RNA干扰表皮生长因子受体对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA载体介导抑制骨肉瘤细胞中表皮生长因子受体(EGFR)的表达和对骨肉瘤细胞增殖与凋亡的影响.方法:构建pSilencer-EGFR短发夹状小干扰RNA(siRNA)真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到骨肉瘤细胞中,用Western印迹法、RT-PCR检测EGFR基因在骨肉瘤细胞中的表达;通过原位末端标记 (TUNEL)法,DNA片段化检测观察其对骨肉瘤细胞凋亡的影响.结果:成功构建pSilencer-EGFR短发夹状siRNA真核基因表达载体,转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的骨肉瘤细胞中EGFR基因表达显著抑制(60%).与对照组比较,pSilencer-EGFR转染组骨肉瘤细胞培养 48 h后,DNA片段化检测出"DNA ladder"和TUNEL法显示细胞典型凋亡特征.结论:EGFR小发夹RNA质粒载体可显著抑制骨肉瘤细胞中EGFR基因的表达,促进骨肉瘤细胞凋亡,EGFR基因具有抑制凋亡的作用.     

RNA干扰沉默STAT3基因表达对膀胱癌细胞生长影响的实验研究

目的探讨应用RNA干扰技术沉默信号转导和转录激活因子3（STAT3）基因对膀胱癌T24及5637细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板，构建pGenesil-1-shRNASTAT3重组质粒，转染人膀胱癌T24及5637细胞。通过半定量RT-PCR、Western印迹检测STAT3基因不同水平的表达情况，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）实验、流式细胞仪检测转染后细胞增殖及细胞周期的变化。结果成功构建pGenesil-1-shRNA—STAT3重组质粒，并成功转染T24及5637膀胱癌细胞；半定量RT-PCR、Western印迹检测结果显示，重组质粒实验组细胞的STAT3基因表达在RNA及蛋白水平上显著低于对照组（P〈0．05）；MTT实验、流式细胞仪检测结果显示，重组质粒实验组细胞的增殖明显受到抑制并出现凋亡现象。结论pGenesil-1-shRNA—STAT3转染T24及5637膀胱癌细胞后，可有效抑制STAT3的表达，并抑制膀胱癌细胞的生长及增殖。     

稳定转染靶向bcl-2的shRNA对胃癌SGC-7901细胞株增殖影响

目的探讨稳定转染靶向bcl-2的小发夹RNA（shRNA）对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响。方法构建针对bcl-2的shRNA质粒表达载体,转入SGC-7901细胞,筛选稳定转染的细胞克隆继续压力培养。RT-PCR方法检测稳定转染后SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达以及对细胞增殖和凋亡的影响。结果稳定转染shRNA后,SGC-7901细胞的bcl-2 mRNA表达明显下降;细胞增殖能力及凋亡率无明显变化。结论稳定转染shRNA能长效抑制SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达,为后续基因治疗研究提供了实验依据。     

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤（MM）基因治疗的可行性。将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIRES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF，酶切、测序鉴定。用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266，G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR、Westernblot法分别检测阳性克隆中VEGFmRNA和蛋白的表达；利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化；利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成。结果表明：获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF；VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达，转染重组质粒的U266细胞VEGFmRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少，细胞的增殖受到抑制，凋亡增加。转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少。结论：VEGF反义RNA可以下调VEGF表达，从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖，增加其凋亡并抑制血管形成。     

慢病毒载体介导的IRX1基因沉默对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的观察慢病毒载体介导的易洛魁家族同源盒1(IRX1)基因沉默对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响。方法培养宫颈癌SiHa细胞并分为3组:其中未做任何处理的SiHa细胞为Control组、转染空载质粒的SiHa细胞为sh-NC组、转染IRX1短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒载体质粒的SiHa细胞为sh-IRX1组。实时定量PCR和蛋白免疫印迹法分别在IRX1 mRNA和蛋白表达水平上鉴定转染效果,CCK-8法和克隆形成试验检测转染后SiHa细胞增殖能力变化,流式细胞术检测转染后SiHa细胞周期和细胞凋亡的变化,蛋白免疫印迹法检测SiHa细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤(BCL)关联X蛋白(BAX)和BCL-2蛋白表达水平。结果与Control组和sh-NC组比较,sh-IRX1组SiHa细胞中IRX1mRNA和蛋白表达水平均下调,SiHa细胞活性和克隆形成能力均降低,G0/G1期细胞比例增多,S期和G2/M期细胞比例减少,细胞凋亡率升高,细胞中PCNA、Cyclin D1和BCL-2蛋白表达水平下调,BAX蛋白表达水平上调(P均...     

LncRNA NORAD靶向抑制miR-363-3p对多发性骨髓瘤细胞生物学行为的影响及机制

目的:探索长链非编码RNA NORAD(lncRNA NORAD)对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响及其与微小RNA-363-3p(miR-363-3p)的靶向关系。方法:RT-qPCR检测健康人成骨细胞h FOB1.19和多发性骨髓瘤细胞U266,LP-1,H929中NORAD和miR-363-3p表达。在U266细胞中转染si-NORAD,或共转染si-NORAD和anti-miR-363-3p,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。star Base软件预测结合双荧光素酶报告实验分析NORAD与miR-363-3p的靶向结合。结果:多发性骨髓瘤细胞系U266,LP-1和H929中NORAD表达明显上调(P0.05),miR-363-3p表达显著下调(P0.05)。沉默NOR A D表达显著降低48,72h的U266细胞活性和c yclin D1,CDK4,Bcl-2蛋白水平(P0.05),明显提高细胞凋亡率和cleaved caspase-3,Ba x蛋白表达量(P0.05)。NOR AD靶向调控miR-363-3p表达。抑制miR-363-3p表达逆转沉默NOR AD表达对U266细胞增殖、cyclin D1,CDK4和Bcl-2表达的抑制作用,以及逆转沉默NORAD表达对细胞凋亡、cleaved caspase-3和Bax蛋白表达的促进作用。结论:Lnc RNANOR AD通过靶向miR-363-3p表达影响多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡。     

下调Met表达对骨髓瘤RPMI 8226细胞生物学行为的影响

目的:探讨下调c-Met表达对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法:将RPMI 8226细胞根据转染,分为对照组(RPMI8226细胞不做转染)、RPMI 8226/shRNA-control组和RPMI 8226/shRNA-Met组。采用Western blot检测c-Met蛋白表达水平以验证转染情况;采用MTT法检测细胞增殖;采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡;与ECM(FN和Matrigel)和ECV304细胞的粘附检测其粘附能力;Transwell法检测细胞侵袭能力。结果:shRNA-Met可成功转染于RPMI 8226细胞,并有效抑制c-Met的表达,下调c-Met表达能有效抑制RPMI8226细胞增殖。与对照组相比较,shRNA-Met组在G_0/G_1期细胞比例和凋亡率(sub-G_1)明显增加,而粘附率和迁移细胞的数量均明显下降;而与对照组相比,shRNA-control组各项指标均未见统计学差异(P0.05)。结论:下调Met表达可影响骨髓瘤RPMI 8226细胞的增殖、粘附、侵袭和凋亡等生物学行为。     

沉默FRAT1基因对结肠癌HT-29细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究

目的 探讨沉默FRAT1基因对结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡的影响及其可能分子机制.方法 将成功转染FRAT1基因RNA干扰序列的人结肠癌HT-29细胞扩大培养,MTT比色法检测细胞增殖,双染流式细胞术检测细胞凋亡率,单染流式细胞术分析细胞周期,免疫荧光法激光共聚焦显微镜下观察β-catenin蛋白变化.结果 转染组细胞较对照组细胞生长明显减缓（P＜0.01）,凋亡率明显增加（P＜0.01）,细胞周期出现G0/G1期阻滞,差异显著（P＜0.01）,胞质β-catenin蛋白表达明显下调.结论 FRAT1基因RNA干扰序列可以有效诱导结肠癌HT-29细胞凋亡和细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,其机制可能通过下调β-catenin表达实现.     

应用RNA干扰技术沉默vegfr-2基因的实验研究

为了探讨恶性肿瘤基因治疗的新靶点,本研究以vegfr-2的mRNA为靶点,设计、构建vegfr-2 shRNA的真核表达载体,用脂质体法将重组质粒转染人非小细胞肺癌A549细胞,用RT-PCR法及Western blot分别检测重组质粒对该基因mRNA和蛋白表达的抑制效果,应用CCK-8法检测细胞增殖、抑制情况,Hoechst染色法检测细胞凋亡形态学变化。结果表明:与空白对照、空质粒对照及scramble对照相比,干扰组shRNA能有效地降解vegfr-2mRNA,尤其转染pGenesil-1-vegfr-2-shRNA-1质粒组内源性vegfr-2 mRNA及蛋白减少更显著;在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低,转染后72小时抑制率最高,干扰组与空质粒组和空白对照组相比,对细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(p0.01);Hoechst荧光染色显示,转染48小时后在荧光显微镜下干扰组细胞呈典型的细胞凋亡形态。结论:vegfr-2 shRNA真核表达载体可序列特异性下调A549细胞的基因转录和表达,有效抑制细胞增殖和诱导凋亡,提示VEGF/VEGFR-2信号通路可作为恶性肿瘤基因治疗和功能研究的理想靶点。     

应用RNA干扰技术抑制白血病细胞血管内皮生长因子基因表达及功能的研究

目的探讨用RNA干扰技术下调血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对白血病细胞生长的影响。方法设计3段分别针对VEGF第3~5外显子的短发夹状RNA(shRNA)并构建其表达载体,分别转染人白血病细胞株NB4,用实时定量PCR及Western blot方法观察3段shRNA对细胞内VEGF基因表达的影响。抗性筛选稳定抑制VEGF表达的永久细胞克隆,应用MTT法、甲基纤维素半固体培养法及细胞周期动力学检测了解VEGF基因缄默对白血病细胞生长的影响。结果成功构建分别携带3段shRNA及对照随机片段的重组质粒pGenesil-VR1,2,3和pGenesil-con,3种shRNA重组质粒中pGenesil-VR3可明显降低细胞内VEGF mRNA的丰度及VEGF蛋白表达,筛选出的NB4-VR3细胞株增殖能力明显下降,细胞集落形成率为(13.3±3.8)%,与NB4-con的(21.3±6.4)%和NB4组的(24.5±5.2)%相比,差异有统计学意义(P<0.05),细胞周期阻滞于G1期,3组细胞G1期比例分别为(53.2±4.6)%、(42.7±5.9)%和(40.5±5.3)%。结论应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断VEGF基因表达及功能的shRNA,VEGF基因表达下调能明显抑制白血病细胞生长。     

Survivin基因沉默对恶性胶质瘤U87细胞的影响

目的探讨Survivin基因沉默对人脑胶质瘤细胞株U87体外细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法利用脂质体将pGenesil Survivin shRNA干扰质粒转染U87细胞,通过western法检测干扰48h后Survivin蛋白的抑制率,通过MTT法观察转染后24 h、48 h和72 h细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染后48 h细胞凋亡和细胞周期的变化。结果pGenesil Survivin shRNA干扰质粒转染U87细胞48 h后,Survivin蛋白的抑制率约为78%;阻滞U87细胞由G1期进入S期,抑制细胞的生长,增加了细胞的凋亡。结论Survivin shRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U87细胞Sur-vivin基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖。     

整合蛋白β1 shRNA表达质粒的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的 应用RNAi技术,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒,诱导肝癌细胞中整合蛋白β1基因沉默,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响.方法 设计整合蛋白β1 shRNA序列,与载体pSilencer 2.0连接,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒.经测序鉴定后,转染肝癌细胞SMMC-7721, Western blot检测整合蛋白β1及p27的蛋白表达, MTT方法测定转染后细胞的增殖能力.结果 成功构建了整合蛋白β1 shRNA表达质粒,转染肝癌细胞SMMC-7721后,整合蛋白β1的蛋白表达被明显抑制, p27的蛋白表达也随之减少.MTT实验结果发现转染细胞的增殖能力明显提高.结论 应用RNAi技术,可特异性阻断整合蛋白β1的蛋白表达.整合蛋白β1可调节肝癌细胞的增殖,并可能与p27的表达相关.     

整合蛋白β_1 shRNA表达质粒的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的应用RNAi技术,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒,诱导肝癌细胞中整合蛋白β1基因沉默,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。方法设计整合蛋白β1 shRNA序列,与载体pSilencer 2.0连接,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒。经测序鉴定后,转染肝癌细胞SMMC-7721,Western blot检测整合蛋白β1及p27的蛋白表达,MTT方法测定转染后细胞的增殖能力。结果成功构建了整合蛋白β1 shRNA表达质粒,转染肝癌细胞SMMC-7721后,整合蛋白β1的蛋白表达被明显抑制,p27的蛋白表达也随之减少。MTT实验结果发现转染细胞的增殖能力明显提高。结论应用RNAi技术,可特异性阻断整合蛋白β1的蛋白表达。整合蛋白β1可调节肝癌细胞的增殖,并可能与p27的表达相关。     

Bmi-1沉默对K562细胞功能的影响

Bmi-1是一种转录抑制子,属于Polycomb家族成员之一。Bmi-1基因在调控正常或白血病干细胞的自我更新中起着至关重要的作用。缺乏Bmi-1表达的急性髓系白血病细胞遭遇了增殖阻止和表现了分化和凋亡的征兆,这些发现导致有人提议和认为Bmi-1在白血病治疗中可作为潜在靶点。本研究探讨靶向针对Bmi-1的短发夹RNA（shRNA）对人慢性髓系白血病K562细胞功能的影响。采用RNA干扰技术,构建靶向针对Bmi-1的shRNA真核表达载体,利用脂质体lipofactamine2000将shRNA真核表达载体转染入K562细胞中,经G418（400μg／ira）筛选得到抗性克隆。用PCR和Western blot分别检测转染shRNA后K562细胞中Bmi-1的mRNA和蛋白水平的变化;以MTT法检测干扰组、对照组和未转染组细胞间的增殖情况;以集落形成实验测定3组间集落形成能力。结果表明：在设计的4个shRNA片段中,有1个片段显示显著的抑制效果。该shRNA转染K562细胞后,在mRNA水平上Bmi-1的表达明显下调,Western blot在蛋白水平上也证实了Bmi-1表达显著下调。MTT法和集落形成实验显示了干扰组、对照组和未转染组细胞3者间的增殖能力没有显著差异。结论：抑制Bmi-1的表达并不能减少K562细胞的增殖,这提示了可能存在其它一些平行的信号通路在细胞转化中起重要作用,而且可能独立于Bmi-1的过表达。Bmi-1在慢性髓系白血病的转化中起着次要的作用。     

WISp39基因对U937细胞增殖、凋亡和周期的影响

为了探讨一种新发现的p21调控蛋白WISp39对白血病细胞的增殖、凋亡和周期的影响,构建了WISp39的真核表达质粒pLenti6/V5-WISp39,并导入了人髓系白血病细胞系U937细胞,转染后用定量PCR检测了WISp39表达的变化,用CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术（FACS）检测细胞凋亡和周期的变化。结果显示：pLen-ti6/V5-WISp39转染48小时后,实验组中WISp39mRNA表达上升了（5.5±1.2）倍,同时U937细胞的增殖明显受到抑制,抑制率为37.6%;进一步的分析表明,在实验时间内,WISp39表达的升高不能明显诱导U937细胞的凋亡,但G0/G1期细胞比例由（40.59±0.7）%上升到（49.79±1.1）%。结论：WISp39对于U937无明显的诱导凋亡作用,但通过对细胞周期的影响,使停滞在G/G期的细胞增多,从而抑制了U937增殖。     

PLK1基因缄默在K562细胞凋亡中的作用

目的观察缄默PLK1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对K562细胞内PLK1表达和细胞凋亡的影响,探讨PLK1在白血病发病中的作用,寻找更为有效的白血病治疗途径。方法设计合成针对PLK1基因1416~1436位点的shRNA片段,并将其克隆于绿色荧光蛋白的表达载体pEGFP-H1中,命名为pEGFP-H1/PLK1。通过电穿孔转染法将其导入K562细胞中,分为对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-H1/PLK1shRNA重组质粒转染组,转染后24,48h,分别通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因和蛋白水平的变化,以MTT方法测各组细胞的增殖活性,比色法检测各组细胞的半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白酶活性,并通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和G2/M期转变情况。结果PLK1mRNA相对水平(与内参的灰度比值)对照组为1.25±0.07,空载体转染24,48h组分别为1.21±0.08和1.23±0.09,shRNA重组质粒转染24,48h组分别为0.52±0.04和0.25±0.02,shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P<0.01)。各组细胞PLK1的蛋白水平变化趋势与PLK1mRNA表达相似。相应地,对照组、空载体转染48h组、shRNA重组质粒转染24,48h组的凋亡率分别为(8.3±0.6)%、(8.7±0.7)%、(49.7±3.8)%和(82.3±6.9)%,后两者与前两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。此外,与对照组和空载体转染组相比,shRNA重组质粒转染组的细胞增殖能力明显下降(P<0.05),且位于G2/M期的细胞较对照组和空载体转染组显著增加。以上结果均于转染后48h时较明显(P<0.05)。结论构建的shRNA能明显抑制转染细胞PLK1的表达和增殖,并可促进转染细胞的凋亡,并使停留于G2/M期的细胞显著增加。     

Role of TLR4 for paclitaxel chemotherapy in human epithelial ovarian cancer cells

Background  Paclitaxel has been reported to be a ligand to Toll like receptor 4 (TLR4). Myeloid differentiation factor 88(MyD88) was described as a myeloid differentiation primary response gene. TLR4 signalling owns two pathways: MyD88-dependent and MyD88-independent pathways. XIAP is a key member of the inhibitor of apoptosis protein family. Akt is a major downstream target of growth factor receptor tyrosine kinases, which negatively regulates apoptotic pathways through phosphorylation (pAkt). The aim of the present study is to investigate the role of TLR4 in paclitaxel resistance of ovarian cancer cells.
Materials and methods  We reconstructed the RNA interference expression vector, pGenesil-1-U6 specifically targeting TLR4 mRNA, which was stable transfected into the human ovarian cancer cell line SKOV3 (MyD88-positive expression) and A2780 (MyD88-negative expression). Cell proliferation, cell cycle distribution and cell apoptosis were assessed in the cells transfected with scramble control shRNA (SKOV3/shControl, A2780/shControl) and TLR4 shRNA (SKOV3/shTLR4, A2780/shTLR4) to explore the possible functions of TLR4 in ovarian cancer cells growth. The expression of TLR4, MyD88, XIAP, Akt and pAkt was analysed by Western blot analysis.
Results  A knockdown of TLR4 levels down-regulated the expression of XIAP and pAkt. And it restored the inhibitory effect of paclitaxel on cell proliferation and impeding cell cycle progression in SKOV3 cells.
Conclusions  It suggests that TLR4 negatively regulates paclitaxel chemotherapy and MyD88 is an essential downstream factor to TLR4 signalling for this resistance. Knockdown of TLR4 induces paclitaxel chemosensitivity which might depress the Akt pathway. The TLR4-MyD88 signalling represents an important source to promote tumour growth.     

反义Bmi-1对Jurkat细胞的抑制作用

目的观察反义Bmi-1表达质粒在体外对T淋巴细胞白血病Jurkat细胞的生长抑制作用。方法选择Bmi-1基因起始密码子及与锌指结构对应的171bp核苷酸片段,反向连接于pLNCX2质粒上,得到反义Bmi-1表达质粒;通过脂质体转染将质粒导入Jurkat细胞中,以G418进行筛选得到阳性克隆;以MTT法和体外集落形成实验检测反义Bmi-1表达质粒对Jurkat细胞增殖的抑制作用;用流式细胞术分析细胞周期;采用免疫荧光组化法检测反义Bmi-1对Jurkat细胞P16蛋白的上调作用。结果转染反义Bmi-1表达质粒组与对照组(空白对照及空质粒组)相比较,生长速度明显变慢,克隆形成能力明显下降,空白对照组Jurkat细胞集落数为(90.70±9.07)/103细胞,空质粒组Jurkat细胞集落数为(83.30±6.11)/103细胞,转染反义质粒组Jurkat细胞集落数为(56.00±5.56)/103细胞(P<0.01);P16蛋白表达也明显增强。结论反义Bmi-1对Jurkat细胞的体外生长具有明显的抑制作用,并上调了P16蛋白的表达。     

MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡，增殖及细胞周期的影响

目的探讨沉默MYCT-1基因对GES-1细胞凋亡、细胞周期及细胞增殖的影响。方法采用siRNA转染GES-1细胞后分别应用AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测siRNA对细胞增殖的作用。结果siRNA转染GES-1细胞后,与对照细胞相比,细胞凋亡率明显增高（P〈0．05）;细胞增殖率降低（P〈0．05）,细胞周期检测表明细胞停滞于S期（P〈0．05）。结论MYCT-1基因维持一定的表达水平对于正常细胞生长调控是必需的,MYCT-1基因对细胞周期的调控主要体现在S期向G1期的转变过程。