激发型抗CD40单克隆抗体对CD40+B细胞恶性肿瘤的生长抑制和促凋亡作用

目的　研究CD40 抗原在恶性B淋巴细胞肿瘤中的表达及其CD40 抗原激发所致的生物学效应。方法　将激发型CD40 单克隆抗体 (单抗 ) 5C11加入肿瘤细胞的体外培养体系 ,采用细胞计数、流式细胞仪分析等方法分析单抗 5C11对不同肿瘤细胞株的作用。结果　 5C11能引起CD40 表达强阳性的多发性骨髓瘤 (MM)细胞XG2发生同型聚集 ,抑制其生长并介导细胞凋亡 ;5C11可引起CD40 的恶性B淋巴瘤细胞株Daudi发生同型聚集 ,抑制其生长并使细胞发生G2 M期阻滞 ,但并不介导细胞凋亡。结论　激发型CD40 单抗通过诱导恶性B淋巴瘤细胞的凋亡或使G2 M期细胞阻滞 ,抑制肿瘤细胞的体外生长     

抗CD20单克隆抗体诱导B淋巴瘤细胞株凋亡的实验研究

本研究探讨抗CD20单克隆抗体体外诱导B淋巴细胞株凋亡情况及其可能的作用机制。体外培养Daudi、Ramos、Namalwa和Raji细胞,采用XTT法测定细胞增殖抑制率;用流式细胞术测定细胞凋亡;Western blot测定Daudi、Ramos、Raji和Namalwa细胞经Rituximab 20μg／ml作用24小时后Bcl-2的表达情况。结果表明：抗cD20单克隆抗体对Daudi、Raft和Namalwa淋巴瘤细胞有轻度的抗增殖作用,对Ramos细胞无抗增殖作用,抗增殖作用与单克隆抗体作用浓度无关。抗CD20单克隆抗体对4株细胞无明显诱导凋亡作用,抑制率在3％-10％之间波动。Na—malwa和Raji细胞株经抗CD20单克隆抗体作用24小时后,Bcl-2蛋白表达下调。结论：单药抗CD20单克隆抗体对Daudi、Namalwa和Raji细胞株有轻度抗细胞增殖作用,但与作用浓度和作用时间无明显相关。单药抗CD20单克隆抗体对Daudi、Namalwa、Raji和Ramos细胞株有微弱的诱导凋亡作用。Namalwa和Raji细胞株经抗CD20单克隆抗体作用24小时后Bcl-2表达下调,这可能是抗CD20单克隆抗体增敏细胞毒药物作用的机制之一。     

三氧化二砷诱导淋巴瘤Raji细胞凋亡与细胞周期阻滞

本研究探讨研究三氧化二砷（As2O3）对人淋巴瘤Raji细胞株凋亡诱导的作用特点及其机制。用MTT比色法观察不同浓度As2O3对Raji细胞的增殖抑制效应，电子显微镜观察不同浓度As2O3作用不同时间后细胞的凋亡形态，DNA-ladder琼脂糖凝胶电泳观察凋亡条带，流式细胞术检测Raji细胞凋亡、细胞周期分布。结果表明：1—8μmol／LAs2O3能明显抑制Raji细胞的活力，并存在一定的量效、时效关系。2—8μmol／L浓度的As2O3可以诱导Raji细胞周期阻滞及凋亡，而1μmol／LAs2O3不诱导细胞凋亡，只是通过细胞周期阻滞作用抑制细胞增殖。结论一定浓度三氧化二砷可以抑制Raji细胞的增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡。细胞周期阻滞伴随细胞凋亡而发生。     

体外Rituximab增敏吉西他滨/长春瑞宾细胞毒作用的实验研究

本研究探讨抗CD20单抗利妥昔(Rituximab,RTX)对Gemcitabine和Navelbine的化疗增敏作用及其可能的作用机制。体外培养Daudi、Ramos、Namalwa和Raji细胞,采用XTT法测定细胞增殖抑制率,计算出各自的IC50;比较Gemcitabine或Navelbine单药及Gemcitabine或Navelbine分别与RTX两药协同作用的IC50;用Western blot测定Daudi、Ramos、Raji和Namlwa细胞经RTX20μg/ml作用24小时后抗凋亡蛋白BCL-2的表达情况。结果表明:单药抗CD20单克隆抗体对4株细胞无明显诱导凋亡作用,抑制率在3%-10%之间波动。RTX可使Gemcitabine或Navelbine对Daudi、Namalwa和Raji细胞株的细胞毒作用有明显增强;在Namalwa和Raji细胞株经RTX作用24小时后,BCL-2蛋白表达下调。结论:RTX对新一代细胞毒药物Gemcitabine或Navelbine有明显的细胞毒增敏作用。Namalwa和Raji细胞株经RTX作用24小时后BCL-2表达下调,这可能是RTX增敏细胞毒药物的机制之一。     

组成性JNK活化促进B淋巴瘤细胞增殖

本研究以人B淋巴瘤细胞系Daudi和Raji为研究对象,探讨组成性JNK活化对B淋巴瘤细胞增殖的影响。用Western blot检测Daudi、Raji B淋巴瘤细胞中组成性JNK的变化;用免疫荧光方法检测Daudi、raji B淋巴瘤细胞中JNK的亚细胞定位;用JNK抑制因子(SP600125)处理Daudi和raji B淋巴瘤细胞,用流式细胞术检测其细胞周期;用ATPLite法检测SP600125对Daudi、Raji B淋巴瘤细胞生长的影响。结果显示:Daudi和raji B淋巴瘤细胞有组成性JNK活化;Daudi和raji B淋巴瘤细胞JNK亚细胞定位异常,存在不同程度的入核;JNK特异性抑制因子SP600125诱导B淋巴瘤细胞Daudi、Raji G2/M期细胞比例升高,并具有时间依赖性,且G0/G1峰前出现亚二倍体峰,证实SP600125在B淋巴瘤细胞中诱导G2/M阻滞和凋亡。ATPLite检测结果显示,SP600125显著抑制Daudi和Raji B淋巴瘤细胞的生长,并随着抑制因子浓度的升高,抑制作用更加明显,呈现剂量依赖性。结论:组成性JNK活化促进Daudi和Raji B淋巴瘤细胞增殖。JNK活性的升高通过促进JNK从胞浆进入胞核来促进B淋巴瘤细胞的增殖。SP600125通过多种机制阻抑JNK的活性抑制B淋巴瘤细胞的恶性生长。JNK可作为临床治疗B淋巴瘤的潜在靶点。     

顺铂诱导Daudi细胞增殖抑制中分化抑制因子3的表达分析

目的 探讨Id3在顺铂诱导人Burkitt’s B淋巴瘤细胞（Daudi）增殖抑制和凋亡中的作用。方法 应用顺铂处理人Daudi细胞,台盼蓝染色法检测不同浓度的顺铂对Daudi细胞生长的抑制作用;流式细胞仪（FCM）分析细胞周期和凋亡率;用RT-PCR检测顺铂处理后Id3、Id2、钙调素（CaM）基因表达水平变化。结果 Daudi细胞增殖抑制率随顺铂浓度的增加而增加;2μg／ml的顺铂作用24h后,Daudi细胞表现出G1期阻滞,S期和G2／M期细胞比例下降;Annexin V／PI双染法和FCM结果表明,顺铂可诱导Daudi细胞发生凋亡;RT-PCR结果表明,顺铂处理Daudi细胞可导致Id3 mRNA的表达增加,而Id2、CaM mR-NA无明显变化。结论 Id3基因的上调表达可能在顺铂抑制Daudi细胞增殖、诱导细胞凋亡中发挥作用。     

硼替佐米对淋巴瘤细胞增殖、凋亡及SHP-2基因表达的影响

目的:研究硼替佐米对淋巴瘤细胞株Jurkat细胞和Raji细胞的增殖、凋亡及SHP-2基因表达的影响。方法:用MTT(噻唑蓝)实验观察不同浓度硼替佐米对Jurkat细胞和Raji细胞增殖的作用;利用细胞形态学检查、流式细胞仪检测细胞凋亡;用RT-PCR的方法检测硼替佐米处理淋巴瘤细胞株前后SHP-2基因的mRNA表达水平。结果:硼替佐米对Jurkat细胞和Raji细胞有抑制增殖,诱导凋亡的作用,并呈剂量和时间依赖性。在5-100 nmol/L硼替佐米处理后,Jurkat细胞株和Raji细胞株中SHP-2 mRNA的表达水平上调。结论:硼替佐米明显抑制Jurkat细胞株和Raji细胞株增殖,诱导其凋亡,上调细胞株SHP-2 mRNA的表达水平,表明SHP-2基因很可能参与了硼替佐米诱导Raji细胞和Jurkat细胞凋亡的调控。     

Daudi细胞CD40和CD40配体的共表达及其生物学意义

CD40抗原是属于TNFR超家族的细胞表面分子，广泛表达于B淋巴细胞的所有发育和分化阶段和一些其它特定细胞类型上。B细胞表达的CD40分子主要通过与表达在活化CD4T细胞上的CD40配体（CD40L）相互作用传递信号，从而调控B细胞的分化，特别是免疫球蛋白（Ig）的同型转换和生发中心（GC）的形成。我们首先检测CD40抗原和CD40L在细胞表面的表达和分布情况，然后分别用CD40和CD40L的阻断性抗体阻断这对信号，观察对细胞生长、增殖和凋亡的影响。     

抗CD20scFv/CD80/CD28/ζ重组基因修饰T细胞的构建与靶向杀伤效果

目的构建表达抗CD20scFv／CD80／CD28／ζ重组基因修饰T细胞，体外观察其特异性清除CD20^＋淋巴瘤细胞的能力，为肿瘤的过继免疫治疗提供新思路。方法采用DNA重组技术将pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含有抗CD20scFv／CD80的真核表达载体pLNCX质粒上，转染PA317包装细胞，挑取高滴度的包装细胞收获病毒，用收获的病毒感染刺激分裂的人外周血T淋巴细胞，经G418筛选1周后与CD20^＋淋巴瘤细胞株Daudi、Raji在体外共同培养，用非放射性的细胞杀伤试剂盒和ELISA检测试剂盒分别检测T细胞的抗原特异性杀伤和细胞因子分泌的功能。结果酶切及测序鉴定均证实pLNCX／抗CD20seFv／CD80／CD28／ζ构建成功，重组基因修饰的T细胞能在体外杀伤CD20^＋淋巴瘤细胞株Daudi、Raji，而对CD20^＋细胞株K562无杀伤作用，同时CD20^＋靶细胞组上清液中IL-2和IFN-γ水平与CD20^-组相比明显升高。结论重组基因修饰的CD20靶向性T细胞构建成功。该T细胞在体外能特异性杀伤CD20^＋淋巴瘤细胞株。     

氨茶碱对淋巴瘤细胞系增殖与凋亡的影响及机制探讨

为探讨磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）抑制剂在淋巴瘤细胞增殖与凋亡中的作用及机制，研究了非选择性PDE抑制剂氨茶碱（aminophylline，AM）对Burkitt淋巴瘤细胞系Raji的影响。采用MTT检测，光学显微术，电镜术及膜联蛋白V染色观察细胞增殖、细胞凋亡的形态学变化及凋亡率；用流式细胞术和RT-PCR技术检测细胞周期，周期蛋白B1和Bcl-2的表达及线粒体跨膜电位的变化。结果显示，氨茶碱对Raji细胞增殖呈浓度依赖性抑制作用；形态学观察发现随氨茶碱浓度增加，细胞体积明显缩小，核固缩，核染色质核膜下聚集，出现凋亡小体；细胞涂片显示，核染色质凝聚、核碎裂；电镜观察有典型凋亡细胞；膜联蛋白V染色显示氨茶碱诱导Raji细胞凋亡率增加，线粒体跨膜电位（Δφm）呈浓度依赖性下降；流式细胞术及RT-PCR显示氨茶碱下调Bcl-2蛋白及mR-NA的表达；细胞周期分析显示经氨茶碱处理的细胞出现S期阻滞、细胞周期蛋白B1表达下调。结论：氨茶碱可通过S期阻滞抑制细胞增殖、下调Bcl-2的表达及降低线粒体膜电位而诱导Raji细胞凋亡。     

骨髓基质细胞表面CD40分子配基化促进IL-6和Flt3配体的释放及其作用

目的：分析人骨髓基质细胞（BMSC）CD40分子及其配体（CD40L）的表达，观察BMSC经CD40激发型单抗（5C11）激发后，其培养上清中IL－3、IL－6、Flt3配体（FL）和干细胞因子（SCF）含量变化及对纯化脐血CD34^ 细胞的作用。方法：新鲜分离人骨髓单个核细胞，经体外培养获得BMSC。间接免疫荧光标记，流式细胞仪分析细胞表面CD40和CD40L的表达，并与5C11（20μg/ml）共同孵育，分别于24，48和72h取上清液，ELISA法测定IL－3、IL－6、FL和SCF含量；在与5C11共同培养24h后，收取培养上清，与纯化的脐血CD34^ 细胞共同孵育，1周后进行细胞计数、细胞集落培养，并用钙磷脂结合蛋白（Annexin V)标记，流式细胞仪分析细胞凋亡。结果：发现BMSC表达CD40分子，经5C11激发后，BMSC IL－6和FL分泌增加，而对IL－3及SCF含量无影响。BMSC经5C11激发培养后支持脐血CD34^ 细胞的增殖，培养7d后其细胞数和集落数显著多于对照组，且细胞凋亡率低，二者差异有显著性（P＜0．01）。结论：BMSC CD40分子配基化可促进IL－6和FL的分泌，并支持CD34^ 细胞的增殖，CD40／CD40L可能通过调节细胞因子的释放参与造血调控。     

激发型抗CD407单克隆抗体对CD40^＋B细胞恶性肿瘤的生长抑制 …

目的 研究ＣＤ４０抗原在恶性Ｂ淋巴细胞肿瘤中的表达及其ＣＤ４０抗原激发所致的生物学效应。方法 将激发型ＣＤ４０单克隆抗体（单抗）５Ｃ１１加入肿瘤细胞的体外培养体系,采用细胞计数,流式细胞仪分析等分析单抗５Ｃ１１对不同肿瘤细胞株的作用。结果５Ｃ１１能引起ＣＤ４０表达强阳性的多发性骨髓瘤（ＭＭ）细胞ＸＧ２发生同型聚集,抑制其生长并介导细胞凋亡;５Ｃ１１可引起ＣＤ４０＾＋的恶性Ｂ淋巴细胞株Ｄａｕｄｉ发     

诱导扩增脐血单个核细胞为T/NK细胞的实验研究

目的　探索体外诱导脐血单个核细胞 (MNC)扩增分化为T/NK细胞的最佳培养体系。方法　脐血MNC在 6种培养体系中培养 4周 ,于各时间点用流式细胞仪测定细胞表面T/NK标志抗原的表达 ;测定有核细胞 (NC)数 ;并行细胞形态学鉴定及细胞毒功能实验。结果　脐血MNC在SCF +FLT 3L +IL 7+IL 15 +TNF α +IL 2体系中培养 ,第 2 2天NC数达 (2 0～ 2 6 )× 10 6/ml;淋巴细胞占NC的比例和CD3 + T细胞占淋巴细胞的比例均达到 90 %以上 ,以CD8+ T细胞亚群为主 ,CD4+ T细胞亚群比例下降 ;CD56+ CD3 + NKT细胞和TCRγδ+ 细胞的比例分别由不足 2 %升高到 30 %～ 4 0 %和 10 %～ 15 %。CD3 -CD56+ NK细胞无扩增。培养后细胞在效靶比为 5 0∶1时对K5 6 2细胞和Raji细胞的杀伤率分别达75 %以上和 32 %～ 6 5 %。结论　本实验中体外诱导脐血MNC扩增分化为T/NK细胞的最佳培养体系为SCF +FLT 3L +IL 7+IL 15 +TNF α+IL 2 ,最佳扩增时间是培养后第 2 2天。     

Pioglitazone decreased CD40/CD40L expression on human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein

BACKGROUND: The CD40/CD40 ligand pathway mediated inflammatory processes are important in atherogenesis and the formation of the intraplaque lipid pool. We tested the hypothesis that pioglitazone could decrease lectin-like oxLDL receptor-1 (LOX-1) and CD40/CD40L expression on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by oxidized low-density lipoprotein (oxLDL). METHODS: HUVECs were incubated with oxLDL for 24h with or without pretreated by pioglitazone. Expression of CD40/CD40L on the cell surface was detected by flow cytometry. CD40/CD40L and LOX-1 mRNA expression were evaluated by RT-PCR. The expression of LOX-1 on HUVECs was determined by cell immunohistochemistry. RESULTS: OxLDL increased the expression of CD40 and CD40L in a dose- and time-dependent manner. Pretreatment of HUVECs with pioglitazone (1 and 10 micromol/l) for 60 min decreased the expression of CD40 mRNA induced by oxLDL by 16% and 52%, respectively (both P<0.05). Pretreatment of HUVECs with pioglitazone (1 and 10 micromol/l) for 60 min decreased the expression of CD40L mRNA induced by oxLDL by 16% and 43% (both P<0.05). Also, pretreatment of HUVECs with pioglitazone (1 and 10 micromol/l) for 60 min also significantly decreased CD40 and CD40L expression on HUVECs induced by oxLDL in a concentration-dependent manner. Pretreatment of HUVECs with pioglitazone (1 and 10 micromol/l) decreased oxLDL induced upregulation mRNA of LOX-1 by 11% and 28%, respectively. Furthermore, through immunohistochemistry, we found that pioglitazone could decrease the LOX-1 expression on HUVECs induced by oxLDL. CONCLUSION: Pioglitazone inhibited the upregulation of LOX-1 on HUVECs elicited by oxLDL and subsequently decreased HUVECs CD40/CD40L expression induced by oxLDL. These observations provided novel insight into a potential novel anti-inflammatory pathway of thiazolidinediones.     

再生障碍性贫血患者T淋巴细胞早期激活及可溶性肿瘤坏死因子受体的研究

目的研究再生障碍性贫血 (再障 )患者外周血CD4 、CD8 T淋巴细胞早期激活标志CD6 9的表达及血清、骨髓中可溶性肿瘤坏死因子受体 1和 2 (sTNF R1和sTNF R2 )的水平及其意义。方法将外周血在 2 0 μg ml植物血凝素 (PHA)条件下进行全血细胞培养 ,于 0h和 4h分别用双色免疫荧光标记流式细胞术对CD4 、CD8 T淋巴细胞CD6 9的表达进行分析。用ELISA法检测血清和骨髓中sTNF R1和sTNF R2的水平。结果PHA刺激前重型再障 (SAA)患者CD4 、CD8 细胞CD6 9的表达率增高 [分别为 (8.96± 7.2 3) %和 (10 .6 7± 7.5 8) % ],慢性再障 (CAA)患者CD8 细胞CD6 9的表达率增高[(7.36± 5 .4 9) % ];PHA刺激后再障患者CD4 、CD8 细胞表达CD6 9明显增强 [SAA为 (71.73±11 91) %和 (6 1.74± 13.4 4 ) % ;CAA为 (5 9.35± 10 .15 ) %和 (4 8.78± 8.2 5 ) % ],CD4 细胞CD6 9的表达率高于CD8 细胞。SAA患者两种sTNF R水平均明显升高 [sTNF R1血清为 (12 5 8.5 8± 385 .6 9)ng L ,骨髓为 (16 5 0 .6 0± 6 6 5 .0 1)ng L ;sTNF R2血清为 (12 5 7.10± 2 95 .4 9)ng L ,骨髓为 (2 0 73.5 7± 5 6 1.17)ng L]。CAA患者骨髓两种sTNF R水平升高 [sTNF R1为 (10 94 .2 1± 2 91.93)ng L ,sTNF R2为 (15 0 2 .4 8±385 .5     

CD40/CD40L在MM患者中的表达及其对预后的意义

目的:探讨CD40/CD40L在多发性骨髓瘤(MM)患者中的表达及其对预后的影响.方法:选取2016年5月-2017年6月于沧州市人民医院接受治疗的MM患者30例,作为MM组,同期选取在本院体检的健康人30例为正常组,采用流式细胞术检测两组人员血清中化疗前后CD40/CD40L的水平,分析其与MM患者淋巴细胞群、病理分...     

共信号分子CD40/CD40L质粒标准品的构建

背景:目前,对CD40/D40L的研究主要集中在可溶性和蛋白方面,对其在转录水平上的研究文献不多,可能与其无商品化质粒标准品有关.目的:构建检测CD40/CD40L mRNA表达水平差异的标准品.设计、时间及地点:单一样本实验,于2009-04在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成.材料:取手术切除的子宫肌瘤组织,经患者知情同意.方法:以手术切除的子宫肌瘤组织细胞的总RNA为模板、Random 6mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人CD40/CD40L基因相应的cDNA片断,构建PMD-18-CD40/CD40L重组质粒,鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线.主要观察指标:①RNA质量检测结果.②扩增的目的片段电泳结果.③CD40/CD40L基因测序结果.④标准品的扩增情况.结果:组织提取的总RNA完整性良好,构建的CD40/CD40L质粒经PCR扩增后分别得到136 bp,200 bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为2.66×10~(13)、2.45×10~(13) copies/mL,倍比稀释至2.0×10~6 copies/mL均能得到良好的标准曲线(R~2=1).结论:实验成功构建了CD40/CD40L基因荧光定量PCR标准质粒.     

Oxidative stress-mediated platelet CD40 ligand upregulation in patients with hypercholesterolemia: effect of atorvastatin

OBJECTIVES: We speculated that in patients with hypercholesterolemia CD40L overexpression could depend on low-density lipoprotein (LDL)-induced enhanced intraplatelet formation of O(2)*(-) and statin could reduce platelet CD40L via interference with platelet O(2)*(-) production. BACKGROUND: CD40L is a protein with inflammatory and thrombotic properties. CD40L is upregulated in platelets from hypercholesterolemic (HC) patients but the underlying mechanism is unclear. METHODS: Collagen-induced platelet CD40L and platelet O(2)*(-) expression were investigated in 40 HC patients and 40 healthy subjects. HC patients were then randomized to either a diet (n = 20) (group A) or atorvastatin 10 mg day (n = 20) (group B); the above variables were measured at baseline and after 3 and 30 days of treatment. O(2)*(-) and CD40L were also measured in vitro in LDL-treated platelets with or without nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase inhibitor or atorvastatin added. RESULTS: Compared with controls, HC patients showed higher values of platelet CD40L (P < 0.001) and O(2)*(-) (P < 0.001). Platelet CD40L was significantly correlated with O(2)*(-) (P < 0.001). The interventional trial showed no changes in group A and a significant and parallel decrease in platelet CD40L (P < 0.001) and O(2)*(-) (P < 0.001) in group B. In vitro studies demonstrated that LDL-induced platelet CD40L and GP IIb/IIIa (PAC1 binding) activation via the NADPH oxidase pathway. CD40L upregulation was counteracted by atorvastatin in a dose-dependent fashion. CONCLUSIONS: This study suggests that in patients with hypercholesterolemia platelet CD40L is upregulated via NADPH oxidase-dependent O(2)*(-) generation. Atorvastatin downregulated CD40L with an oxidative stress-mediated mechanism likely involving platelet NADPH oxidase, an effect that seemed to be independent of its cholesterol-lowering action.