重组质粒pEgr-P16在EC9706细胞中的辐射诱导凋亡作用

背景与目的:研究pEgr-P16重组质粒在食管癌细胞系EC9706中的辐射诱导凋亡作用.材料与方法:pEgr-P16重组质粒通过脂质体介导转染人食管癌EC9706细胞,定量RT-PCR检测2 Gyγ射线照射后被转染细胞中P16的表达和细胞凋亡率的变化.结果:对照组无P16蛋白表达,转染质粒组细胞接受2Gyγ射线照射后2～24 h P16表达量与时间呈曲线关系,在22 h时P16的mRNA水平最高;P16基因联合放射可诱导食管癌细胞凋亡,凋亡率高于单纯照射组和单纯基因诱导组.结论:γ射线可诱导pEgr-P16重组质粒在人EC9706细胞中表达并显著提高EC9706细胞的凋亡率.本研究结果为食管癌基因-放射治疗的进一步研究奠定了实验基础.     

pEgr-P16重组质粒的构建及其在EC9706细胞中的辐射诱导表达

目的：构建pEgr-P16重组质粒并检测其在人食管癌细胞系EC9706中的辐射诱导表达。方法：人P16cDNA基因连接到Egr-1启动子的下游构建成pEgr-P16重组质粒，利用脂质体介导转染人EC9706细胞，用Western blot方法检测不同剂量γ射线照射后被转染细胞中P16的表达。结果：酶切鉴定证实pEgr-P16重组质粒构建正确。被pEgr-P16重组质粒转染的人食管癌EC9706细胞经不同剂量γ射线照射后，P16基因表达均高于未照射组。结论：γ射线可诱导pEgr-P16重组质粒在人EC9706细胞中表达增强。     

pEgr-MDA7重组质粒辐射诱导特性的检测

背景与目的：克隆人MDA7 cDNA基因,构建pEgr-MDA7重组质粒并检测其在人食管癌细胞系EC9706中经辐射诱导后mRNA水平。材料与方法：从人外周血mRNA中克隆人MDA7 cDNA基因,连接到Egr-1启动子的下游构建成pEgr- MDA7重组质粒,利用脂质体介导转染人EC9706细胞,用定量PCR方法检测不同剂量X射线照射后被转染细胞中MDA7的mRNA水平。结果：测序结果证实MDA7 cDNA基因序列正确,酶切鉴定证实pEgr-MDA7重组质粒构建正确。被pEgr- MDA7重组质粒转染的人食管癌EC9706细胞经不同剂量X射线照射后,MDA7基因mRNA水平均高于未照射组。结论：X射线可诱导pEgr- MDA7重组质粒在人EC9706细胞中表达增强。     

热休克蛋白70对X射线照射下wtp53蛋白的影响

目的 探讨反义热休克蛋白70（hsc70）在X射线照射下对野生型p53(wtp53）的影响。方法 利用脂质体方法将本室构建的反义hsc70真核表达重组质粒pXAhsc70转染wtp53的MCF-7乳腺癌细胞,PCR证实外源DNA存在。Western bolt检测hsc70蛋白下降程度。X射线照射转染细胞后,检测wtp53蛋白的表达情况及半衰期变化。结果 转染重组质粒的细胞中hsc70蛋白下降53%;不同剂量X射线照射下,反义hsc70的存在能够提高wtp53的表达;4Gy相同剂量照射后,转染反义hsc70重组质粒的细胞中wtp53的半衰期延长。结论 反义hsc70能够上调wtp53的表达、稳定X射线照射下的wtp53蛋白并延长其半衰期;推测hsc70可能参与了wtp53的稳定和降解过程。     

核酶对食管癌EC9706细胞端粒酶活性及凋亡的影响

目的：观察针对人端粒酶RNA模板区的核酶对食管癌细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。方法：利用脂质体Lipofectamine介导，将已构建好的带有端粒酶核酶基因的重组质粒pBBS212Rz及空载质粒pBBS212转染食管癌EC9706细胞，采用TRAP—ELISA法检测端粒酶活性，用倒置相差显微镜及流式细胞仪观察细胞生长和凋亡情况。结果：重组质粒pBBS212Rz转染的食管癌EC9706细胞的端粒酶活性明显下降，细胞生长速度明显变慢，凋亡加速。结论：端粒酶核酶对食管癌细胞端粒酶活性和细胞生长有抑制作用，可望成为食管癌基因治疗的新方法。     

利用siRNA抑制食管癌VEGF-C的表达

目的 利用siRNA抑制人食管癌EC9706细胞中VEGF-C基因的表达。方法 针对VEGF-C mRNA设计了3条siRNA,并构建相应的表达质粒,将质粒转染食管癌EC9706细胞,筛选稳定表达株,利用RT-PCR和原位杂交技术分析siRNA对细胞中VEGF-C mRNA的降解作用;免疫组织化学法分析细胞中VEGF-C蛋白的表达;利用裸鼠进行体内成瘤性实验,免疫组织化学法检测瘤组织中VEGF-C的表达。结果 siRNA能明显降低食管癌EC9706细胞中VEGF-C mRNA和蛋白的表达,稳定转染的3个siRNA组细胞仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒和无阳性条带,与无关序列组和正常EC9706细胞组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）;裸鼠体内的成瘤实验,3个siRNA转染组瘤组织中VEGF-C蛋白的表达也明显减少,与正常EC9706组无关序列组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 靶向VEGF-C mRNA的siRNA能在体内外有效抑制VEGF-C的表达,可用于食管癌的基因治疗。     

干扰HMGB1基因表达对食管鳞癌细胞侵袭迁移及放射敏感性的影响

目的：探讨干扰HMGB1基因对X线照射后食管鳞癌细胞增殖活性、存活能力及侵袭、迁移能力的影响及其机制。方法：构建含有HMGB1 shRNA的慢病毒载体并转染人食管鳞癌EC9706细胞（HMGB1 shRNA组）,并以转染阴性序列的细胞为对照组,两组均设置X射线照射和未照射2个亚组。采用Western blot法评估HMGB1基因的干扰效果;MTS法和集落形成实验分别检测食管鳞癌EC9706细胞的增殖活性和存活能力;划痕实验和Transwell小室实验分别检测干扰HMGB1基因对EC9706细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术和Western blot分别检测照射后各组的细胞凋亡率及上皮间质转化（EMT）相关蛋白的表达。结果：与阴性对照组比较,Western blot结果显示干扰HMGB1基因明显降低了HMGB1蛋白的表达（P < 0.01）,MTS法检测结果显示X射线照射后干扰HMGB1显著抑制了食管鳞癌细胞的增殖水平（P < 0.05）,集落形成实验结果显示HMGB1 shRNA组细胞的放射敏感性明显增加（P < 0.01）。划痕实验结果显示,X射线照射后HMGB1 shRNA组细胞24 h的划痕愈合率为（20.78±4.38）%,低于阴性对照组的（39.02±3.25）%（P < 0.01）。Transwell实验结果显示X射线照射后HMGB1 shRNA组细胞在3.5 h的迁移细胞数为（67.00±16.56）个,低于阴性对照组的（194.00±19.74）个（P < 0.01）。流式细胞术结果显示,X射线照射后阴性对照组细胞凋亡率为（13.64±1.24）%,HMGB1shRNA组细胞凋亡率为（20.67±1.38）%;与阴性对照组比较,X射线照射后HMGB1 shRNA组细胞E-cadherin表达显著增加,而Ncadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达明显降低（均为P < 0.01）。结论：干扰食管鳞癌细胞中HMGB1基因的表达后经X射线照射,降低了肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移水平和存活能力,诱导了细胞凋亡,增加了放射敏感性,并调控EMT相关蛋白的表达。     

高剂量X射线对人鼻咽鳞癌CNE1细胞株HIF-1α表达影响的研究

目的:探讨高剂量X射线照射前后低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在人鼻咽鳞癌CNE1细胞株中的表达情况。方法:体外培养人鼻咽鳞癌CNE1细胞株,待细胞进入对数生长期后行6MV X射线照射,照射方法为2Gy/次,隔日1次,共25次,累积剂量50Gy,收集照射前后细胞采用免疫荧光染色、RT-PCR和蛋白质印迹法检测高剂量X线照射前后CNE1细胞株中HIF-1α基因及其蛋白的表达。结果:照射前后HIF-1α基因的表达的半定量值分别为0.23±0.02和0.37±0.04,t=-5.422,P=0.006;其蛋白的表达的半定量值分别为0.05±0.01和0.08±0.01,t=-3.674,P=0.021;X线照射50Gy后HIF-1α在CNE1细胞中的表达比照前明显增高,P<0.05;共聚焦显微镜观察到X线照射50Gy后的CNE1细胞中绿色荧光强度高于照射前。结论:X射线照射可以引起HIF-1α在CNE1细胞中表达升高。     

pcEgr-IFNγ重组质粒的构建与体外X射线诱导表达特性

目的 :扩增小鼠IFNγcDNA全长并构建pcEgr_IFNγ重组质粒 ,研究该重组质粒在不同剂量X射线作用下在B16细胞中的表达及时程。 方法 :利用PCR方法扩增小鼠IFNγcDNA全长 ,插入 pcDNA3.1质粒的多克隆位点 ,用Egr_1的启动子替代pcDNA3.1质粒的CMV启动子 ,构建成 pcEgr_IFNγ重组质粒 ;通过脂质体转染法将重组质粒转染入B16细胞 ,利用ELISA试剂盒检测在不同剂量X射线作用下 ,重组质粒的表达量及表达时程。 结果 :IFNγcDNA的扩增产物经测序 ,结果基本与已知序列相符 ,重组质粒经酶切鉴定 ,得出相应的特异带。不同剂量X射线照射后 ,pcEgr_IFNγ在B16细胞中表达量为77.73～94.60pg/ml ,明显高于对照组(P<0.05～P<0.01) ;2GyX射线照射后6h ,pcEgr_IFNγ表达量最高 ,为90.00pg/ml,明显高于对照组(P<0.001)。 结论 :用本实验克隆的IFNγcDNA所构建的 pcEgr_IFNγ重组质粒 ,经X射线的诱导 ,在被转染的B16细胞中表达量明显增高。对重组质粒X射线诱导表达的剂量时程的检测 ,为将来pcEgr_IFNγ基因治疗合并放疗的体内研究奠定了基础。     

Notch1信号途径在食管鳞癌细胞中的激活及对细胞周期的影响

目的 观察Notch1信号途径在食管鳞癌EC9706细胞中的激活状态及 其对细胞周期的影响。方法 通过免疫细胞化学检测Notch1基因在 食管鳞癌细胞株EC9706细胞中的表达,并通过免疫荧光方法研究 Notch1基因在EC9706细胞中的激活状态。并且利用CCK-8试剂检测食管癌细胞的增殖状态。此外,采用RT-PCR和Western blot技术检 测与细胞周期相关基因的表达,最后通过流式细胞仪进一步探索激 活的Notch1信号途径对细胞周期的影响。结果 转染pcNICD后的食 管鳞癌细胞株中发现Notch1基因的表达。免疫荧光结果显示,转染 pcNICD后的食管鳞癌细胞株中Notch1信号途径处于激活状态。与未处理和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,稳定表达NICD的EC9706细 胞的生长速率明显受到抑制（P<0.01）。此外,与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,稳定表达NICD的EC9706细胞的CDK2, cyclin D1和E基因的mRNA和蛋白的表达明显下调（P<0.05）。转染pcNICD的EC9706细胞在G0/G1期的比率高达74.5%,而未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞在G0/G1期的比率分别为59.1%和59.0%。细胞周期分析显示瞬时表达NICD的EC9706细胞在G0/G1期比率的增加,提示激活的Notch1信号途径能够诱导细胞静止在G₀/G₁ 期。结论 Notch1信号途径的激活引起食管鳞癌细胞的细胞周期 静止,提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞癌的新靶点。     

放射抗拒食管癌细胞系的建立及抗拒机制研究

[目的]建立食管癌放射抗拒细胞系模型并观察食管癌细胞经射线反复照射后放射敏感性的变化。[方法]60Coγ射线对食管癌EC9706细胞系进行照射,每次2Gy,共照射30次,采用克隆形成实验等测定所得的EC9706R60细胞亚系及其亲代细胞EC9706的放射敏感性,检测细胞周期特征、细胞凋亡率及SP细胞(side population cells)比例。[结果]与亲代EC9706细胞相比,EC9706R60细胞显示出明显放射抗性,其D0、Dq及N值增大,细胞存活曲线肩区增宽,EC9706R60细胞的放射抗性(D0)是EC9706的1.375倍(P<0.05)。EC9706R60细胞S期比例较其EC9706细胞明显增高(32.1%vs.3.8%),G0/G1期比例则明显下降(67.9%vs.96.2%)。食管癌细胞EC9706在经30Gy照射后12h细胞凋亡达到峰值11.17%,经60Gy照射后降低到最低点0.99%。EC9706R60细胞SP细胞的比例较EC9706明显增高。[结论]EC9706R60细胞显示出与亲代细胞不同的细胞周期特征,放射抗拒性与SP细胞的比例存在一定关联。高的放射诱导凋亡率可能意味着放射越...     

RNA干扰沉默乏氧诱导因子-1a对紫杉醇诱导食管鳞癌EC9706细胞凋亡的影响

目的:探讨食管癌乏氧耐药机制,观察乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)对紫杉醇诱导的人食管鳞癌EC9706细胞凋亡的影响。方法:用CoCl2化学乏氧法建立乏氧模型;应用Western blot测定RNA干扰前后,乏氧条件下HIF-1α蛋白表达的变化;应用原位末端标记TUNEL法及AnnexinⅤ/PI双标记法检测RNA干扰前后紫杉醇对乏氧培养细胞EC9706细胞凋亡的影响。结果:EC9706细胞经75μmol/L的CoCl2作用4 h后,即可诱导HIF-1α蛋白表达。RNA干扰技术能明显抑制乏氧诱导的HIF-1α蛋白表达。相同的乏氧条件下,转染HIF-1α-siRNA组细胞的凋亡率与未转染组或转染control-siRNA组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:乏氧条件下HIF-1α蛋白对紫杉醇诱导的EC9706细胞凋亡具有抑制作用。以HIF-1α为新的靶点可望提高食管癌的治疗水平。     

Notch1信号途径在食管鳞癌细胞株EC9706的作用研究

目的：研究Notch1基因在食管癌细胞株中的表达及其对食管鳞癌细胞EC9706凋亡的影响.方法：通过免疫细胞化学检测Notch1基因在EC9706细胞中的表达.通过RT-PCR扩增Notch1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Notch1,转染EC9706细胞,利用Western blotting检测转染pcDNA3.1-Notch1载体12h,24h,48h,72h的食管癌细胞株与转染空载体食管癌细胞株中Notch1的表达,并观察每一时期食管癌细胞株的凋亡情况.结果：在食管癌细胞株中Notch1基因低表达,此外,转染Notch1后的细胞株Notch1表达量与转染空载体相比有明显差异（F=80.442,P＜0.05）.经组间两两比较,实验组食管癌细胞株的Notch1的表达量在12h时比对照组食管癌细胞株的表达量显著增高（P＜0.01）,前者约为后者的4.6倍.但48h至72h时Notch1表达量实验纽与对照组食管癌细胞株无显著性差异（P＞0.05）.进一步通过倒置显微镜发现48h至72h细胞出现大量凋亡的现象.上述结果说明12h Notch1表达量的增加,使食管癌细胞EC9706中的Notch1信号途径得以激活,该途径激活后导致48h到72h时的细胞大量凋亡.结论：Notch1在食管癌细胞中的激活引起细胞大量凋亡,提示Notch1基因有可能成为治疗食管癌的新靶点.     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

siRNA抑制食管癌EC9706细胞VEGF-C体内外表达的定量分析

目的观察小分子干扰RNA(siRNA)对人食管癌EC9706细胞中血管内皮生长因子C(VEGF-C)体内外表达的抑制作用。方法根据VEGF-C cDNA已知序列,设计并体外转录合成3条siRNA,将它们分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染EC9706细胞,并以无关序列转染和正常EC9706细胞为对照。以免疫组化S-P法和定量分析技术,分别检测上述各组细胞中和荷瘤动物瘤组织中VEGF-C蛋白的表达强度(positive unit,PU)。结果未转染细胞对照组和无关序列转染组,均有大量VEGF-C蛋白阳性颗粒,两者之间PU差异无显著性;siRNA转染的3组中,仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒,与未转染细胞对照组和无关序列组相比,PU值差异均有统计学意义(P<0.01)。结论VEGF-C siRNA能有效抑制食管癌EC9706细胞中VEGF-C体内外的表达,可望成为一种抗食管癌淋巴管生成的新方法。     

siRNA靶向沉默MALAT-1基因对人食管癌EC9706细胞体外侵袭迁移的影响

目的:研究长链非编码RNA MALAT-1对食管癌EC9706细胞系迁移、侵袭能力的影响。方法:化学合成针对MALAT-1的siRNA,脂质体法转染EC9706细胞,转染48h后RT-PCR和Western blot检测各细胞MALAT-1在mRNA和蛋白质水平的表达。Transwell实验检测迁移、侵袭能力改变。结果:小干扰RNA下调MALAT-1表达后,RT-PCR和Western blot证实食管癌EC9706细胞中MALAT-1的表达在mRNA水平和蛋白质水平均明显下调,Transwell实验证实食管癌EC9706细胞迁移、侵袭能力下降。结论:抑制MALAT-1表达能够使食管鳞癌细胞的侵袭转移能力明显降低。     

腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响

目的：构建表达人环氧化酶－2（cyclooxygenase-2,cox-2)反义RNA的腺病毒载体,研究其对人食管癌细胞生长的影响。方法：把人cox-2基因的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下,获得pAd-AShcox-2,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码cox-2反义RNA的重组腺病毒－Ad-AShcox-2,PCR鉴定为阳性克隆并大量扩增,转染食管癌细胞EC9706,用生长细胞计数,3H－TdR掺入及免疫细胞化学的方法,研究对食管癌细胞生长,cox-2表达,DNA合成的影响,结果：成功构建编码cox-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,病毒感染EC9706后,cox-2表达降低,3H－TdR掺入量减少,与对照组比较P＜0．001,同时发现食管癌细胞的生长受抑制,结论：减少cox-2的表达可能是治疗食管癌的一种新途径。     

干扰GTPBP4基因对食管癌EC9706细胞放射敏感性影响

目的:探讨沉默GTPBP4基因对人食管癌EC9706细胞系放射敏感性影响。方法:通过GEO数据库分析食管癌患者组织中GTPBP4的表达情况。利用重组质粒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术转染食管癌EC9706细胞系,使细胞中GTPBP4基因沉默,观察GTPBP4基因沉默对EC9706细胞增殖、凋亡及放射敏感性影响。通...     

pEgr-Endostatin-EGFP抑制黑色素瘤生长及血管生成

目的 检测pEgr-Endostatin-EGFP质粒的表达特性和pEgr-Endostatin-EGFP基因-放射治疗小鼠黑色素瘤的作用。方法pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒用脂质体方法转染B16细胞,采用Western blot方法检测Endostatin表达。建立小鼠荷瘤模型,注射质粒并给予5Gy X射线照射,共3次,18天观察肿瘤生长情况,并采用免疫组织化学方法检测肿瘤血管生成。结果 转染了pEgr-Endostatin-EGFP质粒的B16细胞和转染并接受照射的B16细胞组可以检测到Endostatin蛋白表达。C57BL/6J小鼠给予pEgr-Endostatin-EGFP质粒注射并接受肿瘤X射线照射,可以显著抑制肿瘤生长(P<0.01),而且肿瘤局部血管生成明显降低(P<0.01)。结论 本研究数据为肿瘤基因-放射治疗提供了新的治疗方案。     

HMGB1 siRNA干扰对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响

目的： 采用siRNA技术干扰人食管鳞癌细胞中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因表达，观察经X射线照射后细胞增殖活性、存活能力及细胞凋亡率的变化。方法： 针对HMGB1 mRNA序列，设计合成有效的干扰序列HMGB1 siRNA，并转染食管鳞癌KYSE30细胞，同时设置转染阴性对照序列的阴性对照组以及未进行转染的空白对照组。采用实时荧光定量PCR（qPCR）和Western blot法检测各组细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达；分别用MTS比色、克隆形成实验、流式细胞术和Western blot法检测HMGB1 siRNA干扰对食管鳞癌细胞KYSE30细胞的增殖活力、存活能力、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响。结果： HMGB1 siRNA干扰后，KYSE30细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达水平明显降低（P均 < 0.01）；MTS数据显示HMGB1 siRNA干扰后经X射线照射显著抑制了食管鳞癌细胞的增殖水平（与空白对照组和阴性对照组比较，P < 0.05）；克隆形成实验结果显示空白对照组、阴性对照组、HMGB1 siRNA组的D₀值分别为2.57、2.54、1.55 Gy；D_q值分别为1.69、1.65、1.30 Gy；SF₂值分别为0.27、0.27、0.13；外推数N值分别为1.93、1.91、2.31；X射线照射后HMGB1 siRNA组肿瘤细胞的凋亡率明显增加，同时bcl-2蛋白表达显著降低，而bax、caspase-3蛋白的表达明显增加（与空白对照组和阴性对照组比较，P < 0.01）。结论： siRNA干扰技术可用来抑制食管鳞癌细胞中HMGB1基因的表达，联合X射线照射降低了肿瘤细胞的增殖水平和存活能力，诱导了细胞凋亡，增加了放射敏感性，该作用可能与调控bcl-2、bax和caspase-3基因表达有关。