磁性c-erbB2反义探针对SK-Br-3肿瘤细胞株形态及表达的影响

的：探讨磁性c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针对SK-Br-3肿瘤细胞株形态及表达的影响,阐明该探针是否同时具有诊断与治疗功能。方法：磁性c-erbB2反义探针转染高表达c-erbB2的SK-Br-3肿瘤细胞作为实验组,磁性c-erbB2反义探针转染Fuda肿瘤细胞株、SPIO及ASODN转染SK-Br-3肿瘤细胞、未转染的SK-Br-3肿瘤细胞设置为4个对照组,普鲁士蓝染色光镜观察细胞内铁的分布,透射电镜观察其超微结构,并检测细胞cerbB2蛋白表达变化及铁含量,行体外MR成像。结果：光镜显示SK-Br-3肿瘤细胞胞浆内散在分布铁颗粒,透射电镜观察到SK-Br-3肿瘤细胞胞浆内铁颗粒、团状吞饮体,细胞出现胞膜空泡化、细胞固缩、核固缩及凋亡小体,而对照组细胞无上述改变;与对照组比较,实验组SK-Br3细胞蛋白的表达抑制率明显升高,细胞铁含量增加(P<0.01),MR扫描显示信号减低(P<0.05)。结论：磁性c-erbB2反义探针能够顺利进入SK-Br-3肿瘤细胞,不仅能导致SK-Br-3细胞的凋亡,还能够被体外MR成像所检测,可能成为一种具有治疗与诊断意义的双功能探针。     

不同质量浓度磁性c-erbB-2反义探针对SK-Br-3肿瘤细胞株形态及表达的影响

目的探讨不同质量浓度磁性c-erbB-2反义探针转染乳腺癌SK-Br-3细胞株后,对其形态及表达的影响。方法将反义探针含铁质量浓度分别定为5、10、25、50、100 mg/L,转染乳腺癌SK-Br-3细胞24 h。采用普鲁士蓝染色并在光学显微镜及透射电镜下直接观察细胞铁颗粒,原子吸收光谱法测定细胞内铁含量,台盼蓝排除实验、CCK-8试剂盒观察细胞活性,Western blot法检测蛋白质表达,磁共振成像研究信号强度的变化。结果 SK-Br-3细胞对反义探针在一定质量浓度范围内(5、10、25 mg/L)呈依赖式摄取。当探针质量浓度为25 mg/L时,细胞内铁含量为(18.38±0.28)pg,细胞活力、存活率及细胞内c-erbB-2蛋白表达量明显降低(P均<0.05),磁共振扫描图像显示该组细胞T2值出现明显降低(P<0.05)。50及100 mg/L组各项结果与25 mg/L组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论当磁性c-erbB-2反义探针质量浓度为25 mg/L时,可有效转染并特异性抑制SK-Br-3细胞株的表达,并被磁共振成像所检测。     

磁性反义探针在不同转染时间点对SK-Br3肿瘤细胞株c-erbB-2蛋白表达及生长的影响

目的 探讨磁性c-erbB-2反义探针转染SK-Br3细胞株后,在不同时间点对其形态及表达的影响.方法 选择磁性c-erbB-2反义探针的含铁终浓度为25 μg/mL,分别孵育SK-Br3细胞6、12、24、36及48 h.采用普鲁士蓝染色并在光学显微镜及透射电镜下直接观察细胞铁颗粒,用原子吸收光谱法测定细胞内铁含量,锥虫蓝排除实验、CCK8实验观察细胞活性,Western blot检测蛋白质表达,MR成像研究信号强度的变化.结果 SK-Br3细胞在一定范围内(6、12、24 h)按时间依赖性摄取磁性c-erbB-2反义探针,当孵育时间为24 h时,细胞内铁含量为(18.38±0.28)pg,细胞活力、存活率及细胞内c-erbB-2蛋白表达量明显降低(均P＜0.05),MR成像显示细胞T2信号强度明显降低(P＜0.05).36 h及48 h组各项观察结果 与24 h组比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 磁性 c-erbB-2反义探针转染SK-Br3肿瘤细胞24 h时,MR成像可以达到最佳显示且明显抑制c-erbB-2癌基因表达.     

超顺磁性氧化铁标记反义寡脱氧核苷酸探针在转染细胞磁共振成像中的应用

目的制备超顺磁性氧化铁(SPIO)标记的反义寡脱氧核苷酸(ASODN)探针,探讨其应用于转染细胞磁共振(MR)成像的可行性。方法采用化学交联法将SPIO标记于c-erbB2癌基因的ASODN制成ASODN探针,原子力显微镜检测探针形态,高效液相凝胶色谱法检测联接率和生物活性,聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测稳定性。将ASODN探针转染高表达c-erbB2癌基因的SK-Br3肿瘤细胞株,普鲁士蓝染色后于光学显微镜下观察细胞内铁分布,原子吸收光谱法测定细胞内铁含量,MR扫描观察细胞信号强度变化情况。结果制备的ASODN探针近似球形,粒径在25～40nm间,分散均匀,联接率为100%,仍保持原有生物活性,稳定性好。转染ASODN探针后的SK-Br3细胞胞浆内可见多少不等的蓝色铁颗粒,细胞内铁含量明显高于未转染ASODN探针的其他各组细胞(P均<0.01);MR扫描显示其信号强度最弱,信噪比值明显低于其他各组细胞(P均<0.05)。结论成功制备SPIO标记ASODN探针,该探针能有效进入SK-Br3细胞内,明显降低MR扫描下的转染细胞信号强度。     

磁探针标记乳腺癌干细胞的实验研究

目的 研究超顺磁性氧化铁(superparamgnetic iron oxides,SPIOs) 标记乳腺癌干细胞及其生物学特性.方法 乳腺癌干细胞分离、鉴定及培养;用Feridex(一种SPIOs)标记乳腺癌干细胞,制备磁标记乳腺癌干细胞;利用MTT、透射电镜和Prussian blue染色等方法对磁标记的乳腺癌干细胞生物学特性进行研究.结果 在原代培养的乳腺癌细胞中分离出乳腺癌干细胞.Feridex与乳腺癌干细胞共同孵育后,Prussian blue染色及透射电镜均显示乳腺癌干细胞胞浆中含有氧化铁颗粒.随Feridex浓度的增高(15～25μg/mL),Feridex对乳腺癌干细胞存活、繁殖能力的影响差异无统计学意义(P>0.05).当Feridex的浓度大于35μg/mL时,影响其存活和繁殖(P<0.05).结论 本实验利用Feridex作为磁标记探针,对乳腺癌干细胞进行成功磁标记,为进一步利用核磁共振(MRI)对乳腺癌干细胞活体追踪奠定实验基础.     

7.0T磁共振对磁标记单细胞的成像研究

目的 7.0T MR系统对氧化铁纳米粒子标记单细胞进行体外成像,并对成像参数进行探讨.方法 3D-FLASH序列对磁标记单细胞计数,对比梯度回波序列与自旋回波序列成像差异,对比梯度回波序列不同回波时间、不同分辨率成像差异.结果 7.0T MR能对磁标记单细胞进行成像,MR图像对细胞浓度为2×103/ml的琼脂糖模型进行细胞计数为1.7×103/ml,与实际浓度一致.2D-FLASH较SE序列对磁标记单细胞导致的T2*WI信号改变明显,差异有统计学意义;3D-FLASH序列随TE时间延长T2*效应增强,但图像伪影逐渐明显;分辨率降低单细胞导致的信号缺失明显降低,在200 μm时单细胞导致的信号波动已基本接近琼脂糖背景的内源性波动.结论 7.0T MR系统可对氧化铁纳米粒子标记的单细胞进行探测,选择适合的序列、优化序列内参数可有效提高磁标记细胞的探测敏感性.     

c-erbB2反义寡脱氧核苷酸联合紫杉醇对乳腺癌细胞SK-Br-3的抑制作用

目的：探讨以c-erbB2mRNA为靶点的反义寡脱氧核苷酸（ASODN）联合紫杉醇对乳腺癌SK—Br-3细胞的抑制作用．方法：实验分为7组：ASODN组,紫杉醇组,赫赛汀组,表阿霉素组,ASODN＋紫杉醇组,赫赛汀＋紫杉醇组,表阿霉素＋紫杉醇组．分别处理乳腺癌SK．Br-3细胞72h,MTF法测定细胞抑制率,中效原理判定药物联合应用的效果,WesternBlot检测细胞c—erbB2,Bcl-2蛋白表达水平．结果：各组中SK．Br．3细胞的抑制率均随药物浓度的增加而增大;紫杉醇的中效浓度紫杉醇组为0．14mol／L;ASODN＋紫杉醇组为0．07μmol／L,其合用指数（CI）〈1,为协同作用．ASODN＋紫杉醇组c-．erbB2,Bcl-2蛋白表达明显低于紫杉醇组,两组相比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）．结论：ASODN可明显增强紫杉醇对乳腺癌SK．Br．3细胞的抑制效应,可明显降低紫杉醇的用药量．     

反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)C基因翻译起始区和C基因区反义寡聚脱氧核苷酸对HBV表达的序列性抑制作用.方法以乙型肝炎病毒基因组(HBV DNA)转染人肝癌细胞系HepG2而建立起来的转染细胞系2.2.15作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区(C区)15聚反义硫代寡聚核苷酸(ASON),通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2.2.15细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)含量,提取细胞中的HBV DNA经PCR扩增后,用Southern blotting方法对PCR产物进行半定量分析.结果与HBV mRNA C基因起始区互补的反义硫代寡核苷酸序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性.ASON作用24 h后的细胞培养上清液及细胞内HBV DNA量比对照组明显减少.另外,ASON对细胞生长无毒性作用.结论反义硫代寡核苷酸能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达.     

针对c-myc mRNA两个不同位点的c-myc反义寡脱氧核苷酸抑制类风湿滑膜细胞增殖的比较

目的:研究针对c-myc mRNA不同位点的两种反义寡脱氧核苷酸序列(AS-ODN):myc-AUG AS-ODN,myc-CRD AS-ODN,对类风湿滑膜细胞增殖的抑制作用.方法:培养人类风湿滑膜B型细胞,合成反义寡脱氧核苷酸序列并进行硫代磷酸化修饰,以脂质体Lipofectin为载体,转染滑膜细胞,用MTT法检测细胞的增殖情况.结果:myc-AUG AS-ODN,myc-CRD AS-ODN均能抑制滑膜细胞增殖,使细胞数目减少的最大值分别为40.0%和41.4%.myc-AUG AS-ODN抑制滑膜细胞增殖的起效时间早于myc-CRD AS-ODN.在高浓度时寡脱氧核苷酸具有非序列特异性细胞毒作用.结论:两种AS-ODN序列均可用于抑制滑膜细胞增殖.     

99mTc标记c-erbB2反义寡脱氧核苷酸对乳腺癌显像的实验研究

用放射性核素标记癌基因反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）对肿瘤进行显像，可以探测只有癌基因激活、扩增和过度表达还没有形成实体的肿瘤组织，以实现对肿瘤的早期诊断。乳腺癌是妇女发病率和死亡率最高的主要恶性肿瘤，如果能在肿瘤早期鉴别其癌基因的表达类型及临床分期，施行“量体裁衣”式的治疗，可提高乳腺癌治疗的效果。c-erbB2是乳腺癌原癌基因，与乳腺癌的恶性转化和不良预后密切相关。     

纳米级超顺磁性氧化铁的制备及其对小鼠急性毒性作用的观察

目的:自制纳米级超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO),观察其对小鼠的急性毒性作用,为进一步研究其长期毒性及将其作为载体应用于磁共振(magnetic resonance, MR)基因成像奠定基础.方法:采用共沉淀法制备纳米级SPIO,应用透射电镜、原子力显微镜及1.5 T超导型MR仪等测定其相关理化指标.90只小鼠按纳米级SPIO给药方式和剂量随机分为口服灌胃、静脉注射、腹腔注射组(n=30),分别按总剂量2 104.8 mg/kg、给药容积40 ml/kg口服灌胃;总剂量438.5 mg/kg、给药容积25 ml/kg静脉注射;以及总剂量1 578.6 mg/kg,给药容积30 ml/kg腹腔注射;各组另设10只小鼠按相应方式给予等量生理盐水作为对照(n=10).给药后饲养14 d,观察饲养期间小鼠的一般情况,检测小鼠血清主要生化指标;观察主要脏器的病理学改变.结果:成功制备纳米级SPIO,其核心颗粒为Fe3O4 晶体,颗粒大小20～35 nm,T2弛豫率0.155×106 mol-1·s-1,比饱和磁化强度68.395 68 emu/g,剩磁21.463 74 Gs.观察期间各组小鼠均未见死亡;各组小鼠血清生化指标无显著差异;H-E染色及Wright骨髓染色见各组小鼠肝、脾、肾、心、肺和骨髓细胞均无水肿、变性、坏死等改变;普鲁士蓝染色见给药组小鼠肝、脾内分布少许铁蓝色颗粒,而对照组未见.结论:自制的纳米级SPIO符合作为MR成像对比剂的要求,对小鼠无明显急性毒性,值得进一步研究以用于磁共振基因成像.     

超顺磁性葡聚糖氧化铁纳米颗粒的研制及表征

目的 制备葡聚糖包被的超顺磁氧化铁（SPIO）纳米粒子,并对其主要物理性质和磁学性质进行研究。探讨它作为磁共振造影剂的可能性。方法 通过共沉淀法获得SPIO纳米粒子,分别采用透射电镜和光子相关光谱仪测定其粒径大小,利用邻苯二氮菲比色法测定铁的浓度,同时用核磁共振仪测定弛豫率等参数。结果 X-射线衍射分析确定所制备的葡聚糖磁性粒子主要为Fe3O4晶体,粒子体均粒径为85．9nm,氧化铁核心大小为15nm左右,具有超顺磁性,其弛豫率和质量磁饱和度分别达到0．1567mmol／ms和80emu／gFe。结论 所制备的SPIO粒子稳定,其物理性质表明其具有作为磁共振造影剂的特性。     

SPIO标记的c-erbB2反义探针用于活体荷瘤裸鼠MRI的最佳扫描浓度

目的探讨SPIO标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针用于活体荷瘤裸鼠MRI的最佳扫描浓度。方法BALB/c荷瘤裸
鼠30 只,随机分为5 组并每组注射不同浓度反义探针（含Fe 6.0 、9.0、12.0、15.0、18.0 mg/kg）,每组裸鼠于既定的时间点（注射
前、注射后360 min）同步行MRI扫描。在完成MR扫描后,立即处死荷瘤裸鼠,取出肿瘤组织,行HE及普鲁士蓝染色,光学显微
镜下观察;测量肿瘤组织在注射不同浓度反义探针前后的信号强度变化。结果成功建立荷瘤裸鼠模型,成瘤率100%。6.0、9.0
及12.0 mg组裸鼠注射探针后均存活,但15.0 mg组及18.0 mg组注射探针及扫描完成后存在部分裸鼠死亡;对比荷瘤裸鼠肿瘤
组织在不同浓度反义探针注射前后的信号强度变化,发现12.0、15.0及18.0 mg组裸鼠在注射探针后,肿瘤组织信号强度变化
更具显著性（P<0.001）;肿瘤组织信号强度均明显变化并可达到明显肉眼辨识水平,在MR扫描图像上能够清楚显示,并且
12.0 mg组、15.0 mg组及18.0 mg组的统计学差异无显著性（P>0.05）。HE染色发现肿瘤组织结构紊乱,存在大量异性肿瘤细胞,
排列呈“癌巢”状,在各浓度组表现相似;而普鲁士蓝染色发现各浓度组的肿瘤组织标本中均散在分布斑点状蓝色铁颗粒,
12.0 mg组、15.0 mg组及18.0 mg组分布均密集明显。结论SPIO标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针能靶向于肿瘤组织,用
于BALB/c裸鼠MRI的最佳扫描浓度为含Fe 12.0 mg/kg。
     

壳聚糖和油酸钠修饰的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的细胞毒性

目的 研究壳聚糖和油酸钠修饰的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子（superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs）的细胞毒性,为临床应用提供实验依据。方法 用透射电子显微镜对壳聚糖SPIONs和油酸钠SPIONs进行形态学观察;用10 μg/mL的壳聚糖SPIONs和油酸钠SPIONs悬液处理体外培养的人肺腺癌细胞A549,普鲁士蓝染色观察2种SPIONs在细胞内的分布;用不同浓度（0、25、50、100和200 μg/mL）的2种SPIONs分别处理A549细胞,MTT法测定细胞生长活性;2种SPIONs染毒A549细胞48 h时,测定上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性;DAPI染色法观察细胞凋亡情况。结果 （1）2种SPIONs均呈类球形结晶,粒径20~30 nm,此时四氧化三铁纳米粒子之间的热振动能足以克服磁吸引力而呈现超顺磁性。（2）普鲁士蓝染色显示细胞内可见蓝色沉着,说明2种SPIONs均可进入A549细胞内。（3）MTT检测结果显示壳聚糖SPIONs对细胞生长几乎无抑制,而200 μg/mL 油酸钠SPIONs在48 h和72 h时对细胞有明显的抑制作用（P<0.05）。（4）200 μg/mL壳聚糖SPIONs染毒细胞的上清液中LDH活性稍高于对照组（P<0.05）,而100 μg/mL和200 μg/mL油酸钠SPIONs染毒细胞的上清液中LDH活性均高于对照组（P<0.05）,同时也高于相同浓度壳聚糖SPIONs染毒组（P<0.05）。（5）DAPI凋亡检测显示,壳聚糖SPIONs染毒细胞与对照组间差异无统计学意义,而油酸钠SPIONs染毒细胞发生明显的细胞核皱缩及胞核碎裂现象,且细胞凋亡率高于对照组（P<0.05）。结论 壳聚糖SPIONs与油酸钠SPIONs相比具有较低的细胞毒性。     

甘露糖修饰超顺磁纳米颗粒的制备及体外特性分析

目的探讨以甘露糖(mannose)修饰超顺磁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPION)的制备方法并检测其理学性质,通过体外实验探讨该体系能否被网状内皮系统吞噬。方法采用共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒,然后加入甘露糖溶液,在通氮条件下90℃剧烈搅拌2 h,得到甘露糖包被的SPION。透射电镜测量其大小和分布,傅里叶红外光谱判断甘露糖修饰效果,采用原子吸收分光光度计检测样品中铁含量,体外白细胞吞噬实验检测其能否被白细胞吞噬,细胞毒性实验检测样品的安全性。结果所得样品为球形或类球形,分散性好,核心为Fe3O4晶体,核心粒径为(12.89±3.29)nm,包被甘露糖后的整体颗粒直径不超过20 nm;样品的铁含量为69.84 mg/L;红外吸收光谱测定结果表明甘露糖成功结合到Fe3O4的表面;体外白细胞吞噬实验表明白细胞对甘露糖修饰的SPION的吞噬率较高,细胞毒性实验表明其对细胞的IC50为100.44μg/ml。结论制备的mannose-SPION具有粒径小、分散性好、超顺磁性等优点,容易被吞噬细胞吞噬,且细胞毒性较低。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究

目的:使用超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)对成肌细胞进行体外标记,探讨SPIO标记方法及SPIO对细胞的影响.方法: 常规方法进行成肌细胞培养,应用脂质体包被的SPIO标记成肌细胞,用光镜及电镜观察标记效率及对细胞增殖的影响,台盼蓝染色及JC-1观测SPIO对细胞活力的影响.结果: 普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒,单纯SPIO标记有效率为50%,脂质体包被的SPIO标记有效率为100%,电镜也观测到细胞内的SPIO颗粒.SPIO标记对细胞无毒性,不影响细胞的增殖及活性.结论: 脂质体包被SPIO标记成肌细胞方法简单、高效、无毒,可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究.     

超顺磁性氧化铁标记的骨髓单个核细胞在急性心肌梗死环境中的分化研究

目的 初步探讨超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIOs)标记的猪骨髓单个核细胞(BM-MNCs)在急性心梗环境中向心肌样细胞分化的能力.方法 分离培养猪BM-MNCs,SPIOs标记,制备猪急性心梗模型,1周后经冠状动脉植入SPIOs标记的BM-MNCs,4周后行MILI示踪定位,心肌组织切片,利用Prussian blue染色、免疫组化、透视电镜及病理图文分析系统对标记细胞的分化行为进行研究.结果 4周后实验组心肌梗死周边区MRI可检测到点片状模糊低信号区(T2WI),Prussian blue染色及透视电镜显示胞浆中舍有铁粒子,免疫组化提示标记细胞结蛋白(Desmin)、肌球蛋白重链(MHC)表达阳性,同时CD68表达阴性,病理图文定量分析显示实验组梗死周边区结蛋白、肌球蛋白重链表达较对照组有所增加,差别具有显著性(P＜0.05).结论 SPIOs标记的BM-MNCs在急性心梗环境中仍具备向心肌样细胞分化的能力.     

小鼠胚胎干细胞磁标记共振成像的研究

目的 应用超顺磁氧化铁（SPIO）标记小鼠胚胎干细胞（ESC）,并行磁共振成像,为心肌细胞移植体内示踪作初步准备。方法 小鼠ESC及其分化的心肌细胞与SPIO孵育后行电镜分析、细胞内铁含量测定、[Ca^2＋]共聚焦测定和MR成像。结果 铁颗粒分布在胞质吞饮小泡内;使用转染技术的铁摄取高于未使用组;T2WI和T2^＊ WI扫描序列均见标记细胞呈信号下降,程度随标记浓度的增加而增强;T2^＊ WI图像信号强度变化更大。标记心肌细胞在T2^＊ WI序列也呈显著的低信号改变。结论 SPIO可有效标记ESC及其分化的心肌细胞,对细胞活性和分化能力无明显影响。常规1．5TMR仪可进行标记细胞成像。