人乳铁蛋白提高MCF7细胞放射敏感性的初步研究

目的 观察hLF对于人乳腺癌细胞辐射敏感性的影响。方法 用pBC1-hLF载体转染MCF7细胞,同时以hLF标准品处理为参照,细胞活力实验、克隆形成试验和流式检测细胞凋亡来观察hLF基因高表达对MCF7细胞生长特性和辐射敏感性的影响。结果 hLF基因高表达可以显著抑制MCF7的生长,提高其对射线的敏感性。hLF可促进MCF7细胞自发和受照后的凋亡,降低克隆形成能力。但胞外直接供给hLF却不能抑制MCF7的生长,也不能显著提高其对射线的敏感性,甚至有提高克隆形成能力的趋势。结论 hLF基因高表达可以在体外显著抑制人乳腺癌MCF7细胞的生长,提高其辐射敏感性,而直接供给hLF却没有上述作用。     

重组腺病毒介导野生型PUMA基因对胰腺癌细胞的放射增敏作用

目的 探讨野生型PUMA基因通过重组腺病毒转染至胰腺癌细胞后对放射治疗(放疗)的增敏作用。方法 将含野生型PUMA基因的重组腺病毒50MOI转染Aspx-1胰腺癌细胞48h后,采用⁶⁰Coγ射线对其进行照射6Gy。Western blot法检测细胞内PUMA蛋白表达。通过噻唑蓝比色法和细胞克隆形成试验检测细胞生长、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记检测细胞凋亡水平。结果 转染野生型PUMA基因的Aspx-1细胞生长受到了明显的抑制(P<0.05),凋亡率增加。转染野生型PUMA基因的Aspx-1细胞再经6Gyγ射线照射后,细胞生长抑制和细胞凋亡率增加更加明显。结论 ①野生型PUMA基因转染促进胰腺癌细胞凋亡并抑制其生长。②野生型PUMA基因转染可增加胰腺癌细胞对放射治疗的敏感性。     

辐射对沉默ATRX的H460细胞增殖以及DNA损伤修复的影响

目的 探讨辐射对沉默ATRX的肺癌H460细胞增殖和DNA损伤修复的影响及二者的关系。方法 靶向ATRX的3个慢病毒载体转染293T细胞后,慢病毒感染H460细胞,获得ATRX低/无表达的细胞株shATRX1-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460,并以shControl-H460作为对照,利用Western blot检测沉默效率。分别以克隆形成实验检测细胞增殖,免疫荧光技术检测γH2AX和Rad51焦点数,同时以Western blot检测PARP1、γH2AX和Rad51蛋白的表达。结果 shControl-H460细胞中可见ATRX表达,而shATRX1-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞中ATRX表达均出现不同程度的降低。克隆形成实验显示,shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞的存活分数（survival fraction,SF）均较shControl-H460细胞降低。shControl-H460和shATRX3-H460细胞经4 Gy照射后1 h,γH2AX焦点最多,而3 h时Rad51焦点最多,而后均降低,与shControl-H460细胞比较,在1和6 h时shATRX3-H460细胞γH2AX焦点,以及1、3和6 h时Rad51焦点显著增加（P<0.05,P<0.001）。而且shATRX3-H460细胞中PARP1、γH2AX和Rad51蛋白在3和6 h时均较shControl-H460细胞表达增加。结论 成功地获得靶向沉默ATRX的细胞模型,辐射后细胞增殖能力降低,可能与DNA损伤修复能力降低有关。     

miRNA-22对食管癌细胞放射敏感性的影响

目的 探究miRNA-22对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)放射敏感性的影响。方法 建立miRNA-22表达的稳定转染细胞模型,通过克隆形成实验和MTT法检测miRNA-22表达对受照食管癌细胞增殖活性的改变。结果 体外稳定转染细胞模型中,克隆形成实验和MTT法结果表明,miRNA-22表达升高,显著降低了食管癌细胞增殖活性(P < 0.01),促进了ESCC细胞对γ-射线的放射敏感性。反之,miRNA-22表达降低,显著增加了食管癌细胞增殖活性(P < 0.01),抑制了ESCC细胞对γ-射线的放射敏感性。结论 miRNA-22的表达与食管癌放射敏感性密切相关,miRNA-22表达量越高,食管癌细胞放射敏感性越高。     

集落形成法和Western Blot法研究ELAC2的辐射增敏作用

目的 研究ELAC2基因对乳腺癌细胞MCF-7辐射敏感性的影响。方法 利用脂质体转染法将ELAC2基因转入MCF-7细胞,同时设立未转染MCF-7和转染空载体的MCF-7/pcDNA3作为对照。RT-PCR法检测ELAC2基因的mRNA表达;集落形成法检测ELAC2基因对肿瘤细胞辐射敏感性的影响;Western Blot法检测ELAC2、FEN-1、MGMT、MRE11及Ku-70基因的蛋白表达水平。结果 ELAC2基因的mRNA和蛋白水平在转染细胞中表达明显增高。细胞接受0、0.5、1、2、4、6Gy的X射线照射后,ELAC2基因高表达使MCF-7细胞的剂量-效应曲线左移,细胞辐射敏感性增强。细胞经5Gy的X射线照射,ELAC2基因高表达未使MGMT蛋白和MRE11蛋白表达发生明显变化,而FEN-1蛋白及Ku-70蛋白表达水平显著下降。结论 ELAC2基因高表达使细胞辐射敏感性增高,其涉及的分子机制可能与ELAC2下调FEN-1蛋白及Ku-70蛋白表达水平有关。     

Celecoxib对肺癌细胞的辐射增敏实验研究

目的 建立裸鼠非小细胞肺癌(NSCLC)H460细胞动物模型,观察环氧化酶2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布(Celecoxib)对H460放疗的增敏作用,并对其作用机理进行初步探讨。方法 建立Balb/c裸鼠肿瘤模型。动物随机分成3组:对照组、放疗组、塞来昔布+放疗组。灌肠法给予塞来昔布16mg/kg/d,4周时对比两组肿瘤瘤重;免疫组化方法分析共济失调-毛细血管扩张症突变蛋白(ATM)和表皮生长因子受体(EGFR)表达变化。结果 4周时塞来布昔+放疗组与放疗组的抑瘤效果比较有显著差异(P < 0.05)。结论 塞来昔布可能通过提高ATM和EGFR的表达,增强H460细胞的放疗敏感性,将来可能具有较好的临床应用价值。     

电离辐射诱导人口腔上皮癌KB细胞基因表达谱变化的研究

目的 利用基因芯片技术研究辐射相对不敏感细胞人口腔上皮癌KB细胞受电离辐射后基因表达谱变化。方法 ①克隆形成实验分析不同照射剂量对KB细胞生长抑制率的影响;②采用基因芯片技术筛选与空白对照组差异表达基因并分析。结果 在基因芯片上48 000个基因中,共有749个差异表达的基因,其中上调表达269个,下调表达480个,表达差异的基因主要涉及细胞分裂、核酸合成修复、核酸结合转运、凋亡等多个方面。结论 辐射对细胞造成的损伤是多靶点多层次的,深入研究这些辐射相关基因的作用,可为进一步研究辐射敏感或抗性产生的原因提供依据。     

人IL-21基因对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的 研究含有IL-21基因的重组腺病毒表达载体(Ad-IL-21)抑制人卵巢癌细胞生长的作用。方法 Ad-IL-21重组体于体外转染卵巢癌细胞株ES-2,用MTT比色法和流式细胞术观察ES-2细胞的生长曲线和细胞周期的变化。结果 Ad-IL-21组ES-2细胞的生长比空白对照组和对照腺病毒组慢,在转染后第3天开始生长明显缓慢(P<0.05),转染后第5天Ad-IL-21组的细胞生长基本稳定在一定水平(P<0.05)。Ad-IL-21转染后ES-2细胞停留在G₁期细胞增加,而G₂期和S期细胞减少。结论 腺病毒介导的外源性IL-21基因可有效转染人卵巢癌细胞,并对其生长有抑制作用。     

三种小鼠免疫细胞对辐射敏感性差异的比较

目的 对IRM-2、ICR、615三种小鼠胸腺(Th)、脾(SP)细胞照射后辐射敏感性的差异进行比较,探讨IRM-2小鼠的辐射抗性及免疫学机制。方法 用流式细胞仪检测外周血细胞分型,PA法(FITC-Annexin V和PI标记法)检测Th、SP细胞照射后凋亡率。结果 IRM-2小鼠CD4/CD8比值低于ICR、615小鼠;CD25/CD4高于615小鼠(P<0.05),低于ICR小鼠;SP细胞凋亡率0、1、4Gy低于ICR和615小鼠,差异有统计学意义(P<0.05);Th细胞凋亡率低于ICR和615小鼠,在4Gy照射组低于615小鼠(P<0.01)。结论 IRM-2小鼠的胸腺和脾细胞对辐射不敏感,辐照后Th、SP细胞凋亡率低于ICR和615小鼠。     

重组腺病毒Ad-Rb94基因联合放疗对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨重组腺病毒Ad-Rb94基因联合放射治疗对人肝癌细胞的联合抑瘤作用。方法 将重组腺病毒Ad-Rb94基因导入人肝癌细胞株HepG₂,观察联合放射治疗对细胞生长、细胞周期及凋亡的影响。结果 Ad-Rb94基因组、放疗组和Ad-Rb94基因联合放疗组HepG₂细胞的生长均受到抑制,尤其在转染后96h细胞存活数量最低,与Ad-lacZ组和空白对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。联合治疗组HepG₂细胞生长最为缓慢,Rb94基因转染后96hAd-Rb94联合放疗组的抑制作用均明显高于Ad-Rb94组和放疗组(P<0.05)。Ad-Rb94组、放疗组及Ad-Rb94联合放疗组HepG₂停留在G₂/M期的细胞增加,G₀/G₁期和S期细胞数量减少,凋亡细胞数量增加,其中以联合治疗组G₂/M期细胞和凋亡细胞所占比例最高。结论 Ad-Rb94基因联合放疗具有协同作用,有效地抑制肝癌细胞的生长。     

人胰岛素基因在糖尿病大鼠体内的表达

目的研究人胰岛素基因表达质粒在体外转染鼠成纤维细胞(NIH3T3)后对糖尿病大鼠血糖的影响。方法采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞(NIH3T3),转染后72h,经G418抗性筛选出阳性克隆并培养到第24d,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达,同时用ELASA法监测转染后24d的细胞培养液的胰岛素水平。并将阳性克隆大量扩增,注射至糖尿病大鼠腹腔内,并与转染空载体的对照细胞比较,观察在糖尿病大鼠体内的胰岛素表达及对血糖等变化的影响。结果转染PCMV.INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组(P<0.01)及PCMV转染组(P<0.01),未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化(P>0.05)。接受胰岛素表达载体细胞的糖尿病大鼠,血糖明显下降,体重逐渐恢复。结论人胰岛素基因能成功转染非胰岛β细胞,并表达目的基因使血糖水平下降说明基因治疗有望成为1型糖尿病的重要治疗手段,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体。     

细胞周期检测点激酶1／2基因与放疗敏感性关系

目的观察宫颈癌HeLa细胞chk1/2基因表达改变对X射线诱导凋亡的影响。方法以脂质体为载体将chk1/2正义链和反义链转染HeLa细胞,用Western blot检测HeLa细胞中chk1/2蛋白的表达,用流式细胞仪和TUNEL法检测X射线照射后细胞凋亡率。结果转染chk1/2反义寡核苷酸可明显抑制chk1/2蛋白表达(F=22.69,P<0.05),X射线作用下细胞凋亡率明显高于转染正义链组(F=23.65,P<0.05)。结论反义封闭chk1/2基因可增加HeLa细胞对X射线照射的凋亡敏感性。     

GFP共表达的重构型Caspase-3基因对人成骨肉瘤细胞的凋亡诱导作用

目的探讨GFP共表达的Caspase-3基因的表达对人成骨肉瘤细胞的凋亡诱导作用。方法应用DNA重组技术将重构型Caspase-3基因亚克隆至带有GFP报告基因的真核表选载体pEGFP-C1中，脂质体介导转染人成骨肉瘤细胞SOSP-9901，通过RT-PCR方法检测转染后Caspase-3基因的表达；荧光显微镜、电镜观察细胞形态学变化；MTT法检测转染Caspase-3基因SOSP-9901细胞生长的影响。结果RT-PGR方法证实重构型Caspase-3基因可在SOSP-9901细胞内表达，形态学观察显示转染组细胞较对照组出现明显细胞凋亡特征，MTT法结果表明Caspase-3对SSOP-9901的细胞生长有押制作用。结论重构型Caspase-3对成骨肉瘤细胞SOSP-9901的生长有抑制作用，并可诱导成骨肉瘸细胞凋亡。     

沉默信息调节因子1小干扰RNA诱导前列腺癌细胞PC3细胞凋亡

摘要:目的　观察沉默信息调节因子1（SIRT1）小干扰RNA（siRNA）对前列腺癌细胞PC3细胞生长增殖、DNA合成、细胞凋亡和Bcl-2和Bax蛋白的表达变化,探讨SIRT1在前列腺癌发生中的可能机制。方法　体外培养PC3细胞,分空白对照组（mock组）,转染阴性对照组（scramble siRNA组）和SIRT1 siRNA转染组;Western blot检测PC3细胞中SIRT1的干涉效能;MTT法测定PC3细胞的增殖率;BrdU掺入法测定DNA合成;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测PC3细胞中细胞凋亡关键调控因子Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果　与对照组比较,SIRT1 siRNA组SIRT1蛋白表达降低（P＜0.01）,PC3细胞的增殖和DNA合成明显受抑制（P＜0.01）,细胞凋亡比例增加（P＜0.01）,Bcl-2蛋白表达减少,Bax的表达增加。结论　下调SIRT1的表达抑制细胞增殖和DNA合成,诱导前列腺癌PC3细胞发生凋亡,其机制可能与改变细胞凋亡关键调控因子Bcl-2和Bax的蛋白表达相关。     

真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的构建pcDNA3．1－RASSFl真核表达载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2凋亡的影响。方法应用聚合酶链反应技术从人RASSFlcDNA中扩增出RASSF1基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切,将其克隆人用相同酶处理的载体pcDNA3．1;将重组质粒pcDNA3．1－RASSF1转染肝癌HepG2细胞,应用Westernblot法检测RASSF1的表达水平;用AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3．1．RASSF1构建成功;Westernblot法结果表明转染pcDNA3．1-RASSF1后HepG2细胞中RASSFl表达升高;AnnexinV／PI法用流式细胞术检测凋亡,空白组、pcDNA3．1组和pcDNA3．1-RASSFl组HepG2细胞的凋亡率分别为（5．8±0．42）％、（7．48±0．68）％和（35．1±3．15）％。结论真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1构建成功;RASSF1蛋白在HepG2细胞中高表达,并促进细胞凋亡。     

Retinoblastoma 94 enhances radiation treatment of esophageal squamous cell carcinoma in vitro and in vivo

We performed the study to investigate whether adenovirus-mediated retinoblastoma 94 (RB94) gene transfer could enhance radiation treatment of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) in vitro and in vivo. ESCC cells (Kyse150 cell line) were cultivated in vitro and tumors originated from the cell line were propagated as xenografts in nude mice. Treatment with Ad-RB94 and/or ionizing radiation (IR) was carried out both in vitro and in vivo with Ad-LacZ control vector and blank control. Cell viability, cell cycle distribution, cell apoptosis, tumor growth and transfected gene expression were evaluated and tumor degeneration was analyzed. The data of quantification real-time PCR assays and immunohistochemistry staining using RB antibody indicated that RB94 was efficiently transfected into Kyse150 cells. In vitro, data of cell growth assay indicated that treatment with Ad-RB94 improved radiation treatment of Kyse150 cells. Tumor xenograft studies, pathological analysis of H.E. staining and Ki67 staining suggested transfecting RB94 enhanced tumor regression induced by radiation treatment in vivo. In addition, data of Annexin V, TUNEL and cell cycle distribution assays proposed combination treatment effectively induced cell apoptosis and cell cycle arresting in G2/M phase. In conclusion, transferring RB94 gene by the adenoviral vector enhances radiation treatment of ESCC.