结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan荧光PCR检测的建立

目的对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法。结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果呈典型阳性反应，牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果呈典型阳性反应，对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应。两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝，对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞。对临床样品的检测结果显示，荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞。所建立的方法，全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测，可在5～6h内完成。采用上述荧光PCR方法从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品。     

结核分枝杆菌DNA指纹技术在河南结核病流行病学中的应用

结核分枝杆菌DNA指纹技术是一种用于结核流行病学分析的分子生物学手段，它除能追踪传染源，查证传播途径、筛选结核病易于传播的人群外，还能分析某一地区流行的结核分枝杆菌的群结构特征。本研究利用结核分枝杆菌DNA指纹技术分析2000年河南省内流调获得的结核分枝杆菌野生株，并对其进行了一些统计学分析，以期获得一些新的提示：     

应用DNA探针直接检测结核分枝杆菌DNA

由于ＤＮＡ探针杂交反应特异性高 ,国内外研究者已采用ＤＮＡ探针杂交技术检测结核分枝杆菌。但该检测方法敏感性较低 ,通常采用与聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增相结合的方法。但这样增加了实验的费用和交叉污染的机会。我们在对ＤＮＡ探针与ＰＣＲ结合检测临床标本进行系统研究的基础上 ,发现临床标本简化法处理 ,即ＤＮＡ探针化学发光检测 ,ＤＮＡ损失较少 ,还可提高检测的敏感性 ,现将结果报道如下。材料与方法一、菌种来源受试分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所。二、标本收集结核患者痰标本 2 31份 ,血液标本 85份 ,脑脊液、胸、…     

荧光定量聚合酶链反应技术检测结节病肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA

目的探讨结核分枝杆菌感染在结节病发病中的作用;方法荧光定量聚合酶链反应技术检测22例结节病肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA;结果22例肺泡灌洗液中9例检出结核分枝杆菌;结论结核分枝杆菌感染可能是结节病病因之一。     

结核分枝杆菌DNA分型技术及其应用

在结核分枝杆菌基因组插入序列中，IS6110是最有特点的插入序列，同时结核分枝杆菌基因组内除IS6110插入序列外。还有多个插入序列和重复元件。如IS1081、PGRS、VNTR、DR等等，利用这些插入序列或重复序列，通过扩增或酶切杂交获得象人体指纹一样的特异带型，即DNA指纹图谱，由此建立的方法就称为DNA指纹技术。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法 根据结核分枝杆菌katG基因主要发生315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果 灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μl,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论：TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG 315位点突变。     

结核分枝杆菌耐药性检测新进展

结核分枝杆菌(MTB)的耐药形势日趋严重,耐药结核病的及时诊断对患者的治疗结局及结核病的控制十分重要.MTB传统的培养及药敏结果回报需时2～3个月,MTB耐药性的快速准确诊断是一个急需解决的问题.本文总结了MTB耐药性检测的传统技术包括罗氏培养及快速培养,并对比分析了其优缺点.综合国内外文献阐述了显微镜观察药物敏感性测定法的研究进展及分子生物学快速诊断技术包括线性探针杂交技术、Xpert MTB/RIF检测技术、基因芯片诊断技术及滚环扩增技术对于MTB及其耐药性检测的最新动态、各种检测方法的适用范围,并对比分析了各种检测方法的优缺点,为临床医师选择快速准确的诊断工具提供最佳的选择.     

实时定量PCR技术检测结核分枝杆菌蛋白编码基因表达水平研究

目的运用实时定量PCR(qRT-PCR)检测66株结核分枝杆菌蛋白编码基因(fbpB,psts1,mpt64)的表达水平,探讨结核分枝杆菌耐药菌株与敏感菌株,北京基因型菌株与非北京基因型菌株的蛋白抗原在转录水平的差异。方法根据GenBank提供的序列,设计特异性引物,扩增目的基因片段,克隆入载体,重组质粒经纯化及梯度稀释,应用qRT-PCR检测基因的表达水平。结果北京基因型菌株psts1基因表达水平与非北京基因型菌株比较差异有统计学意义(t=3.721,P<0.01);耐药菌株mpt64基因表达水平与敏感菌株比较差异有统计学意义(t=3.951,P<0.01)。结核分枝杆菌活菌的扩增曲线呈典型的S型,结核分枝杆菌死菌和非结核分枝杆菌呈水平直线,未检测到荧光信号。结论北京基因型结核分枝杆菌psts1基因的表达量低于非北京基因型,结核分枝杆菌耐药菌株mpt64基因的表达量低于敏感株。     

PCR—SSCP技术快速检测结核分枝杆菌三种基因突变

聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是快速检测基因突变的重要方式之一[1].应用此法对辽宁省90例涂阳患者痰标本分离结核分枝杆菌进行rpoB、rpsL、56例katG基因突变检测,与传统耐药结果比较分析,寻找结核分枝杆菌耐药性与基因突变的关系.     

结核分枝杆菌基因突变检测方法研究进展

结核分枝杆菌全基因组测序工作的完成,为开展结核病基因研究提供了理论基础,对结核分枝杆菌基因突变的研究也成为当前结核病研究领域的热点之一。高分辨率熔解（high resolution melting, HRM）、基因芯片、DNA直接测序等分子生物学新技术的发展和应用,为结核分枝杆菌基因突变研究提供了更有效的方法。现综合国内外近年来的文献,分类介绍应用于结核分枝杆菌基因突变检测的各种方法的原理、应用情况等,同时也对GeneXpert、结核分枝杆菌线性探针（line probe assay,LiPA）、基因芯片等当前比较成熟并有望得到广泛应用的商品化基因突变检测技术进行介绍。     

手术标本中结核分枝杆菌检测及临床意义研究

目的 探讨结核病患者手术切除标本进行结核分枝杆菌检测的临床意义。 方法 应用罗氏培养、液体培养及定量RT-PCR方法检测12例不同化疗疗程后行手术,术中取材的标本中结核分枝杆菌。 结果不同化疗疗程的手术标本中可以应用罗氏培养法及液体培养法检测到结核分枝杆菌,并有病例存在结核分枝杆菌持留菌特征性ICL及ACR的高表达。 结论 手术标本是结核菌培养及持留菌检测的很好材料,对患者术后化疗指导有指导意义。     

结核病分子生物学检测技术研究进展

随着医学科学技术的不断发展,特别是精准诊疗时代的来临,分子生物学检测技术在结核病早期诊断辅助方面受到广泛重视和应用。分子生物学检测技术具有准确、高效、高通量等优点,为结核病的诊疗及疫情的防控带来了新曙光。本文中,笔者综合国内外学者研究成果,阐述了基于核酸扩增试验技术、核酸分子杂交技术、基因测序的结核病检测及药物敏感性分析技术和其他新型结核病检测技术的应用现状及其最新研究进展,以期为结核病的辅助诊断提供参考。     

北京结核菌株分子流行病学的研究

目的　北京结核分支杆菌分子流行病学的研究。方法 (1)使用标准化的RFLP法检测并分析从128位初治患者分离的结核分支杆菌IS6110指纹多态性;(2)对选例患者进行社会人口学和流行病学调查问卷;(3)分析结核分支杆菌IS6110指纹多态性特征与流行病学的关系。结果 (1)根据IS6110指纹特征的同源性,检测的128株结核分支杆菌可基本分为3组,A、B组的菌株间因具有较高的同源性而被称为“北京基因型”菌株,并且此类菌株在检测菌株中所占的比例较高(103/128,80.5%);C组菌株间同源性较低,多态性变化多而被称为“非北京基因型”,仅占19.5%。(2)从较低年龄(<40岁)患者分离菌株的多态性变化,与从较高年龄(>40岁)患者分离菌株多态性变化比较存在差异,提示“北京基因型”菌株不是由于BCG接种而造成的选择性优势。(3)检测菌株的多态性变化与患者结核病接触史、患者长期居住地、菌株药物敏感性情况无明显联系。结论 结核分支杆菌的指纹分析对结核病现代流行病学的研究是一个有用的工具。     

结核杆菌转录组学研究进展

自1998年结核分枝杆菌H37Rv菌株的全基因组测序完成以后,结核杆菌转录组学的研究就变得异常活跃,特别是随着高通量的基因芯片技术应用于结核菌转录组学的研究,结核杆菌转录组学的进展更加迅猛.结核杆菌转录组学研究经历了由体外分离株到巨噬细胞吞噬体内结核杆菌,从结核杆菌在体外的表达到在宿主体内表达,而宿主由以小鼠为模型到以人体为模型的研究过程.由于以动物为模型的便利性,当前结核杆菌转录组学研究以基因突变小鼠为模型或药物作用后的小鼠结核感染模型为主.这些研究为抗结核药物研究和临床诊断提供必要的基础信息.本文对结核杆菌的转录组学研究作一综述.     

结核分支杆菌inhA基因突变的测序研究

目的 对耐药结核分支杆的inhA基因进行测序分析以研究其变异的分子机制。方法 以inhA片段为引物,聚合酶链反应扩增H27Rv、耐药株和敏感株的inhA基因,产物克隆后制备质粒,ABI377全自动核酸测序系统测定DNA序列。结果 在17个耐异烟肼菌株中,11株出现inhA基因变异,突变率为65％,其中在10株至少每株有1个错义突变。变异主要为点突变,包括碱基置换和缺失。各菌株变异不同。katG和inhA同时变异的达62％。首次发现了18个与结核分支杆菌耐INH和EMB特性有关的inhA基因位点。结论 结核分支杆菌耐INH和EMB特性与inhA突变异致药物结合位点减少有关。     

应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌

目的 研究噬菌体裂解试验对结核分支杆菌快速鉴定的意义。方法 应用结核分支杆菌噬菌斑技术快速检测结核分支杆菌、非结核分支杆菌和非分支杆菌及肺结核患者痰标本。结果 结核分支杆菌H37Rv、牛分支杆菌和非洲分支杆菌噬菌体裂解试验均为阳性,10株常见非结核分支杆菌和7株非分支杆菌均为阴性;30株结核分支杆菌临床分离株本法检测结果全部阳性;20份涂阳培阳肺结核患者痰标本,本法阳性19份（95％）;21份涂阴培阳痰标本,本法阳性15份（71％）;19份涂阴培阴痰标本,5份阳性（26％）。结论 噬菌体裂解试验可以快速鉴定结核分支杆菌,用其检测痰标本中的结核分支杆菌具有很高的特异性和较高的敏感性。     

gidB mutations in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical

目的　探索gidB基因突变在结核分枝杆菌链霉素耐药中的作用。方法 结核分枝杆菌临床分离株中,60株为链霉素耐药,30株敏感。同时进行链霉素MIC测定并采用DNA测序法分析gidB,rpsL和rrs基因突变。结果 20%的耐药株含有gidB单基因突变,80%的耐药株除gidB基因突变以外,还有rpsL或rrs基因突变。敏感株中也有gidB基因突变。gidB突变呈散在分布,未发现突变热点。结论 gidB基因突变在结核分枝杆菌链霉素耐药中的作用尚不能肯定。     

TB-SA基因检测在结核病诊断的临床应用研究

目的　研究结核分枝杆菌特异性基因(Tuberculosis-Specific AntigenTB-SA)在结核病诊断中的应用价值。方法 选择2004年4—9月期间在成都市结核病防治院的住院结核病患者371例。其中肺结核307例;肺外结核64例(结核性胸膜炎47例、结核性腹膜炎7例、结核性脑膜炎10例);非结核病的呼吸系统疾病患者61例(肺炎4例、肺癌9例,急性支气管炎7例、慢性支气管炎14例、哮喘10例,COPD12例、肺间质纤维化1例、支气管扩张3例、矽肺1例);同时选择无结核疾患健康志愿者40例,全部选例均知情同意。入选肺结核病例和健康选择痰液、肺外结核病例选择胸腔积液、腹腔积液、脑脊液等标本进行抗酸杆菌浓缩集菌,结核杆菌培养和TB-SA基因扩增(PCR)。结果 307例肺结核患者中PCR检测TB-SA阳性259例,敏感性为84.4%(259/307);细菌学培养阳性193例,敏感性62.9%(193/307);痰浓缩集菌镜检阳性95例,敏感性30.9%(95/307)。64例肺外结核患者中,TB-SA阳性35例;敏感性54.7%(35/64);核杆菌培养阳性5例,敏感性7.8%(5/64)。61例非结核呼吸系统病患者中,TB-SA阳性2例,特异性96.7%(59/61)痰涂片无阳性病例。40例健康志愿者,TB-SA及痰涂片均无阳性出现,特异性达100%(40/40)。结论 TB-SA基因检测的特异性及敏感性都取得了满意的效果。操作也较为简单。     

Evaluation of Amplicor- and IS6110-PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in Singapore

One hundred and seventy-eight samples from 168 individuals were tested for Mycobacterium tuberculosis complex ( Mtc ) using Amplicor PCR, IS6110 -PCR (in-house), acid fast (AF)-staining and culture. Thirty-one samples were positive by culture, but 37 samples were later resolved to be truly positive for Mtc . Of these, Amplicor detected 32 (86.5%), IS6110 -PCR detected 31 (83.6%), and AF-staining 21 (56.8%). None of the 141 Mtc -negative samples was positive by these tests, thus giving 100% specificity. Although the IS6110 -PCR was more sensitive than Amplicor in detecting spiked Mtc DNA, it was not more sensitive than the latter in detecting Mtc in clinical samples. Reasons likely to account for the PCR false negativity were (i) sample inoculum size, (ii) nonuniform samples due to clumping effect of Mtc and (iii) the absence of target gene sequences for IS6110 -PCR. Culture negativity, on the other hand, was likely to be associated with nonviable Mtc . Amplicor PCR is promising for direct detection of Mtc . The IS6110 -PCR, however, may not be as suitable because of possible existence of IS6110- deleted Mtc strain in Singapore.