小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca-F的再克隆技术

[目的 ]探讨小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca -F的再克隆技术。 [方法 ]采用有限稀释法对已使用多年的小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca -F进行再克隆 ;6 15小鼠皮下接种 ,检测再克隆瘤株淋巴结转移能力。 [结果 ]共分离出 3个不同的瘤株 ,Hca -F - 2 - 2 4c6 ,Hca -F -3-d4 ,Hca -F - 3-a4 ,流式细胞仪检测证明 3株瘤细胞均为单克隆细胞。动物实验证明三株瘤细胞淋巴结转移率分别为 95 .5 % ,87% ,4 2 .5 %。 [结论 ]有限稀释法操作简单 ,克隆的形成率高     

小鼠腹水型肝癌高低转移细胞株DARS2蛋白表达的差异

[目的]研究具有高、低转移潜能的小鼠腹水型肝癌细胞株Hca -F与Hca -P中线粒体的天门冬氨酰转移核糖核酸合成酶( DARS2)蛋白表达的差异.[方法]将Hca -F细胞与Hca -P细胞分别接种于615小鼠腹腔,抽取腹水,培养后收集细胞;用免疫印迹分析及免疫细胞化学方法检测Hca -F与Hca -P细胞的DARS...     

高低转移性小鼠肝癌细胞系基因组的不稳定性

目的：了解小鼠高、低转移性肝癌细胞系Hca／16A3—F(F)和Hca／A2—P(P)发生基因组不稳定性情况。方法：随机选择小鼠7号和ll号染色体上21个微卫星多态标记，采用聚合酶链式反应—简单重复序列多态性(simple sequence length poly—morphism，SSLP)方法对F和P细胞系进行分析。结果：F和P细胞系有信息的微卫星基因座等位基因与近交系C3H小鼠相同，且存在多基因座等位基因异常；P和F细胞在3个基因座表现不同的等位基因条带。结论：小鼠高、低转移性肝癌细胞系存在基因组不稳定性，并在小鼠肝癌的发生、发展中起重要作用；源自纯合性小鼠的一个肿瘤的两个亚克隆细胞系存在不同的遗传学特征。     

小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6细胞模型的建立及其药物敏感性的评价

[目的]建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6细胞模型并应用姜黄素对该模型的药物敏感性进行评价。[方法]将小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株（HCa-P）经615小鼠腹中线皮下接种的方法获得淋巴结转移瘤1代细胞HCa-P/L1,再经小鼠淋巴系统筛选5次,筛选高转移细胞系HCa-P/L6。用15～240μmol·L^-1姜黄素（Curcumin,Cur）分别处理人肝癌细胞系（SMC7721和HepG2）和小鼠腹水型肝癌细胞（HCa-P/L6和HCa-P）48h,以MTT法考察4种细胞的药物敏感性。以非细胞毒性最大剂量Cur作用于HCa-P/L6和HCa-P,以生长曲线和群体倍增时间评估药物对细胞生长的影响,以流式细胞仪检 测药物对细胞周期分布的影响,考察两株小鼠腹水型肝癌细胞与姜黄素作用敏感性的差异。[结果]从HCa-P中筛选出具有多部位转移特性的淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6,转移率为100%。Cur明显抑制小鼠腹水型肝癌和人肝癌细胞的增殖,并呈 剂量依赖性（方差分析P〈0.05）。在30～120μmol·L^-1,Cur对小鼠肝癌的抑制作用强于对人肝癌的抑制作用;在60～240μmol·L^-1范围内,Cur对HCa-P/L6的抑制作用强于对HCa-P。在非细胞毒性最大剂量15μmol·L^-1 Cur作用下,HCa-P/L6和HCa-P的生长受到抑制（t检验P〈0.05）,并且呈时间依赖性（方差分析P〈0.01）,HCa-P/L6和HCa-P的群体倍增时间延长（卡方检验P〈0.01）,Cur对HCa-P/L6的抑制作用大于对HCa-P;细胞周期被重新分布,HCa-P/L6被阻滞在S期,HCa-P被阻滞于S期和G2/M期。[结论]从HCa-P中筛选出了淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6。小鼠腹水型肝癌比人肝癌对姜黄素作用敏感,而且高转移细胞株系HCa-P/L6较低转移细胞株HCa-P对Cur更为敏感。HCa-P/L6为肿瘤淋巴道转移机制和中药活性成分筛选的研究提供了一个新的敏感模型。     

香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414对小鼠肝癌细胞Hca生物学功能的影响

[目的]通过诱导表达香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414,研究其对小鼠肝癌细胞Hca的生物学功能影响,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的机制。[方法]构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414,用毕赤酵母GS115体系进行诱导表达,将已鉴定的诱导表达蛋白作用于小鼠肝癌细胞Hca,用MTT法测定不同浓度目的蛋白组、顺铂(DDP)组及空白对照组的抑瘤率,用流式细胞术检测目的蛋白对肿瘤细胞的凋亡作用,同时用MTT法检测目的蛋白对正常鸡胚成纤维细胞的毒性作用。[结果]Western-blot结果显示目的蛋白成功表达;MTT法检测结果显示,不同浓度此蛋白对Hca细胞的生长抑制作用(OD595)与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05),7.5μg/mL、15μg/mL和30μg/mL目的蛋白的最大抑瘤率分别为70.03%、82.02%和74.66%,均超过5μg/mL DDP的作用;流式细胞术结果显示,此蛋白具有诱导Hca细胞凋亡的能力,早晚双期细胞凋亡诱导率与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05),浓度为30μg/mL时诱导凋亡的作用最强,早晚两期凋亡率分别为(9.28±0.04)%和(9.37±0.03)%;同时此蛋白对正常细胞无毒性作用。[结论]香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中成功诱导表达,此蛋白对小鼠肝癌细胞Hca生长具有抑制作用,能够诱导其产生凋亡,为进一步深入研究香菇菌C91-3的抗肿瘤机制奠定了基础。     

hTWEAK基因重组慢病毒载体构建、病毒包装及蛋白表达分析

目的:构建携带人肿瘤坏死因子样微弱凋亡诱导剂(hTWEAK)基因的慢病毒表达载体,体外包装成病毒颗粒,并分析其感染人肝癌细胞HepG2后TWEAK的表达情况。方法:以pORF5-TWEAK为模板,采用普通PCR扩增TWEAK基因,通过酶切、连接等步骤构建Plentilox3.7-TWEAK重组质粒,利用酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。在293T细胞中包装含TWEAK基因的慢病毒颗粒并感染HepG2细胞,采用荧光定量PCR和Western-blot检测TWEAK表达水平,并通过间接免疫荧光(IMF)检测其细胞表达定位。结果:酶切与测序结果证明重组质粒构建成功,并能在293T细胞中与病毒包装质粒成功包装病毒颗粒。病毒转染的HepG2细胞中,TWEAK基因mRNA表达量约为对照组的500倍,TWEAK蛋白表达量明显高于对照组,且主要定位于胞浆。结论:本研究成功构建了含人TWEAK基因的慢病毒表达载体,其可在人肝癌细胞系HepG2中稳定表达,为后续的功能学研究打下了基础。     

恢复野生型PTEN基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468体外生物学行为的影响

目的研究野生型PTEN基因转染对人炎性乳腺癌MDA—MB-468细胞体外生物学行为的影响及机制。方法应用基因重组技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN，用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA—MB-468，用RT—PCR、免疫组化及免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达，并用免疫印迹方法检测转染后，在表皮生长因子的诱导下，磷酸化蛋白激酶B（PKB／Akt）的表达，四甲基唑蓝（MTT）法分析细胞增殖。Annexin V—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果RT—PCR、免疫组化及免疫印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达，且显示转染组在表皮生长因子的诱导下，p-Akt蛋白表达下调。MTT检测表明pcDNA3．1-PTEN转染组活细胞数较其它各组均低（P〈0．01），流式细胞分析其凋亡率达21．68％。结论野生型PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导乳腺癌MDA—MB-468细胞凋亡。     

腺病毒介导反义c—myc基因诱导人肝癌细胞凋亡的分子机制

目的：观察重组腺病毒介导反义c-myc基因（Ad-ASmyc)诱导体外培养不同人肝癌细胞凋亡的差异并探讨其分子生物学机制。方法：Ad-ASmyc感染人肝癌细胞系后，观察细胞生长形态变化，通过细胞生长存活率，流式细胞仪分析、RT－PCR、Western Blot分析Ad-Asmyc对人肝癌细胞系BEL－7402、QSG－7701、SMMC－7721和HCC－9204细胞凋亡诱导、c-myc和bcl-2基因表达的影响。结果：Ad-Asmyc可高效转导4种人肝癌细胞系（BEL－7402、QSG－7－1、SMMC－7721和HCC－9204细胞），镜下可见细胞凋亡的形态学变化并出现“凋亡小体”，细胞存活率分别为对照组的（37．7％、49．3％、51．3％和43．1％），诱导肝癌细胞GI期阻滞和凋亡，4种人肝癌细胞系均为c-myc 、bcl-2RNA及c-myc蛋白水平高表达，但表达水平有差异，Ad-ASmyc作用后，其表达水平均明显下降。结论：重组腺病毒介导的反义c-myc基因能够诱导体外培养人肝癌细胞凋亡，引起人肝癌细胞c-myc、bcl-2RNA及c-myc蛋白表达下调和细胞生长抑制，其诱导凋亡的程度与肝癌细胞内的c-myc表达水平密切有关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制肝癌细胞P16、P27的表达

目的：探讨HCV核心蛋白对肝瘤细胞P16、P27表达的影响。方法：将HCV核心基因cDNA插入真核表达载体PBK－CMV的Hind　Ⅲ和BamH I位点间，构建重组质粒PBK－HCVc。再将重组质粒PBK－HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT－PCR、蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达。免疫组化，蛋白印迹检测P16、P27蛋白表达；RT－PCR检测P16、P27mRNA。结果：重组质粒PBK－HCVc在HepG2细胞中有稳定表达；表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的P16、P27在蛋白水平和mRNA水平较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显下降。结论：HCV核心蛋白能抑制P16、P27表达，可能与肝细胞的癌变有关。     

重组腺病毒介导P21WAF1/CIP1诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的体外实验研究

目的：研究基因转移P21^WAF1/CIP1过量表达对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法：构建缺陷型重组腺病毒载体：在CMV启动子控制下的p21 cDNA(Ad-P21)，其编码人P21蛋白。通过流式细胞仪，RT－PCR进行P21表达检测；应用TUNEL法，荧光显微镜和流式细胞仪进行相关凋亡检测，分析。结果：RT－PCR检测5株亲本胶质瘤细胞表达p21 cDNA，而流式细胞仪未检测到P21表达；Ad-P21转染的胶质瘤细胞株均过量表达P21；在体外通过细胞形态学，分子生物学检测均证实Ad-P21能诱导胶质瘤2细胞向终末分化并诱导细胞凋亡。结论：基因转移P21^WAF1/CIP1为研究基因治疗恶性脑胶质瘤提供了有效的手段。     

膜联蛋白A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立

目的:建立针对膜联蛋白A7(annexin A7)的shRNA(small hairpin RNA)稳定转染的小鼠肝癌细胞株Hca-F,为后续研究奠定基础.方法:构建3条针对annexin A7的shRNA(shRNA1、2、3),分别与pSilencer连接,构建表达载体并分别转染Hca-F细胞,在mRNA和蛋白质水平比较3条shRNA对annexin A7表达的抑制作用,筛选抑制效果最好的shRNA转染Hca-F.稳转后用含400 μg/ml G418的完全培养基筛选,获得annexin A7表达稳定下调的Hca-F细胞株后传代扩增,应用Western印迹法检测Hca-F细胞annexin A7蛋白的表达,并与空载体转染组及正常对照组进行比较.结果:经DNA测序鉴定,所得到干扰序列与GenBank中序列一致;筛选出其中shRNA1对annexin A7的表达抑制效果最好.pSilencer-shRNA1转染Hca-F细胞株后,annexin A7蛋白的表达远低于空载体转染组和正常对照组(0.318 6 vs 0.798 7,0.824 3,P<0.05),而后二者间无统计学差异.结论:成功建立了annexin A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为后续研究奠定了基础.     

骨肉瘤组织中MICA基因mRNA和蛋白的表达

【目的】 检测骨肉瘤组织中MHC I类链相关蛋白A(MHC class I chain-related A,MICA)基因mRNA和蛋白的表达情况,为探讨骨肉瘤的肿瘤免疫机制提供信息&#65377; 【方法】 应用RT-PCR方法检测MICA mRNA在11例新鲜骨肉瘤组织和5个骨肉瘤细胞株中的表达情况;分别应用免疫组织化学方法&#65380;Western blot和流式细胞术检测66例石蜡包埋骨肉瘤组织&#65380;6例石蜡包埋正常人骨组织&#65380;9例新鲜骨肉瘤组织和5个骨肉瘤细胞株中MICA蛋白的表达情况&#65377; 【结果】 骨肉瘤组织中MICA mRNA表达率为81.8%(9/11),5个骨肉瘤细胞株均表达MICA mRNA;MICA蛋白在骨肉瘤组织和正常骨组织的表达率分别为51.6%(34/66)和0%(0/6);骨肉瘤细胞株Saos-2&#65380;MG63和HOS阳性表达膜表面MICA蛋白,而细胞株U2OS和OS732只有少量细胞呈阳性表达&#65377;【结论】 MICA mRNA和蛋白广泛表达于骨肉瘤组织和细胞株&#65377;     

沉默BIRC7基因的Jurkat稳定细胞系建立

 【目的】 通过RNA干扰技术(RNAi)建立稳定性BIRC7基因沉默的Jurkat实验细胞模型。 【方法】应用pSilencer 4.1-CMV neo 构建BIRC7 shRNA 表达载体，采用脂质体将载体导入Jurkat 细胞，利用G418筛选出稳定表达shRNA 细胞后，行RT-PCR 和Western blot 等技术检测细胞BIRC7表达水平。 【结果】成功筛选出分别携带二种重组shRNA表达的Jurkat细胞系。与对照组细胞相比，转染BIRC7 shRNA的细胞BIRC7 mRNA表达下降约＞70％，BIRC7蛋白表达减少＞60％。生长曲线显示生长速度减慢，细胞倍增时间延长。细胞凋亡率增加。【结论】稳定转染重组BIRC7 shRNA表达载体能有效干扰BIRC7基因表达，表明RNAi技术可以成为研究BIRC7基因功能的有效工具。BIRC7有可能成为白血病治疗的潜在新靶点。     

层粘连蛋白对两株小鼠肝癌克隆细胞系体外附壁及浸润的影响

Ｈｃａ－Ｆ和Ｈｃａ－Ｐ细胞系是从小鼠癌中分离出来的具有不同转移能力的两株克隆。在Ｃ３Ｈ／ｈｅｊ小鼠实验组显示，Ｆ细胞比Ｐ细胞具有较强的侵袭力和淋巴道转移能力。在体外附壁实验中，Ｆ细胞比Ｐ细胞更易贴附于层粘连蛋白上，而且，在后者加上Ⅳ型胶原基质后，Ｆ细胞的贴壁能力更增强；纤维连接蛋白加上Ⅳ型胶原可促进Ｐ细胞贴壁。     

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

Lin28与肝癌细胞紫杉醇耐药关系的研究

[目的]Lin28是一种重编程因子和保守的RNA结合蛋白,存在Lin28A和Lin28B两种同源基因,两者结构和功能类似。本研究旨在探讨Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药的关系。[方法]MTT法检测紫杉醇对HepG2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞的IC50;用荧光定量PCR法（简称RTPCR）在RNA水平检测Lin28A和Lin28B在Hep3B、HepG2、SMMC-7721中的表达,蛋白质印迹法分析Lin28A和Lin28B蛋白在Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞中的表达情况。[结果]Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株对紫杉醇的IC50分别为：Hep3B为0.194μM、HepG2为19.54μM、SMMC-7721为0.444μM。HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28A基因表达量分别是Hep3B的5.06、3.10倍;HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28B基因表达量分别是Hep3B的7.16、3.16倍。Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株中Lin28A和Lin28B蛋白的表达量与从荧光定量数据显示的趋势一致。[结论]Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药密切相关,肝癌细胞中Lin28表达与肝癌细胞对紫杉醇的耐药性成正比,暗示Lin28表达可能是肝癌细胞紫杉醇耐药的潜在机制并有望成为逆转肝癌紫杉醇耐药的靶点。     

白介素1-β对人肺腺癌细胞COX-2表达的作用及调节机制

目的 探讨细胞因子白介素-1β（IL-1β）对人肺腺癌细胞株A549细胞环氧合酶2（COX-2）表达的影响及调节机制。方法 A549细胞培养达80％融合后，用不同浓度的IL-1β（0、0.1、1、5和10ng／mL）干预或用5ng/mL IL-1β干预不同时间（0、3、6、9、12和24h）观察白介素-1β（IL-1β）对A549细胞COX-2表达的影响；用5ng／mL IL-1β与有丝分裂原激活的细胞外调节激酶（ERK）抑制剂PD098059、P38有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）抑制剂SB203580、蛋白激酶C（PKC）抑制剂H-7共同干预A549细胞观察IL-1β诱导A549细胞COX-2表达的信号传导途径；用COX-2系列报告基因质粒及对照质粒转染A549细胞后予以IL-1β干预，以不加IL-1β干预的细胞为对照组观察IL-1β对COX-2启动子的影响；westem blot检测COX-2蛋白表达，RT—PCR检测COX-2 mRNA表达。COX-2报告基因活性应用荧光素酶活性分析法测定。结果 A549细胞COX-2蛋白表达和mRNA表达呈IL-1β浓度依赖性表达增加，干预9h表达达高峰；SB203580、H-7可明显抑制IL-1β诱导A549细胞COX-2表达，PD098059对IL-1β诱导A549细胞COX-2表达无影响；IL-1β对COX-2报告基因无影响。结论 PKC途径和P38 MAPK途径参与IL-1β诱导A549细胞COX-2蛋白表达。     

shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK的表达及细胞迁移和侵袭

目的：研究shRNA对小鼠肝癌细胞株Hca-F JNK基因表达的抑制作用及对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,阐明JNK表达水平与小鼠肝癌细胞淋巴转移潜能的关系。方法：构建3条shRNA表达载体,以脂质体法稳定转染Hca-F细胞;RT-PCR 和 Western blotting检测shRNA对JNK基因和蛋白表达的抑制作用,筛选出RNA干扰效果最好的shRNA;Transwell 实验检测Hca-F细胞穿膜细胞数观察shRNA对Hca-F细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。结果：成功构建pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞,筛选出对JNK表达抑制效果最好的shRNA;其转染后JNK mRNA表达水平与其他组比较明显下调 ( P<0.01 );JNK蛋白质表达水平与其他组比较明显减少 ( P<0.01 );转染shRNA后Hca-F细胞穿膜细胞数均显著下降（P<0.05）。结论：通过建立pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞株,获得JNK表达稳定下调的Hca-F细胞株,抑制JNK表达水平可降低小鼠肝癌细胞的迁移和侵袭能力,JNK可能是决定肝癌淋巴转移潜能的重要基因之一。     

烟酰胺磷酸核糖转移酶在大鼠涎腺的表达及定位

[目的]研究烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt)在大鼠涎腺的表达和分布.[方法]应用半定量逆转录聚合酶链法(RT-PCR)和免疫印迹法检测大鼠正常腮腺、颌下腺和大舌下腺组织Nampt mRNA及蛋白质的表达.采用免疫组织化学法检测大鼠腮腺、颌...