红霉素、阿奇霉素、磺胺嘧啶、大蒜素体外抗弓形虫作用的研究

目的　比较阿奇霉素、红霉素、磺胺嘧啶、大蒜素体外抗弓形虫的效果。方法　用弓形虫RH株速殖子感染培养的巨噬细胞 ,每一种药物根据预实验设立 2至 3个浓度 ,分别在速殖子侵入细胞前和侵入细胞后用不同浓度的药物处理 ,每隔 1h在倒置显微镜下观察细胞及弓形虫的形态及生长情况 ,9d后取出盖玻片 ,染色透明后 ,镜下观察。再将培养液及培养细胞注入鼠腹腔 ,观察小鼠的发病情况。结果　阿奇霉素的浓度在 2 0 μg/ml时具有抑制虫体生长的作用 ,>40 μg/ml时对巨噬细胞有明显的毒性。红霉素的浓度在 10 0 μg/ml、15 0 μg/ml时可抑制弓形虫的生长与繁殖 ,但不能完全杀死虫体 ,形成假包囊。将假包囊及培养液接种小鼠腹腔 6d后小鼠发病死亡 ,解剖小鼠后 ,可见大量的虫体。没有观察到 10 0 μg/ml、2 0 0 μg/ml的磺胺嘧啶及 2 0 μg/ml、40 μg/ml的大蒜素有抑制弓形虫生长的作用。 结论　阿奇霉素具有明显杀灭速殖子的作用。低浓度的红霉素有利于包囊形成。磺胺嘧啶、大蒜素体外无杀灭速殖子的作用。     

弓形虫体外感染巨噬细胞的实验研究

观察弓形虫体外感染巨噬细胞及基在细胞内增殖的动态变化。用ＲＨ株刚地弓形虫感染小鼠腹腔Ｍψ，计算不同孵育时间的纳虫泡内虫体数，直线回归方程处理。弓形虫与Ｍψ的比例直接影响Ｍψ的感染率。弓形虫速殖子感染单层Ｍψ，只需１ｍｉｎ便可侵入，虫体侵入细胞至开始增殖，约经３ｈ的迟滞期，弓形虫增殖一所所需的时间为３．１３ｈ。     

弓形虫慢性感染鼠形成包囊的实验研究

目的分别采用弓形虫Fukaya株速殖子和包囊感染小鼠,观察其脑内成囊情况,以期寻求一个稳定、易建立的慢性感染动物模型,为研究弓形虫的致病机理提供一个良好的实验工具.方法用弓形虫Fukaya株速殖子4×104个和包囊5～10个经腹腔感染昆明小鼠,给适量药物使之形成慢性感染,统计小鼠的死亡率、脑内包囊数和成囊率.结果感染弓形虫速殖子组小鼠的死亡率为30%,脑内包囊数约为15个,成囊率为42.9%;感染弓形虫包囊组小鼠的死亡率、脑内包囊数、成囊率分别为0、40个和100%.接种包囊比速殖子小鼠死亡率低,脑内包囊数多,成囊率高.结论接种虫体感染阶段(包囊或速殖子)是影响成囊的重要因素,感染包囊小鼠脑内易成囊.     

匹多莫德体外抑制弓形虫增殖作用的研究

目的评价匹多莫德对体外细胞培养弓形虫的抑制作用。方法在96孔板中采用Hela细胞培养稳定表达绿色荧光蛋白的弓形虫RH株速殖子,实验设匹多莫德用药组、磺胺甲嗯唑（SMX）用药组、SMX＋匹多莫德联合用药组以及未用药对照组,观察比较绿色荧光弓形虫速殖子给药后48、72、96h和120h的增殖情况及活虫数。结果与未用药组比较,SMX1mg／ml（P〈0．01）、0．5mg／ml（P〈0．01）和0．25mg／ml（P〈0．01）剂量组在各时间点均可显著抑制弓形虫速殖子的增殖;匹多莫德25μg／ml（P〈0．05）、12．5μg／ml（P〈0．05）和6．25μg／ml（P〈0．05）剂量组均可一定程度地抑制弓形虫速殖子的增殖;SMX（0．25mg／ml）＋匹多莫德（25μg／ml）活虫数最低,与SMX1mg／ml单独使用对弓形虫速殖子的抑制作用相近（P=0．311）。结论匹多莫德具有一定的体外抑制弓形虫速殖子增殖的作用;匹多莫德与SMX联合应用既能降低SMX用量又能有效抑虫。     

复方一枝蒿颗粒体外抗弓形虫RH株速殖子的超微结构观察

目的 探索复方一枝蒿颗粒体外对弓形虫RH株速殖子超微结构的影响。方法 收集弓形虫RH株速殖子感染72 h后的昆明（KM）小鼠腹腔冲洗液,加入复方一枝蒿颗粒水溶液使药物终浓度达到0.8 mg/mL,并以0.04 mg/mL剂量阿奇霉素作为阳性药物对照,同时设立空白对照组。置二氧化碳孵箱作用2 h,分别制备吉瑞氏复合染色涂片和透射电镜样本,比较观察各实验组弓形虫速殖子光镜下形态和透射电镜下超微结构。结果 空白对照组虫体符合弓形虫速殖子超微结构正常形态,而阳性药物对照组和复方一枝蒿颗粒作用组均显示着色较浅的异常形态虫体：虫体肿胀变形,两端钝圆。细胞质着色浅且偶见空泡,个别虫体细胞膜似有断裂缺如,胞膜不完整。透射电镜下可见阳性药物对照组和复方一枝蒿组弓形虫速殖子细胞质疏松并出现大量不规则空泡等异常形态,复方一枝蒿颗粒还可使弓形虫速殖子超微结构发生胞膜断裂、破损,核膜破损,致密颗粒增多等改变。结论 复方一枝蒿颗粒具有损伤弓形虫速殖子超微结构的直接作用。     

激光照射弓形虫诱导的免疫保护力

本实验采用激光致弱弓形虫速殖子接种ＩＣＲ小鼠腹腔,以期提高小鼠抗弓形虫感染的免疫保护力。结果表明：激光照射能够抑制虫体的繁殖和分裂能力。照射虫体免疫小鼠能诱导产生持续升高的ＩgＧ抗体。免疫鼠经弓形虫ＲＨ株攻击后,其发病和死亡时间延长,表现出部分的免疫力。提示：激光对弓形虫速殖子的作用明显,可望在弓形虫形虫病的治疗和预防中得到应用。     

霍乱毒素佐剂联合弓形虫ESA鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染作用

目的 观察霍乱毒素(cholera toxin,CT)佐剂和弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用。方法 6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为3组,每组20只。分别用PBS 20μl、ESA 20μg或CT 1.0μg+ESA 20μg每只滴鼻免疫2次,间隔2周。末次免疫后14 d,用4×104个弓形虫速殖子每只灌胃攻击所有小鼠,观察小鼠健康及死亡情况。速殖子攻击后30 d,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子。结果 CT作为佐剂联合弓形虫ESA滴鼻免疫小鼠的健康状况明显好于PBS组和ESA组,存活率(95%)也显著高于PBS组(55%)。与PBS组相比,CT+ESA组肝和脑组织内速殖子数分别减少了80.19%(P0.001)和78.24%(P0.005)。CT作为佐剂联合ESA滴鼻免疫小鼠诱导了高水平的黏膜免疫应答和系统免疫应答。结论 CT作为佐剂联合弓形虫ESA滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答可有效抵抗弓形虫速殖子攻击。     

经口感染弓形虫在小鼠组织内的动态分布

目的 观察经口感染弓形虫速殖子在小鼠小肠组织、实质器官内的动态分布.方法 BALB/c小鼠96只,随机分为8组,0d组用0.5ml PBS/只灌胃,其余组用RH株弓形虫速殖子1×104个灌胃感染,感染后2、4、6、8、10、12、14d处死小鼠,每次处死12只,取十二指肠、空肠、回肠、肝脏、脾、肾、肺、心和脑做组织印片,吉-瑞氏染色,镜检.结果 感染后2d 在十二指肠、空肠、回肠、肺和心,4d在脾,6d在肾和肝脏发现虫体,脑内未发现虫体.十二指肠、空肠、回肠组织内虫体数量呈上升趋势,第6天达高峰后稍有下降.肝内虫体数量呈上升趋势,第6天最多;脾内虫体数量在6d达峰值后保持较高水平;实验期间肾、肺和心内虫体数量保持较低水平.结论 弓形虫经口感染小鼠后2d,小肠组织出现大量速殖子;同时肺和心内有少量速殖子;4d在脾、6d在肾和肝脏发现虫体;速殖子在上述组织内增殖,并形成假包囊,脑内未发现虫体.     

刚地弓形虫ME49株对体外培养的小鼠胎盘滋养细胞凋亡的影响

目的研究刚地弓形虫ME49株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞凋亡的影响。方法制备小鼠胎盘滋养层细胞并分别接种于不同细胞培养板,对照组加入DMEM高糖培养液孵育,实验组加入相同体积不同密度(2×106/ml、4×106/ml、8×106/ml)弓形虫速殖子培养8h后,AnnexinⅤ-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点细胞凋亡率变化,以蛋白质印迹法分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。结果流式细胞仪检测弓形虫感染后的滋养层细胞凋亡率较对照组有升高趋势(P0.05),呈量效依赖性,弓形虫密度8×106/ml组8h凋亡率最高,为28.37%;荧光显微镜观察,随弓形虫感染密度增加,滋养层细胞凋亡数目增多。蛋白质印迹法检测刚地弓形虫ME49株作用于滋养层细胞8h后实验组的Bax、Bcl-2蛋白表达(与β-actin比值)各为1.24±0.05、1.37±0.03、1.78±0.04与1.15±0.03、1.09±0.05、0.97±0.01,较对照组的比值(1.17±0.06和1.23±0.02)有明显的改变(P0.05)。结论刚地弓形虫ME49株可促进体外培养的孕期小鼠滋养细胞正常凋亡,其机制可能与滋养细胞Bax表达上调和Bcl-2表达下调有关。     

经口感染弓形虫垂直传播小鼠模型的建立

目的建立经口感染弓形虫RH株速殖子垂直传播小鼠模型。方法将54只妊娠0天的BALB/c孕鼠随机分为6组,于妊娠第8天,分别用0,1000,2000,4000,8000,16000个弓形虫速殖子灌胃感染,妊娠第18天处死,记录活胎率,测定母鼠肝、胎盘和胎仔脑组织弓形虫抗原。结果经ELISA检测弓形虫循环抗原证实,孕鼠死亡率与胎盘和胚胎感染率均随感染剂量的增加而升高,而活胎率下降。1000,2000组的胎盘、胚胎未发生感染,4000组的胚胎感染率5.13%,16000组的胚胎感染率20.00%,但孕鼠的健康状况差、死亡率高,均不适宜建立弓形虫垂直传播动物模型。综合分析表明,8000组孕鼠既有较高的存活率,又可保证胎盘和胚胎较高的感染率。结论每只孕鼠灌胃感染8000个速殖子为建立弓形虫垂直传播小鼠模型的适宜剂量。     

鼠巨噬细胞培养弓形虫RH株速殖子的实验研究

目的用鼠巨噬细胞培养弓形虫RH株速殖子及观察弓形虫速殖子入侵鼠巨噬细胞及在其内繁殖的过程.方法按培养传代细胞的常规方法培养鼠巨噬细胞,将鼠巨噬细胞接种到盖玻片上,用弓形虫RH株速殖子感染巨噬细胞,每隔1.5小时取出盖玻片,经吉氏染色、二甲苯透明后,镜下观察摄片.结果弓形虫速殖子大多在感染后0.5 ～1小时侵入巨噬细胞,10小时后,假包囊形成,20小时后,假包囊破裂,在室温条件下,速殖子可在巨噬细胞中存活20天.结论鼠巨噬细胞可代替小鼠用于弓形虫病的诊断及保种.     

尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入Hela细胞的影响

目的：观察刚地弓形虫速殖子在来源于安徽省南部地区的尖吻蝮蛇蛇毒的作用下侵入Hela细胞的数量，探讨尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入Hela细胞的作用。方法：以不同浓度尖吻蝮蛇毒加入分孔培养的细胞中，于不同时间观察感染弓形虫速殖子细胞的数量。结果：尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞有明显的促进作用，弓形虫速殖子在蛇毒的作用下在同一时间内对宿主细胞侵入的数量均高于对照组(P＜0．05——P＜0．01)，但不同剂量的尖吻蝮蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞的作用差异无显著性(P＞0．05)。5．0μg/ml和0．25μg/ml的剂量分别比对照组平均提高了125．49％和81．37％。结论：尖吻蝮蛇毒可以明显增加弓形虫速殖子对宿主细胞的感染率。     

弓形虫速殖子感染对HeLa细胞凋亡的影响

目的: 探讨不同数量弓形虫速殖子感染对HeLa细胞凋亡的影响。方法: 24孔板培养HeLa细胞16 h,各孔接种不同数量弓形虫速殖子继续培养4 h,在培养液中加入终质量浓度为0.5 μg/mL放线菌素D诱导凋亡,于加放线菌素D后8、12、24、36 h收集细胞,采用Hoechst 33258染色法和Annexin V FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。结果： 当虫体量/细胞量（MOI）≤1时,弓形虫感染表现为抑制放线菌素D诱导的HeLa细胞凋亡;随着虫体数量增加（MOI＞1）和感染时间延长（≥24 h）,虫体感染则表现为促进HeLa细胞凋亡。结论： 弓形虫感染可影响体外培养的HeLa细胞的凋亡,影响程度与感染虫体数量相关。     

孕期弓形虫感染对胎盘的入侵和病理损害的研究

目的探讨孕期弓形虫感染对胎盘的入侵和病理损害情况。方法孕8dBALB/c小鼠经腹腔接种弓形虫速殖子,在孕10、12、14、16和18d剖腹取胎鼠,分离胎盘并精确称重。采用HE染色观察胎盘的病理损害情况,RNA原位杂交检测胎盘组织弓形虫速殖子的动态入侵。结果在孕10、12d,感染组胎盘重量与对照组比较无明显差别。而在孕14、16、18d,感染组的胎盘重量明显低于对照组(P0.01)。随着感染时间的延长,胎盘组织切片可见有大量淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞浸润,绒毛血管减少,显示有炎症表现;滋养层细胞破坏明显,可见凋亡小体形成。感染组小鼠在孕10d未检测到虫体,感染孕12d偶见虫体。孕14、16、18d虫体数目明显增多(P0.01),虫体主要位于滋养层细胞内、细胞间质和血管中,并有假包囊形成。结论孕期弓形虫感染可影响胎盘生长,胎盘出现炎症反应和凋亡等病理损害。虫体可侵入胎盘组织细胞间质和血管中,并侵入滋养层细胞内增殖,跨越胎盘屏障传播给胎儿。     

小鼠过继转移致敏小肠IEL抗弓形虫感染

目的研究分离自弓形虫RH株速殖子经口感染小鼠后不同时间点的小肠上皮内淋巴细胞(intraepitheliallymphocyte,IEL)过继转移抗弓形虫感染作用,探讨其作用机制。方法BALB/c鼠经口感染弓形虫速殖子5×104个/只或未感染,作为供体提供IEL。同品系受体鼠分为实验组(IEL7组、IEL9组、IEL11组、IEL13组和IEL15组)和对照组(IEL0组),每组6只小鼠。受体鼠经尾静脉分别接受分离自供体鼠经速殖子感染后第7、9、11、13、15天的致敏IEL或未致敏的IEL3×105/0.2ml只。各组小鼠过继转移后第4天,用弓形虫速殖子灌胃攻击,攻击后第13天分离纯化脑、肺、脾组织弓形虫速殖子并计数,测定肠液IgA含量。结果致敏IEL过继免疫可使受体鼠脑、肺、脾组织内弓形虫速殖子数显著减少,接受感染后第13天IEL的小鼠组织内速殖子数减少最为显著(P<0.01)脑、肺和脾组织内速殖子数比对照组分别减少81.13%,58.43%和70.97%。致敏IEL过继转移使肠道IgA水平升高,IEL11组和IEL13组显著高于IEL0组(P<0.01)。结论致敏IEL过继转移能上调肠道黏膜的免疫应答,导致黏膜特异性IgA分泌增加,诱导黏膜抗体的保护性免疫应答。IEL的这种保护作用具有致敏的时间依赖性,感染后第13天分离的致敏IEL对弓形虫感染具有最大的保护作用。     

金诺芬通过促进自噬对弓形虫增殖的影响

目的：金诺芬对弓形虫速殖子的作用及对弓形虫感染小鼠的自噬初步探讨。方法：透射电子显微镜观察用药前后刚地弓形虫超微结构的变化;采用免疫荧光、免疫组化和免疫印迹法检测感染有弓形虫的脑组织中自噬蛋白LC3的变化。HE染色观察金诺芬作用前后小鼠脑部的弓形虫速殖子变化。结果：透射电镜显示10 ?滋g/mL组（B组）的弓形虫速殖子内部结构被破坏,虫体细胞膜破裂,细胞质均质样改变,20 ?滋g/mL组（C组）的虫体内容物溢出,线粒体及粗面内质网消失,核固缩,核膜断裂,细胞质出现许多空泡,严重者虫体崩解呈均质样改变。免疫荧光结果显示实验组（77.49±15.68）的LC3蛋白的表达量较对照组（53.81±15.24）明显增加（P=0.001）。免疫组化结果显示用药后（1 208.55±580.07）的LC3蛋白表达量比对照组（544.54±225.04）明显增高（P=0.000）。免疫印迹法检测结果显示用药后（41 738.52±0.00）的LC3蛋白表达量比对照组（25 383.88±607.34）明显增高（P=0.000）。用药后（218.80±21.17）寄生在小鼠脑部的弓形虫速殖子增殖数量明显少于对照组（495.40±31.91）（P=0.000）。结论：金诺芬在体外有破坏弓形虫速殖子的作用,同时金诺芬可以提高弓形虫感染小鼠的自噬水平从而抑制弓形虫增殖。     

不同佐剂的复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用

目的比较IFN-γ和蜂胶作为佐剂鼻内免疫小鼠抗弓形虫攻击的能力,探索两种佐剂联合应用的效果。方法将5～6周龄雌性BALB/c小鼠60只随机分为4个组,每组15只,分别用20μg可溶性速殖子抗原(STAg)、20μgSTAg+40μg蜂胶、20μgSTAg+1000UIFN-γ或20μgSTAg+40μg蜂胶+1000UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔14d。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击,逐日观察小鼠存活情况。攻击后第43天处死全部存活小鼠,计算胸腺、脾指数,计数脑、肝组织速殖子。结果STAg+IFN-γ组、STAg+蜂胶+IFN-γ组胸腺、脾指数显著高于STAg组(P<0.05);组织内速殖子虫荷显著降低(P<0.01),STAg+IFN-γ组小鼠脑、肝组织减虫率分别为57.00%和79.06%;STAg+蜂胶+IFN-γ组小鼠脑、肝减虫率分别为68.30%和79.06%。STAg+蜂胶组小鼠胸腺、脾指数有升高趋势,组织内速殖子虫荷降低,但与STAg组比较差异无统计学意义。结论在抗弓形虫感染中,IFN-γ、蜂胶+IFN-γ的佐剂效果优于蜂胶,IFN-γ、蜂胶+IFN-γ辅助...     

红霉素、阿奇霉素、磺胺嘧啶、大蒜素体外抗弓形虫作用的研究

目的 比较阿奇霉素、红霉素、磺胺嘧啶、大蒜素体外抗弓形虫的效果.方法 用弓形虫RH株速殖子感染培养在盖玻片上的巨噬细胞,每一种药物根据其血药浓度及预实验设立2～3个浓度,分别在速殖子侵入细胞前和侵入细胞后用不同浓度的药物处理,每隔1小时在倒置显微镜下观察细胞及弓形虫的形态及生长情况,9天后取出盖玻片,经吉氏染色、二甲苯透明后,镜下观察.再将培养液及培养细胞注入鼠腹腔,观察小鼠的发病情况.结果 阿奇霉素的浓度在20 μg/mL 时具有抑制虫体生长的作用,＞40 μg/mL 时对巨噬细胞有明显的毒性.红霉素的浓度为100 μg/mL、150 μg/mL时可抑制弓形虫的生长与繁殖,但不能完全杀死虫体,形成假包囊,将假包囊及培养液接种小鼠腹腔,6天后,小鼠发病死亡,解剖小鼠后,可见大量的虫体.没有观察到100 μg/mL 、200 μg/mL的磺胺嘧啶及20 μg/mL、40 μg/mL的大蒜素抑制弓形虫生长的作用.结论 阿奇霉素具有明显的杀灭速殖子的作用,但浓度大于40 μg/mL时对细胞的毒性较大,100 μg/mL的红霉素可抑制弓形虫生长繁殖,形成假包囊(或包囊).当红霉素的浓度达150 μg/mL时,对弓形虫的抑制作用增强,但不能完全杀灭弓形虫.100 μg/mL、200 μg/mL的磺胺嘧啶及20 μg/mL、40 μg/mL的大蒜素对弓形虫的生长无抑制作用.     

一种简易的弓形虫速殖子纯化法

人类弓形虫病的诊断,往往以血清学试验结果为依据。弓形虫抗原的制备,多以弓形虫速殖子感染小鼠,提取腹腔渗液中的虫体,或组织培养液中的虫体。此二种虫体来源,都不可避免地混有大量宿主细胞或组织     

不同品系小鼠对弓形虫速殖子繁殖率影响的比较

小鼠常作为弓形虫实验研究的动物模型。为获取高得量的虫体,必须选择对弓形虫感染敏感的小鼠品系。本研究选用昆明种、CFW、BALB/c和C_(57)BL/64个品系小鼠作人工感染,进行比较观察。对6周龄小鼠,用弓形虫人株(ZS_2)速殖子(滋养体),用量按1c~4个或10~6个两种(按白细胞计数法计数),腹腔内接种。第3天处死小鼠,吸取腹腔内液体,计数虫体,算出每只小鼠的得量,并统计小鼠在3天内的死亡率。两批实验研究的结果见表。