖抑制、细胞周期阻滞和凋亡诱导作用,抑制NF-κB和BCL-2表达可能是其抗CML的机制之一。     

高压氧联合阿霉素对白血病K562/A02细胞凋亡的影响

本研究探讨0.2MPa高压氧(HBO)联合阿霉素对白血病多药耐药细胞K562/A02细胞凋亡的影响。利用流式细胞术法和透射电子显微镜检测细胞凋亡和caspase-3表达,用定量qReal-time PCR法检测HIF-1α、BCL-2和BAXmRNA表达水平,运用caspase-8试剂盒检测caspase-8的活性,Western blot法检测P-gp活性。结果表明:0.2MPa HBO联合阿霉素组细胞凋亡率高于ADM组[(47.36±3.87)%vs(28.51±1.09)%],差异有统计学意义(p<0.05)。0.2MPa HBO联合阿霉素组细胞HIF-1αmRNA、P-gp及BCL-2的蛋白水平低于ADM组,差异有统计学意义(p<0.05)。0.2MPa HBO联合阿霉素组细胞的BAX、caspase-3及caspase-8蛋白活性均高于ADM组,差异有统计学意义(p<0.05)。结论 :0.2MPa HBO联合阿霉素可逆转耐药细胞株K562/A02对阿霉素的耐药,提高细胞凋亡率,其机制可能与HIF-1α下调P-gp和BCL-2的表达以及提高caspase活性有关。     

低氧诱导因子抑制剂对白血病细胞株HIF-1α和VEGF表达及诱导细胞凋亡作用的研究

本研究探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5′-hydroxymethyl-2′-furyl)-1-benzylindazole(YC-1)对人急性白血病病细胞低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)和血管内皮因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的调节及诱导细胞凋亡作用。应用DAPI染色检查凋亡细胞的形态;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR检测K562、U937、Jurkat白血病细胞株hif-1α和vegf mRNA表达以及YC-1对U937细胞hif-1α、vegf mRNA表达影响;Western blot检测YC-1对U937细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达,以及BAX、BCL-2、caspase-3蛋白变化,分析YC-1诱导U937细胞凋亡的可能机制。结果表明:在3种白血病细胞株均可见hif-1α和vegf mRNA表达。4μmol/L YC-1处理U937细胞(0、8、16和24小时)后,可见凋亡细胞出现的典型凋亡形态特征;流式细胞术检测的细胞0、8、16和24小时凋亡率分别为(4.87±0.70)%、(27.27±2.00)%、(51.53±2.81)%及(60.5±3.20)%;vegf mRNA表达下调,而hif-1αmRNA表达无明显变化;HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和BCL-2蛋白表达下调,而BAX和caspase-3蛋白表达上调,BAX/BCL-2比率升高并呈时间依赖性(r=0.973,p0.01)。结论:3种白血病细胞株均显示hif-1α和vegf mRNA表达,YC-1可以抑制白血病细胞HIF-1α蛋白表达,进而下调VEGF,并通过上调BAX/BCL-2比率、caspase-3蛋白表达诱导细胞凋亡。     

含扶正解毒汤药血清对白血病K562/A02耐药细胞的抑制作用及初步机制

目的:探讨含扶正解毒汤药血清对白血病耐药细胞株K562/A02的抑制效果及可能的机制。方法:采用M TT法检测含扶正解毒汤药血清对K562/A02耐药细胞的生长抑制率,流式细胞技术测定含扶正解毒汤药血清处理各组K562/A02细胞后的凋亡情况,QPCR法检测BCL-2 mRNA的表达,Western blot方法检测BCL-2蛋白的表达,流式细胞技术测定细胞膜P-gp蛋白的表达。结果:MTT细胞毒实验结果表明含扶正解毒汤药血清具有抑制k562/A02细胞生长的效果,且抑制率呈药物浓度相关性;流式细胞检测结果表明含扶正解毒汤药血清可以诱导k562/A02耐药细胞的凋亡,凋亡率呈药物浓度相关性;Q-PCR结果显示,含扶正解毒汤药血清可以下调K562/A02细胞BCL-2蛋白的表达;流式细胞检测结果表明,含扶正解毒汤药血清可下调K562/A02细胞膜P-gp蛋白的表达。结论:含扶正解毒汤药血清可以促进K562/A02耐药细胞的凋亡,其诱导细胞凋亡的机制可能与抑制BCL-2蛋白和P-gp蛋白的表达有关。