变形链球菌F-ATP酶基因重组质粒的构建和初步分析

目的：构建用于转化变形链球菌，含有F-ATP酶基因的重组质粒。方法：采用PCR方法，以变形链球菌基因组DNA为模板，扩增F-ATP酶β亚基5′末端序列，将克隆片段与载体pVA891酶切后连接，形成重组质粒，并对变形链球菌的转化作了初步分析。结果：构建的重组质粒经PCR鉴定、酶切鉴定和DNA序列测定，显示插入的目的片段序列正确。结论：变形链球菌目的片段与穿梭载体重组后能有效克隆，为通过同源重组特异突变变形链球菌染色体基因奠定基础。     

运动发酵单胞菌adhB基因置换变形链球菌1dh基因重组质粒的构建

目的 保留重组质粒pMDl8-T-ldh中变形链球菌ldh基因上下游同源区，用运动发酵单胞菌adhB基因置换胁基因构建重组质粒。方法 PCR法扩增adhB基因，克隆到PGEM-T载体，构建pGEMA重组质粒，以pMD18-T-1dh重组质粒为模板，反向PCR法缺失ldh，NcoI和XhoI酶产物片段和pGEMA质粒，连接得到重组质粒pMDLA。结果成功克隆adhB基因，并用该基因置换ldh基因构建重组质粒pMDLA。结论 本实验成功将反向PCR法引入缺失突变诱导，丰富了运动发酵单胞菌在医学领域的应用。     

转基因番茄防龋疫苗的基础研究Ⅰ.变形链球菌pac基因唾液粘附区植物表达质粒的构建

目的 :构建变形链球菌表面蛋白基因 (pac)唾液粘附区的植物表达质粒pROP1和pRPB1。方法 :用PCR扩增的含变形链球菌表面蛋白唾液粘附区P1片段 (184- 1946bp)与植物的高效表达质粒pROKCP结合 ,构建pROP1表达质粒 ;且将此质粒与Bar基因 (抗除草剂基因 )连接 ,构建表达质粒pRPB1,酶切电泳检测。结果 :从pPC41中扩增的P1片段整合到pROKCP的适当部位 ,构成重组质粒pROP1,从pPBar分离出的Bar基因整合到pROP1,构成重组质粒pRPB1。结论 :本实验成功地构建了携带变形链球菌表面蛋白唾液粘附区的植物表达质粒pROP1和pRPB1。     

基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究Ⅱ.携带变形链球菌pac基因表达质粒的构建与初步鉴定

目的：构建携带变形链球菌表面蛋白pac基因A区片段的原核高效表达系统。方法：对含变形链球菌表面蛋白pca基因的pPC41质粒进行PCR扩增,获得了pac基因A区片段,将扩增获得pac基因A区片段与表达质粒pET17-b定向克隆,重组质粒用B HI,EcoRV双酶切后电泳鉴定。结果：获得携带pac基因片段的重组持粒,结论：利用基因工程技术获得的重组质粒为后继工作准备了实验基础。     

变形链球菌gcp基因突变菌株的构建及鉴定

目的:构建变形链球菌gcp基因突变菌株,以便研究变形链球菌gcp基因功能。方法:厌氧培养变形链球菌UA159,以前期研究中pMD19T-gcp为模板,PCR扩增gcp基因内部序列,连接自杀载体pVA8912,酶切鉴定;将鉴定正确的质粒转化变形链球菌UA159,挑取阳性克隆,提取基因组DNA,用PCR结合酶切鉴定。结果:发现PCR产物及插入片段大小与预期值相符,表明成功构建了重组质粒pVA8912/gcp;经PCR鉴定:gcp基因失活株基因组中gcp基因内部成功插入了重组载体片段。结论:成功构建了变形链球菌gcp基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础。     

变形链球菌AgⅠ/Ⅱ蛋白编码可变区(Ⅴ+)基因表达质粒的构建

目的 构建变形链球菌（S.mutans血清型f,s.mutnas血清型c)表面蛋白编码Ⅴ 基因重组质粒pCVc,pCVf和重组表达质粒pSRVc,pSRVf。方法 用PCR方法从sr基因中扩增目的基因片段与质粒pCR2.1连接，再将V 区基因片段转移到高效表达质粒pET21a( )。酶切电泳检测，结果 PCR扩增产物为1.16kb的DNA带，测序结果与sr基因序列V 区一致。酶切电泳证实V 区基因片段整合到pET21a( )的适当部位，构建重组表达质粒pSRVc,pSRVf。结论 本试验成功地构建了携带V 基因片段的表达质粒pSRVc,pSRVf。     

基因重组乳链球菌防龋疫苗的研究 Ⅲ．乳链球菌重组质粒DNA的Southern印迹和点印迹杂交分析

为了证实重组质粒ＤＮＡ分子中插入的外源ＤＮＡ确是来自变形链球菌拱体菌，检测受体菌中是否有探针同源的序列。本研究采用ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交、点印迹杂交和切口平移制备生物素ＤＮＡ探针以及光敏基因检测技术，对乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７中的重组质粒ＤＮＡｐＬＦ１０２，ｐＬＦ１０７作了进一步分析鉴定，ＤＮＡ点印迹杂交结果显示，含有ｐａｃ基因的ｐＰＣ４１ＰｓｔⅠ酶切ＤＮＡ探针均与上述质粒ＤＮＡ结合，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交提示重组质粒１．５ｋｂ的酶切片段与生物素探针杂交，证实该基因片段是从ｐＰＣ４１中获得的变形链球菌目的基因片段，重组乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７均携带变形链球菌表面蛋白抗原（ＰＡｃ）结构基因ｐａｃ。     

GTF-PAc融合防龋DNA疫苗的研究(Ⅰ)携带GLU基因片段的真核表达质粒pGLU的构建

目的 :将变形链球菌葡糖基转移酶GTF I的编码葡聚糖结合区 (GLU)的序列克隆到真核载体 pCI中 ,为构建GTF PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法 :用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒 pYNB13的GLU区序列 ;将载体 pCI和GLU扩增片段分别酶切 ,体外连接 ,构建成真核表达质粒pGLU ,酶切电泳鉴定。 结果 :PCR获得了glu目的片段 ,质粒 pGLU含有 glu目的片段。 结论 :构建出了含有gtfB基因重要抗原决定簇区的真核表达质粒 pGLU     

GTF—PAc融合防龋DNA疫苗的研究（Ⅰ）携带GLU基因片的真核表达质粒pGLU的构建

目的：将变形链球菌糖基转移酶GTF－I的编码葡聚糖结合区（GLU）的序列克隆到真核载体pCI中,为构建GTF－PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法：用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒pYNB13的GLU区序;将载体pCl和GLU扩增片段分别酶切,外体连接,构建成真核表达质粒pGLU,酶切电泳鉴定。结果：PCR获得了glu目的的片段,质粒pGLU含有glu目的片段,结论：构建了含有gtfB基因重要抗原决定簇区的真核表达质粒pGLU。     

人骨形态发生蛋白-2基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人骨形态发生蛋白- 2（hBMP2）基因片段,构建pcDNA3.1- hBMP2真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT- PCR）技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形态发生蛋白- 2基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建pcDNA3.1- hBMP2重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人BMP2- cDNA。结论本实验成功克隆了hBMP2基因并构建成其真核表达质粒。     

变形链球菌乳酸脱氢酶基因及同源区的克隆和序列分析

目的：克隆变形链球菌乳酸脱氢酶基因(ldh)及其两侧同源区基因片段。方法：应用PCR技术扩增乳酸脱氢酶及其两端同源区序列片段，插入克隆载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α，Amp^ 抗性挑选阳性克隆，经酶切及PCR鉴定后进行序列测定。结果：PCR扩增产物特异；抗性筛选的4株菌落均为阳性克隆；用DNASIS将序列测定的结果与基因Bank中报道的序列对比分析，同源性为99．1％。结论：根据同源性分析的结果，可确定该克隆片段为变形链球菌乳酸脱氢酶及其两侧同源区序列。     

变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链gbpA的葡聚糖结合区GBD的基因片段，并使其在大肠杆菌中获得表达。方法：PCR技术克隆GBD片段及蛋白重组融合表达技术获得其在大肠杆菌中的表达。结果：成功克隆变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD的基因片段，并在大肠杆菌中得到表达。结论：利用分子生物学技术能够成功克隆目的基因并获得融合蛋白的表达。     

重组质粒pCIAP—P在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达研究

目的 证实重组质粒pCIA-P可编码表达具有变形链球菌S.mutans表面蛋白PAc抗原性的表达产物。方法 在选择合适的原核表达系统后，诱导外源基因表达出目的蛋白，通过蛋白质电泳技术及免疫印迹法检测表达蛋白，以观察pac基因重要抗原决定簇编码区DNA片段的原核细胞中的表达情况。结果 克隆片段在原核系统下可完成表达，表达产物保存了S.mutans表面抗原的免疫原性。结论 该实验为探索出一种简便快捷地检测与分析重组DNA疫苗表达产物的分子量及抗原性的方法提供了实验依据。     

含变链菌PAc蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建

人类致龋菌变形链球菌 (Ｓ .ｍｕｔａｎｓ)的一种表面蛋白ＰＡｃ ,由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作Ｓ .ｍｕｔａｎｓ的重要毒力因子 ,因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原。我们选择ｐａｃ基因中编码ＰＡｃ主要免疫活性区域的ＤＮＡ序列 ,制备出待表达ＤＮＡ片段 ,经亚克隆至ｐＧＥＭ Ｔ质粒后 ,再克隆到高效哺乳动物表达质粒ｐＣＩ中构建成含ｐａｃ基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒 ,从而为防龋ＤＮＡ疫苗的免疫实验研究完成了重要准备。一、材料和方法1.目的片段的体外扩增 :从ｐａｃ基因中选定包含两个主要免疫活性区 (Ａ区及…     

变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dltC突变的检测及临床意义

目的 检测变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dltC是否发生突变,推测该基因对变形链球菌耐氟菌株的影响.方法 体外人工诱导变形链球菌耐氟菌株,根据GenBank发表的变形链球菌dltC基因序列设计引物,对其耐氟菌株基因组进行PCR扩增,对扩增产物用DNA回收试剂盒回收鉴定,对回收产物用PGEM-T载体进行T-A克隆,构建重组质粒并测序.结果 PCR扩增获得与预期结果一致的特异性片段,并发现dltC基因有1个碱基发生突变,突变位点在8310(A→G).提交该序列到GenBank,获得登陆序列号为DQ272518.结论 变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因dltC发生点突变并属于同义突变.     

人血管内皮生长因子基因的克隆及在人成肌细胞中的表达

目的：克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段，构建pCDNA3/VEGF165真核表达载体，观察其在人成肌细胞中的表达。方法：采用逆录聚合酶链式反应（RT－PCR）技术，从人肝癌细胞株SMMC－7721中扩增出血管内皮生长因子VEGF165基因片段，通过DNA重组技术将该基因片段重组于pCDNA3真核表达载体上，构建成pCDNA3/VEGF165重组质粒，分别用酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定，应用脂质体介导的基因转移技术将这一表达载体导入体外培养的人成肌细胞内，并用免疫组化法观察其表达。结果：经酶切电泳分析和DNA测序证实，本实验克隆的基因片段为人VEGF165cDNA，重组质粒pCDNA3/VEGF165转染人成肌细胞后，VEGF表达明显增高。结论：本实验成功地克隆了VEGF165基因，为进一步研究用肌肉细胞内转染VEGF基因的方法来恢复或增强放疗后组织的血管生成能力奠定了基础。     

变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh突变的检测

目的检测变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh是否存在突变。方法体外诱导变形链球菌耐氟菌株,碱裂解法提取细菌基因组,根据GenBank上公布的变形链球菌耐酸相关基因ffh的序列,设计一对引物进行PCR,利用PGEM-TEasy载体进行T-A克隆,构建重组质粒,酶切电泳,并测序鉴定。结果变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh发生了突变。结论变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh发生了突变,并可能与其耐酸性增强有关。     

变形链球菌UA159磷酸蔗糖变位酶基因功能丧失菌株的构建

目的:构建变形链球菌UA159磷酸蔗糖变位酶基因(phospho-sugar mutase gene,psm)功能丧失菌株,为进一步研究变形链球菌psm功能做准备.方法:将变形链球菌UA159 psm内部上、下游2段序列分别克隆至自杀质粒pFW5的2个多克隆位点(MCS-Ⅰ和MCS-Ⅱ),构建重组质粒,并经酶切和测序证实.利用同源重组(homologous recombination)原理,采用自然转化的方法,实现重组自杀质粒和变形链球菌UA159同源序列的等位交换(allelic exchange).结果:经过PCR和测序分析,证实变形链球菌UA159基因组中的psm被重组质粒的基因(含有壮观霉素抗性)取代.结论:成功构建了变形链球菌UA159 psm功能丧失菌株.