间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的体外扩增,鉴定民克隆

目的：体外扩增、鉴定并克隆间日疟原虫环子孢子蛋白（ＣＳＰ）基因约７７２ｂｐ的基因片段，包容ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央９肽重复区、重复后可变区及Ⅱ区。方法：采用ＰＣＲ法扩增出ＣＳＰ目的基因片段，以低熔点琼脂糖回收纯化，并以限制必丙切酶ＢｓｔＮＩ酶发鉴定后，采用Ｔ载体连接方案，插入中间体载体ＰＵＣ１９的多克隆位点，构建重组体ＰＵＣ１９／ＣＳＰ，并转化大肠杆菌ＪＭ１０７，蓝白菌斑初筛阳性重组子，并以ＰＣＲ法     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的体外扩增、鉴定与克隆

目的：体外扩增、鉴定并克隆间日疟原虫环子孢子蛋白（CSP）基因约772hP的基因片段,包容CSP基因的Ⅰ区、中央9肽重复区、重复后可变区及Ⅱ区。方法：采用PCR法扩增出CSP目的基因片段,以低熔点琼脂糖回收纯化,并以限制性内切酶BstNI酶切鉴定后,采用T载体连接方案,插入中间载体PUC19的多克隆位点,构建重组体PUC19／CSP,并转化大肠杆菌JM107,蓝白菌斑初筛阳性重组子,并以PCR法与限制性酶切分析对阳性克隆进一步鉴定。结果：从间日疟患者血样核酸提取物中扩增出约772hPDNA条带,而正常人血与空白对照无特异性扩增条带,经酶切鉴定证实为CSP基因片段;所构建的PUC／CSP重组体阳性克隆经双酶切与PCR鉴定与预期结果一致。结论：体外成功扩增并克隆间日疟原虫CSP基因片段,为下一步的基因序列分析及CS诊断抗原的制备打下基础。     

恶性疟原虫FCC1/HN株CTP基因真核表达载体的构建

目的构建恶性疟原虫CTP 基因的真核表达载体,以便进一步研究其功能. 方法根据Genbank 已发表恶性疟原虫CTP基因序列(序列号为X084041),自行设计并合成了一对引物,通过聚合酶链反应扩增出CTP基因,经HindⅢ和BamHⅠ消化后定向克隆入测序载体pUC19,构建重组质粒pUC19-CTP.经双酶切、PCR扩增和序列测定,证实插入片段与已知CTP编码序列完全相同.用HindⅢ和BamHⅠ消化pUC19-CTP,将双酶切下的CTP编码基因片段定向亚克隆入真核表达载体pcDNA3. 结果经双酶切和PCR扩增鉴定证实CTP基因正向插入真核表达载体pcDNA3中. 结论真核表达质粒pcDNA3-CTP构建成功.     

恶性疟原虫FCC—1/HN株EBA—175和HRP─Ⅱ基因片段的体外扩增与克隆

目的构建恶性疟原虫FCC—1／HN株红细胞结合抗原（EBA—175）和富组氨酸蛋白Ⅱ（HRP─Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法通过聚合酶链反应（PCR）对恶性疟原虫FCC—1／HN株的EBA─175和HRP─Ⅱ基因进行体外扩增,用HindⅢ／BamHI和BamHI／EcoRI分别消化扩增产物,定向克隆pcDNA3载体,转化至感受态大肠杆菌TG1,经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定,再经PCR和酶切鉴定。结果从恶性疟原虫FCC—1／HN株基因组DNA中扩增出EBA—175和HRP─Ⅱ两基因片段并定向插入PCDNA3载体构建重组质粒。结论所获重组克隆含有编码恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ的基因片断。     

恶性疟原虫Fcc—1／HN株MSP1 19基因的体外扩增及鉴定

本文根据恶性疟原虫ＭＳＰ１ １９已知序列，自行设计一对用于特异扩增ＭＳＰ１Ｃ 端１９肽基因的引物Ｐ１，Ｐ２在Ｐ１引物中引入Ｓａｌ Ｉ酶切位点及ＡＴＧ起始密码子，在Ｐ２引物中引入Ｘｂａ Ｉ酶切位点及终止密码子，经ＰＣＲ扩增获得３６３ｂｐ大小片段，与预期大小相符，采用“压碎与浸泡法”纯化回收ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物经套式ＰＣＲ及酶切鉴定证实与预期大小相符。采用“压碎与浸泡法”纯化回收ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产     

恶性疟原虫海南分离株(FCC1／HN)裂殖子表面蛋白2(MSA2)真核表达载体的构建

目的 构建恶性疟原虫海南分离株（ＦＣＣ１／ＨＮ）裂殖子表面蛋白ＭＳＡ２的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＭＳＡ２,为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定基础。方法 采用ＰＣＲ技术对ＦＣＣ１／ＨＮ基因组ＤＮＡ ＭＳＡ２基因进行扩增,扩增产物经纯化后用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切,然后定向克隆入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３,连接产物转化大肠杆菌ＴＧ１,再用相同的内切酶酶切和ＰＣＲ扩增对重组子进行鉴定。结果 筛选出的     

T载体的构建及在恶性疟原虫RAP2基因克隆中的应用研究

目的　构建PCR产物高效克隆载体T载体 ,并应用于克隆恶性疟原虫RAP2基因。方法　PUC18用SmaI酶切纯化后 ,与dTTP在 70℃孵育 3h ,构建T载体。另设计一对特异引物 ,采用PCR方法从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中特异扩增RAP2基因 ,并将其克隆入T载体 ,重组克隆经蓝白斑初筛后 ,再用双酶切及PCR法进行鉴定。结果　从恶性疟原虫基因组DNA中特异扩增出大小为 12 15bp基因片段 ,与预期长度相符。克隆入T载体后的重组克隆经双酶切及PCR鉴定均正确无误。结论　成功构建T载体 ,并获得阳性重组克隆T -RAP2 ,为进行该RAP2基因的序列测定及研究该基因的结构与功能奠定基础     

恶性疟原虫Fcc-1/HN株MSP1_(19)基因的体外扩增及鉴定

本文根据恶性疟原虫ＭＳＰ１１９已知序列，自行设计一对用于特异扩增ＭＳＰ１Ｃ端１９肽基因的引物Ｐ１、Ｐ２，在Ｐ１引物中引入ＳａｌⅠ酶切位点及ＡＴＧ起始密码子，在Ｐ２引物中引入ＸｂａⅠ酶切位点及终止密码子，经ＰＣＲ扩增获得３６３ｂｐ大小片段，与预期大小相符。采用“压碎与浸泡法”纯化回收ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物经套式ＰＣＲ及酶切鉴定证实与预期大小相符，说明所获确为ＭＳＰ１１９基因。为进一步将该基因与ＰｆＣＭＲ基因进行重组表达复合抗原和免疫接种奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1/HN株新抗原表达序列标记位(ESTs)的获得

目的： 以筛选恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ 株λｇｔ１１ ｃＤＮＡ 表达文库所获得的强阳性克隆作基础, 对上述强阳性克隆的ｃＤＮＡ 插入片段进行ＤＮＡ 序列测定, 阐明相对应的新表达序列标签 （ＥＳＴｓ）, 作为发现新抗原基因的线索。方法：以ｃＤＮＡ 表达文库接头的较长链作ＰＣＲ引物、扩增ｃＤＮＡ 插入片段,将扩增产物克隆入Ｍ１３ ｍ ｐ１８测序载体, 进行部分ＤＮＡ 序列测定、编辑, 将之在ＧｅｎＢａｎｋ 中进行ＤＮＡ 序列同源性搜索比较和分析。结果： 获得１ 个Ｃ０３ 序列为已知恶性疟原虫热休克蛋白７０－２ 基因片段, 发现５ 个新的具有抗原意义的恶性疟原虫表达序列标记位 （ＥＳＴｓ）。结论： 这５ 个新的恶性疟原虫表达序列标记位为发现新的恶性疟原虫抗原基因奠定了基础。     

Sonic hedgehog蛋白N端基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建含Sonic hedgehog(SHH)蛋白N端基因片段的毕赤酵母表达载体.方法 通过BamH 1、Xho 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N基因片段插入pET22b原核表达载体,构建pET22b-SHH-N质粒;经PCR扩增,产物再与pTA2载体连接,构建pTA2-SHH-N重组质粒;经EcoR 1及Not 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N端基因片段插入pPIC9K质粒,构建pPIC9K-SHH-N重组质粒;通过线性化、脱磷酸化,将线性化pPIC9 K-SHH-N DNA转染毕赤酵母菌株GS115,最后经PCR扩增和测序鉴定.结果 转染的毕赤酵母经PCR扩增和测序证实含有SHH-N基因片段,与原始的基因片段序列完全一致.结论 成功地构建含SHH-N蛋白基因片段的毕赤酵母表达载体.     

恶性疟原虫MSP1_(19)与PfCMR基因的体外重组与克隆鉴定

目的：构建编码恶性疟原虫复合多价保护性抗原的基因的重组质粒,为进行基因免疫提供条件。方法：设计一对特异引物Ｐ１与Ｐ２,采用ＰＣＲ法扩增获取ＭＳＰ１中Ｃ端１９肽基因,纯化后用ＳａｌⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切,把含复合基因ＰｆＣＭＲ的重组质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ用ＥｃｏＲⅠ＋ＳａｌⅠ双酶切,回收复合基因ＰｆＣＭＲ,将ＭＳＰ１１９基因与ＰｆＣＭＲ基因串联后与经ＥｃｏＲⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３进行重组,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,经电泳初筛、双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增获得３６３ｂｐ的ＭＳＰ１１９基因,重组克隆经双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定后获得正确重组克隆子ｐｃＤＮＡ３－ＰｆＣＭＲ－ＭＳＰ１１９（命名为ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８）,Ｐｆ８基因长度为６１８ｂｐ。结论：成功构建编码恶性疟原虫多价保护性抗原的基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８。     

我国恶性疟原虫地理株SSUrDNA特定序列的变异分析

采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，分别从我国安徽、海南及云南三省疟区来源的恶性疟原虫株基因组ＤＮＡ中，扩增出该虫小亚单位核糖体核糖核酸（ＳＳＵｒＲＮＡ）基因特定片段，长约５７０ｂｐ，将其插入Ｍ１３ｍｐ１８和Ｍ１３ｍｐ１９载体中，以双脱氧末端终止法测序。读序结果分析表明，恶性疟原虫地理株间及与巴西ＩＭＴＭ２２株７Ｇ８克隆间，ＳＳＵｒＤＮＡ特定片段序列具有高度同源性，差异仅表现为个别碱基置换、插入或缺失所致的点突变，且均发生在可变区中，其发生频率亦无明显差别。     

恶性疟原虫FCC1/HN株RESA基因克隆及序列分析

[目的 ]测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)环状体感染红细胞表面抗原 (RESA)基因 3′端部分基因序列 ,比较FCC1/HN与国外分离株RESA序列的差异。 [方法 ]应用PCR技术扩增RESA基因 3′端部分序列 ,将其克隆入pMD18 T载体。阳性重组克隆经酶切及PCR鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定 ,并用分子生物学软件进行基因结构和同源性分析。 [结果 ]用PCR成功扩增出约 846bp的RESA基因特定片段 ,阳性克隆经酶切及PCR扩增确定。基因序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外FC2 7,PaloAlto ,NF7株RESA基因序列有不同程度的差异。 [结论 ]确定了恶性疟原虫FCC1/HN株RESA基因 3′端序列。同源性分析表明 ,FCC1/HN株RESA序列与其他分离株存在一定差异     

恶性疟原虫11.1基因3个重复片段的克隆及表达

目的　克隆和表达恶性疟原虫 (Pf) 11 1基因产物中的 3个重复片段 3R、6R和 9R。方法　利用设计的引物从培养的恶性疟原虫 3D7株的基因组DNA中扩增出 3个重复片段。PCR产物被克隆入pT7载体中以进双向测序。测序结果用GENETYX MAC软件进行分析。扩增的片段亚克隆入pET32a(+ )或pET32b(+ ) ,并由IPTG诱导在大肠杆菌BL2 1中表达重组蛋白。结果　用PCR方法成功地扩增出 3R、6R和 9R片段 ,大小分别为 5 5 2、630和44 4bp。测序结果显示 ,3D7株的Pf11 1基因比PaloAlto株的Pf11 1基因多 4个 3AA和 1个 6AA重复单元 ,两原虫株的 3R和 6R片段的同源性分别 92 8%和 95 1%。扩增出的 9R片段含有 13个 9AA重复单元。在BL2 1菌株中表达出三个重组蛋白 ,分子量分别为 45、60和 42kDa。结论　用PCR方法分别获得 3R、6R和 9R重复片段并在大肠杆菌中成功表达。 3D7株的Pf11 1基因与PaloAlto株具有高度同源性     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1-17区基因的原核表达、纯化及表达产物鉴定

目的　为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１ 的１７区基因（ＭＳＰ１－ １７）,本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１ 的１７ 区基因,并纯化及鉴定了表达蛋白。方法　将ＭＳＰ１－ １７ 基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １,形成ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７。ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７ 转化的ＢＬ２１菌,纯化并用ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体鉴定表达产物。结果　成功地构建了ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７,转化菌经诱导表达出与ＧＳＴ融合的蛋白（约４０ＫＤ）,纯化后纯度达７２％ ,ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体可识别表达蛋白。结论　成功表达并纯化了ＭＳＰ１－ １７ 蛋白,为深入研究和应用ＭＳＰ１－ １７ 打下基础     

恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)谷氨酸脱氢酶(GDH)基因并测定其序列,比较FCC1/HN株与国外分离株GDH基因序列的差异.方法根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株GDH基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因全长1 329 bp,编码442个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异.结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性.     

恶性疟原虫FCC1/HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。 方法 用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因,大小为1482 bp,编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同,与K1株的同源性高达99.8％,但与人的4型HK的同源性只有23.2％~26.6％。 结论 获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守,但与人的同源性很低,可能是一个潜在的药物靶标。     

恶性疟原虫己糖转运体编码基因的体外扩增、克隆及表达

[目的 ]体外扩增、克隆和表达恶性疟原虫海南分离株的己糖转运体 (PfHT1)基因 ,为研究其保护性免疫创造条件。 [方法 ]恶性疟原虫FCC1/HN株的体外培养 ;碱裂解法提取基因组DNA ;PfHT1基因的PCR扩增、克隆 ;脂质体介导法转染HEPG2细胞株及真核表达。 [结果 ]从恶性疟原虫海南分离株基因组DNA中扩增出特异性的编码PfHT1的基因序列 ,片段大小为 15 16bp ;成功构建 pN3 HT1真核表达重组质粒并在肝癌细胞HEPG2中稳定表达。 [结论 ]体外成功扩增、克隆恶性疟原虫PfHT1编码序列 ;重组质粒转染成功并获稳定表达融合蛋白的 pN3 HT1/HEPG2细胞株