恶性疟原虫海南株CSP3′末端基因的克隆及序列分析

目的　构建恶性疟原虫海南株 (FCC1 HN)CSP3′末端基因的原核表达载体 ,并对CSP3′末端基因进行序列测定。方法　根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物 ,采用PCR技术扩增出CSP3′末端基因 ,将其克隆入原核表达载体pGEX 4T 1,转化大肠杆菌JM10 9;阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定 ,用双脱氧链末端终止法进行序列测定。　结果　从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3′末端基因 ,其片段大小为 2 2 5bp ,构建的阳性重组质粒pGEX 4T 1 CSP3′末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致 ,测序结果进一步确认了插入片段的正确性。　结论　成功地构建了CSP3′末端的原核重组质粒 ,为进一步研究其功能奠定了基础。     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

恶性疟原虫云南株环子孢子蛋白部分基因的克隆和序列分析

目的：测定我国恶性疟原虫环子孢子蛋白部分基因序列，了解我国虫株与其它虫株CS蛋白基因序列的差异。方法：采用PCR方法特异性扩增CS蛋白基因片段，并将该基因片段克隆于M13噬菌体，取3个阳性克隆制备M13－CSP单链DNA，用双脱氧链末端终止法测定该基因片段核苷酸序列。应用PCGENE软件对六个虫株CS蛋白基因序列进行了一系列比较分析。结果：我国恶性疟原虫云南株（PFD－3／YN）与T4、Welcome、NF54、3D7及7G8等虫株CS蛋白基因序列有不同程度的差异，其中一个有意义核苷酸突变发生在P．fTh／Tc抗原表位区。结论：云南株与其它虫株CS蛋白基因存在差异。     

恶性疟原虫海南株端粒酶催化亚基基因的克隆及序列分析

目的　克隆恶性疟原虫端粒酶基因 ,为今后筛选抗疟药物提供理论依据。方法　根据四膜虫的端粒酶基因序列 ,设计并合成一对引物 ,从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出端粒酶基因 ,进行测序及利用生物信息学技术对端粒酶基因进行了分析。结果　得到了 2 3kp的恶性疟原虫海南株端粒酶基因。结论　恶性疟原虫端粒酶基因的克隆 ,为今后以端粒酶为靶标筛选抗疟药奠定了基础     

恶性疟原虫HRP—Ⅲ基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株HRP－Ⅲ基因序列,比较FCC1／HN株与国外分离株HRP－Ⅲ基因序列的差异。方法 根据HRP－Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增HRP－Ⅲ基因。通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP－Ⅲ。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用分子生物学软件进行不同分离株HRP－Ⅲ基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP－Ⅲ重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因全长802bp包含一个内含子,编码224个氨基酸,序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的Itg2,FC27及IMTM22株HRP－Ⅲ基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因。序列测定及同源性分离表明,FCC1／HN株与其它分离株的HRP－Ⅲ基因序列有高度的同源性。     

恶性疟原虫FCC1／HN株特异基因片段的克隆及部分序列分析

本研究通过分离、培养恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ分离株，提取、纯化其基因组ＤＮＡ，用ＢａｍＨ１部分酶切，并克隆ｐＵＣ１８载体，转化受体菌株大肠杆菌ＪＭ１０３，用基因组ＤＮＡ探针筛选转化子，对杂交信号最强的克隆片段ｐＨＦ１作部分序列分析，在国内首次明确恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ特异ＤＮＡ部分序列。ｐＨＦ１克隆片段约１．２ｋｂ，两端分别测定了３２８和２７１个碱基。Ｇ＋Ｃ含量为２６．８％，并有较多的酶切位点，便于作亚克隆，该序列还可用作ＤＮＡ探针或ＰＣＲ扩增模板有较大实用价值。     

恶性疟原虫FCC1／HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶（GDH)基因并测定其序列,比较FCC1／HN株与国外分离株GDH基因序列的差异。方法 根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株GDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因全长1329bp,编码442个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1／HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性。     

恶性疟原虫HRP-Ⅲ基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株HRP-I基因序列,比较FCC1/HN株与国外分离株HRP-I基因序列的差异.方法根据HRP-Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增HRP-I基因.通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP-I.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用分子生物学软件进行不同分离株HRP-Ⅲ基因序列的同源性比较.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株HRP-I基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP-Ⅲ重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因全长802bp,包含一个内含子,编码224个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的Itg2、FC27及IMTM22株HRP-Ⅲ基因序列有较高的同源性.结论成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因.序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的HRP-Ⅲ基因序列有高度的同源性.     

恶性疟原虫海南株cDNA克隆FMPf01分析

目的 对我室构建恶性疟原虫海南株（ＦＣＣ／ＨＮ）红内期ｃＤＮＡ表达文库阳性克隆（ＦＭＰｆ０１）进行分析研究,确定其性质,方法 通过计算机软件和免疫印迹法分析ＦＭＰｆ０１的碱基构成,同源性及编码多肽的免疫反应性。结果 核苷酸序列分析显示其Ａ＋Ｔ构成比高于Ｇ＋Ｃ为３．１４：１,与基因资料库中疟原虫基因的同源性较低,其最高值为６３．８％,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证实其编码多肽可被抗疟原虫免疫血清识别,     

恶性疟原虫环子孢子蛋白基因在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）环子孢子蛋白基因片段,经基因序列测定后克隆于ｐＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌ＴＧ１、ＪＭ１０３及ＪＭ１０９。在不同菌体浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＣＳＰ融合蛋白的表达,结果显示仅ｐＷＲ－ＣＳＰ／ＴＧ１工程菌在菌体浓度ＯＤ５９０值达０．７～０．８时,加入终浓度１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导,可表达一８８ｋＤａ的融合蛋白。ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明ＣＳ蛋白表达产物能被抗ＣＳ蛋白重复区单克隆抗体所识别     

恶性疟原虫海南株子孢子期SSU rRNA编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株子孢子期小亚基核糖体核糖核酸(SSU rRNA)编码基因片段,分析其序列特征.方法 根据恶性疟原虫基因库相关核酸序列设计1对引物,采用PCR方法从海南恶性疟患者血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSU rRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接,构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆经双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAST软件分析其特征.结果 恶性疟原虫子孢子期SSU rRNA基因扩增片段大小约为347bp;阳性克隆重组质粒双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;核酸序列测定显示插入的SSU rRNA基因扩增片段含有347个核苷酸,与GenBank中的恶性疟原虫3D7株相同序列进行比对,其同源性为100%,而与7G8株的同源性则为98.0%,其中第153位碱基发生了缺失,第184位碱基由C取代了T,而第188位T碱基与第189位A碱基为插入碱基,第243位碱基则由T取代了C.结论 成功克隆恶性疟原虫海南株孢子期SSU rRNA编码基因序列,该序列相对保守,不同地理株间存在单核苷酸多态性.     

恶性疟原虫FCC1／HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因，构建其原核和真核表达重组质粒．测定其序列，比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。方法用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因；将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pCDNA3，分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌；经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆，用双脱氧链末端终止法测定其序列，用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因，大小为1482bp，编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同．与K1株的同源性高达99．8％，但与人的4型HK的同源性只有23．2％～26．6％。结论获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因，成功构建了其原核和真核表达质粒，并测定了其序列；恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守，但与人的同源性很低．可能是一个潜在的药物靶标。     

恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达产物免疫鼠体内抗原定位研究

目的 用恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达产物免疫小鼠,观察其在宿主体内各组织的抗原分布情况。方法 提取目的基因PfCSP在HeLa细胞中的表达产物,免疫注射BALB／c小鼠。取免疫后4周及7周小鼠心脏、肝脏、脑、脾及肌肉,通过免疫酶组织化学法及间接免疫荧光法检测组织内的抗原。结果 免疫7周后的BALB／c小鼠肝脏组织枯否氏细胞内及肝细胞膜上可见棕黄色特异性抗原－抗体反应,而免疫鼠心、脑、肌肉未出现明显的阳性反应。结论 恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达蛋白能被肝实质细胞特异性识别,其免疫后的抗原分布主要在肝脏。     

恶性疟原虫海南株CTP基因的克隆测序及序列分析

目的 测定恶性疟原虫（P.f）海南株CTP基因序列,了解该虫株CTP基因序列与其它种类的CTP基因序列的差异,用于药物靶位的筛选。方法 用PCR的方法特异性的扩增CTP基因,并将此基因克隆于测序载体pUC19,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序。结果 我国海南株的CTP基因序列与其它的CTP基因有不同程度的差异。结论 P.f CTP作为潜在的抗疟药物靶值得进一步深入研究。     

恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)谷氨酸脱氢酶(GDH)基因并测定其序列,比较FCC1/HN株与国外分离株GDH基因序列的差异.方法根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株GDH基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因全长1 329 bp,编码442个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异.结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性.     

恶性疟原虫FCC1／HN株丙酮酸激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫海南株FCCl／HN的丙酮酸激酶(PK)的编码基因，构建其原核和真核表达重组质粒，测定其序列，并了解它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫3D7和人PK基因之间的差异。方法 根据3D7的PK基因设计合成一对引物，用PCR从FCCl／HN株基因组中扩增PK基因；将它分别定向克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3，分别转化大肠杆菌JM109感受态细菌；经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆，用双脱氧链末端终止法测定其序列，用生物信息学软件分析PK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCCl／HN株PK基因，大小为2235bp，编码744个氨基酸。其氨基酸序列与3D7的同源性高达99．9％，与约氏疟原虫的同源性为70．2％，但与弓形虫和人的PK的同源性分别只有20．9％和21．6％～25．4％。结论 从FCCl／HN株基因组中获取了PK基因，成功构建了其原核和真核表达质粒，并测定了其序列；它与3D7的PK高度同源，但与人的PK基因同源性很低，可能是一个药物靶标。     

恶性疟原虫TRAP/CSP融合抗原的构建及表达

目的　构建恶性疟原虫红前期融合蛋白 4(PfCP 4)。　方法　通过甘氨酸 脯氨酸 甘氨酸 (GPG)接点将恶性疟原虫 3D7株血凝素相关匿名蛋白 (TRAP)膜外区序列 (氨基酸 2 6～ 3 3 0 )和环子孢子蛋白 (CSP) 19个 4肽重复区及其羧基末端序列 (氨基酸 199～ 3 83 )连接 ,采用不对称PCR法人工合成 15 77bpPfCP 4基因。将PfCP 4基因克隆在pQE表达质粒上 ,转化大肠杆菌SG13 0 0 9后进行诱导表达 ,用抗CSP的免疫血清进行免疫印迹检测。　结果　免疫印迹检测显示在 5 7kDa处出现特异的表达条带 ,其大小与推算的PfCP 4分子量一致 ,表明PfCP 4合成基因能在大肠杆菌中表达分子量为 5 7kDa的PfCP 4重组蛋白。　结论　成功构建了PfCP 4。     

恶性疟原虫FCC1/HN株丙酮酸激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的　扩增恶性疟原虫海南株FCC1/HN的丙酮酸激酶 (PK)的编码基因 ,构建其原核和真核表达重组质粒 ,测定其序列 ,并了解它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫 3D7和人PK基因之间的差异。　方法　根据 3D7的PK基因设计合成一对引物 ,用PCR从FCC1/HN株基因组中扩增PK基因 ;将它分别定向克隆到原核表达质粒PGEX 4T 1和真核表达质粒 pcDNA3 ,分别转化大肠杆菌JM 10 9感受态细菌 ;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆 ,用双脱氧链末端终止法测定其序列 ,用生物信息学软件分析PK序列及进行同源性比较。　结果　PCR扩增得到特异的FCC1/HN株PK基因 ,大小为 2 2 3 5bp ,编码 744个氨基酸。其氨基酸序列与 3D7的同源性高达 99.9% ,与约氏疟原虫的同源性为 70 .2 % ,但与弓形虫和人的PK的同源性分别只有 2 0 .9%和 2 1.6%～ 2 5 .4%。　结论　从FCC1/HN株基因组中获取了PK基因 ,成功构建了其原核和真核表达质粒 ,并测定了其序列 ;它与 3D7的PK高度同源 ,但与人的PK基因同源性很低 ,可能是一个药物靶标。     

恶性疟原虫FCC1/HN株RESA基因克隆及序列分析

[目的 ]测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)环状体感染红细胞表面抗原 (RESA)基因 3′端部分基因序列 ,比较FCC1/HN与国外分离株RESA序列的差异。 [方法 ]应用PCR技术扩增RESA基因 3′端部分序列 ,将其克隆入pMD18 T载体。阳性重组克隆经酶切及PCR鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定 ,并用分子生物学软件进行基因结构和同源性分析。 [结果 ]用PCR成功扩增出约 846bp的RESA基因特定片段 ,阳性克隆经酶切及PCR扩增确定。基因序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外FC2 7,PaloAlto ,NF7株RESA基因序列有不同程度的差异。 [结论 ]确定了恶性疟原虫FCC1/HN株RESA基因 3′端序列。同源性分析表明 ,FCC1/HN株RESA序列与其他分离株存在一定差异