两种类风湿关节炎滑膜侵蚀软骨联合免疫缺陷模型的建立及比较

目的 比较背部皮下与肾包囊内2种不同移植方式所建立的类风湿关节炎(RA)滑膜侵蚀软骨联合免疫缺陷(SCID)模型的病理学及血清学改变,为采用人滑膜和软骨进行RA炎症及软骨损伤机制和治疗的体内研究提供实验系统.方法 15只SCID小鼠随机分为皮下移植组、肾包囊移植组及空白对照组,无菌获取RA患者滑膜及人正常软骨,通过相应的移植方式共同植入各组SCID小鼠体内.分别于术后4、8周取移植组织,进行组织病理学分析;留取血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人类风湿因子(RF)水平.结果 皮下移植组成活率及建模成功率较肾包囊组明显增高,两组滑膜中炎细胞浸润、滑膜增殖、软骨侵蚀评分及血清RF-IgM水平差异均无统计学意义(P>0.05).结论 与肾包囊移植相比,背部皮下移植建立的SCID-HuRAg在炎症及骨侵蚀及血清学改变上差异无统计学意义,且操作简便,成功率高,是进行人RA滑膜对软骨侵蚀机制和治疗体内研究的理想动物模型.     

类风湿关节炎滑膜侵蚀软骨SCID鼠模型的建立及初步实验研究

目的建立类风湿关节炎(RA)-SCID小鼠模型,观察滑膜对软骨的侵蚀情况,为探讨RA滑膜侵蚀软骨机制及治疗奠定基础。方法70只SCID小鼠,3～6周龄。无菌获得12例非关节炎患者正常关节软骨,修剪成约2 mm×2 mm×1 mm后备用。同时取10例RA患者(膝关节或髋关节)滑膜组织修剪成约3 mm×6 mm的小块(片),这些小块包裹软骨后共植入SCID鼠肾包囊处,4例骨关节炎(OA)患者滑膜及2例正常滑膜同样处理作对照。术后观察小鼠和移植物的一般情况,从第4周开始分批处死SCID小鼠并切除移植物,进行苏木素-伊红(HE)染色病理分析。结果大部分滑膜及软骨在SCID小鼠体内存活,4周开始滑膜黏附并侵蚀软骨,12周后RA滑膜明显破坏软骨,移植物细胞浸润、软骨破坏与RA病理类似,OA滑膜轻微破坏软骨,而正常滑膜几乎不破坏软骨。结论RA滑膜植入SCID可成活并能侵蚀软骨,RA-SCID小鼠可作为人源化滑膜侵蚀软骨模型,在探讨机制特别是软骨破坏及治疗方面可能有明显优势。     

MiR-155在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达及功能研究

目的 检测miR-155在类风湿关节炎(RA)患者滑膜成纤维细胞(SFs)中的表达,探讨miR-155对RASFs细胞因子分泌、细胞增殖、侵袭能力的影响及其机制.方法 留取RA患者及骨关节炎(OA)患者各9份膝关节置换术后滑膜组织,分离培养滑膜成纤维细胞,取第3～5代细胞用于实验.①提取总RNA,利用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定miR-155在RASFs和OASFs中固有性表达水平.②Lipo2000脂质体分别转染化学合成的miR-155类似物,miR-155抑制剂及无关序列小RNA对照.③转染48 h后通过酶联免疫吸附试验(E12SA)检测细胞上清基质金属蛋白酶(MMP)-3的分泌;通过3H掺入法检测细胞增殖;通过细胞侵袭试验(transwell)法检测细胞侵袭能力;通过RT-PCR法检测miR-155下游靶标IKBKE的mRNA表达水平.2组比较采用独立样本t检验,多组比较采用方差分析.结果 ①RA患者SFs中miR-155的表达明显高于OA组[分别为(1.79±1.94)和(0.11±0.17),P<0.05];②miR-155可抑制RASFs分泌MMP-3、细胞增殖和侵袭能力;③RASFs过表达miR-155后IKBKE的mRNA水平明显下调(P<0.05).结论 RASFs miR-155的表达上调,可能与滑膜局部的炎症环境相关;miR-155抑制RASFs增殖和降低侵袭能力可能是RASFs分泌MMP-3减少的原因之一,miR-155抑制RASFs分泌MMP-3可能与miR-1.55下调靶标IKBKE mRNA表达水平相关.     

微小RNA-146a对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞抑制作用的研究

目的 研究微小RNA-146a(miR-146a)对类风湿关节炎(RA)患者滑膜成纤维细胞增殖及细胞因子分泌的影响.方法 体外分离培养RA患者滑膜成纤维细胞,脂质体转染化学合成的miR-146a,~3H掺入法检测滑膜成纤维细胞增殖.酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞上清白细胞介素(IL)-8及IL-6水平.实时定量聚合酶链反应(PCR)检测滑膜成纤维细胞中miR-146a靶分子肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、IL-受体相关激酶(IRAKI)的mRNA水平.应用独立样本t检验进行统计学分析.结果 与阴性对照小RNA相比,miR-146a转染后的滑膜成纤维细胞增殖能力明显下降(2015±545与8799±1922,P<0.01),IL-8及IL-6分泌受到明显抑制[(153±49)pg/ml与(311±123)pg/ml,P<0.01和(295±95)pg/ml与(459±126)pg/ml,P<0.05].定量PCR检测IRAK1的mRNA水平显示,miR-146a转染可明显下调滑膜成纤维细胞IRAK1的表达(0.28±0.07与1,P<0.01).结论 miR-146a可能通过下调IRAKI表达,进而抑制滑膜成纤维细胞增殖及IL-8、IL-6等炎性细胞因子分泌,从而发挥抑制RA滑膜炎症的作用.     

IL-23在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞RANKL表达中的作用

目的探讨IL-23在类风湿关节炎(RA)滑膜成纤维细胞核因子κB(NF-κB)受体激活剂配体(RANKL)表达中的作用;并分析IL-23诱导RANKL表达的信号传导通路。方法分离RA和骨性关节炎(OA)患者滑膜成纤维细胞,分别加入不同浓度的IL-23(1、5和10 ng/ml),72 h后,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测RANKL mRNA表达。为了研究RANKL表达的信号传导通路,在成纤维细胞中分别加入PD98059、Ly294002、AG490和Pathenolide孵育1 h,然后加入IL-23刺激72 h,FQ-PCR法检测RA患者RANKL mRNA表达水平。结果IL-23能上调RA滑膜成纤维细胞RANKL表达;与之相反,IL-23几乎不诱导OA患者成纤维细胞RANKL表达。加入PD98059、Pathenolide和AG490后,IL-23诱导RA患者滑膜成纤维细胞RANKL的表达明显被抑制。结论IL-23可能通过MEK1/2、NF-κB和STAT3信号途径诱导RA滑膜成纤维细胞表达RANKL。     

染料木黄酮对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞生长的影响

目的 研究酪氨酸激酶（ＰＴＫ）在类风湿关节炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ,ＲＡ）成纤维样滑膜细胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ,ＦＬＳ）异常增生与转化特性中的作用。方法 原代培养类风湿关节炎成纤维样没膜细胞。应用形态观察、细胞计数、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入、流式细胞仪检测和双层琼脂培养法探讨染料木黄酮,特异性ＰＴＫ抑制剂对于ＲＡＦＬＳ细胞生长状态、数目、ＤＮＡ合成     

Etanercept抑制BNX鼠-人RA移植物嵌合体模型中的滑膜增生和软骨侵蚀及降解

目的观察肿瘤坏死因子（TNF）-α拮抗剂Etanercept能否抑制类风湿关节炎（RA）的滑膜增生和软骨破坏，并探讨作用机制。方法将人RA滑膜和正常关节软骨移植到BNX小鼠皮下构建BNX鼠-人RA移植物嵌合体模型，造模4周后给予Etanercept（100μg）皮下注射，连续4周，对照组给予注射用水。评价移植物中的滑膜增生、滑膜细胞对软骨的侵蚀和软骨细胞周围软骨降解的组织学积分，并检测血清TNF-α含量，滑膜的TNF-α和人血管内皮生长因子（VEGF）的表达以及滑膜细胞凋亡情况。结果与对照组比较．Etanercept组中滑膜增生、软骨侵蚀、软骨降解积分以及血清TNF-α含量均显著降低：滑膜细胞的TNF-α和VEGF表达水平也显著下降。但滑膜细胞凋亡程度差异无统计学意义。结论Etanercept能抑制嵌合体模型中的滑膜增生和软骨侵蚀及降解。其作用机制除了中和滑膜组织和血液中的TNF-α外．还可能与下调滑膜细胞的VEGF表达有关。     

类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞表观遗传学研究进展

RA是一种以免疫功能障碍和慢性炎症为特征的关节疾病。成纤维样滑膜细胞（FLS）是位于关节囊的内层并介导RA关节破坏的主要细胞,其在RA疾病过程中扮演重要角色。而表观遗传因素能够影响FLS的基因表达,从而对RA的发生发展起到重要的调控作用。表观遗传调控机制主要包括DNA修饰、组蛋白翻译后修饰和非编码RNA调控。随着基因测...     

类风湿关节炎成纤维滑膜细胞端粒保护蛋白TPP1及POT1 mRNA表达的研究

目的 检测端粒保护蛋白TPP1及POT1 mRNA在类风湿关节炎(RA)、骨关节炎(OA)患者及健康人成纤维样滑膜细胞(SFs)的表达水平.探讨其在RA发病机制中可能的作用.方法 体外培养SFs,用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法检测28例RA、15例OA和3名健康者SFs TPP1,POT1mRNA的表达水平,并与疾病活动性等临床指标进行分析.结果 TPP1,POT1 mRNA在RA SFs组的表达低于OA组及健康对照组(P均＜0.05).OA组和健康对照组间差异无统计学意义.TPP1 mRNA在RA SFs的表达水平与RA患者抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体及类风湿因子(RF)呈负相关(P均＜0.05),与疾病活动指数(DAS)、红细胞沉降率(ESR)、血清C反应蛋白(CRP)无相关性;POT1 mRNA表达与DAS、CCP、RF均无相关性.结论 端粒保护蛋白TPP1、POT1基因表达的降低可能在RA SFs出现转化细胞特性中发挥重要作用;TPP1基因表达降低可能与RA出现关节侵蚀性改变密切相关.通过调整端粒保护蛋白TPP1、POT1基因的表达水平,有望为RA的治疗寻找新的靶点.     

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞来源外泌体提取方法的研究

目的从外泌体分离的常用方法中探索获取高质量人滑膜成纤维细胞外泌体的有效方法。方法分别用超速离心法、尺寸排阻法和改良的聚合物沉淀法3种方法提取人滑膜成纤维细胞外泌体, 采用透射电镜、蛋白质印迹法(Western Blot)、纳米颗粒追踪分析(NTA)鉴定并比较外泌体的形态特征、粒径分布、浓度以及标志蛋白的表达水平。3组差异比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果 3种方法均能成功提取得到外泌体, 透射电镜下均能观察到典型的茶托状结构, 蛋白质印迹法均能检测到标志蛋白肿瘤易感基因101(TSG101)、多配体聚糖结合蛋白1(Syntenin-1)、CD63的表达, 粒径主峰均符合30～150 nm范围。外泌体纯度方面:超速离心法杂质最少, 尺寸排阻法杂质中等, 而改良的聚合物沉淀法可观察到大量的聚合物颗粒和蛋白杂质。外泌体得率方面:3种方法得到的外泌体颗粒浓度差异有统计学意义(F=9.61, P=0.049), 改良的聚合物沉淀法得到的外泌体颗粒浓度高于超速离心法[(98.0±17.0)×1010个/ml和(11.6±...     

类风湿关节炎患者血清和滑膜骨桥蛋白的测定

目的 研究骨桥蛋白(OPN)在类风湿关节炎(RA)患者外周血中的浓度变化及在滑膜的表达,探讨OPN在RA患者中的发病机制.方法 收集91例RA患者以及29名正常对照人群临床资料和血清,用酶联免疫吸附试验(ELIsA)方法检测OPN在RA患者外周血中的浓度,分析其变化和RA临床及实验室指标的关系.收集7例RA患者和1名正常对照的滑膜组织,用免疫组织化学的方法观察OPN的表达情况.结果 与正常对照组相比,活动组和非活动组的RA患者外周血中OPN水平均明显升高(p＜0.01),且与RA患者的部分临床指标有相关性:与压痛关节数(r=0.435,P=0.005)、关节的X线分期(r=-0.415,P=0.007)、关节功能(r=0.394,P=0.012)显著相关.OPN在RA滑膜组织大量表达,而在正常对照仅见OPN的少量表达.结论 OPN在RA患者外周血中浓度显著升高,且在滑膜表达明显,OPN可能与RA滑膜增生、骨侵蚀有关.     

OPG RANKL RANK等因子在类风湿关节炎患者血清及滑膜液中的变化及意义

目的检测类风湿关节炎（RA）患者血清、滑膜液中骨保护素（OPG）、核刺激因子受体配体（RANKL）、核刺激因子受体（RANK）、白细胞介素（IL）-18和前列腺素E-2（PGE2）水平，探讨其与RA发生发展的相关意义。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测60例RA患者与60例同期入院骨外伤患者（作为正常对照组）血清、滑膜液中OPG、RANKL、RANK、IL-18和PGE2水平，分析其与RA的相关性。结果RA患者血清、滑膜液中OPG水平明显低于正常对照组（P〈0．05），RANKL、RANK、IL-18和PGE2水平明显高于对照组（p〈0．05）。结论RA患者血清、滑膜液中OPG水平降低，RANKL、RANK、IL-18和PGE2水平升高。推测上述细胞因子参与RA发病过程。     

趋化素样因子1在类风湿关节炎滑膜中的表达研究

目的研究趋化素样因子1(CKLF1)在类风湿关节炎(RA)滑膜中的表达,探讨CKLF1在RA发病过程中的可能的病理作用。方法取35例RA,20例骨关节炎(OA)及20例半月板损伤患者手术切除的膝关节滑膜标本。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测CKLF1在上述3种病变滑膜中的mRNA水平表达水平。采用免疫组织化学方法检测CKLF1在滑膜组织中的蛋白水平表达特征。结果RA滑膜组织中CKLF1在mRNA水平的表达(0．41±0．17)明显高于OA(0．07±0．06)和半月板损伤患者(0．16±0．10)(P<0．05)。免疫组织化学结果显示,OA病例中仅有2例显示少量滑膜衬里层细胞着色,半月板损伤病例仅有5例显示少量滑膜衬里层细胞着色。在RA滑膜中20例染色强阳性,10例染色阳性,5例染色阴性。阳性染色颗粒位于细胞胞质内,阳性细胞定位在滑膜衬里层的成纤维细胞、滑膜下层大量的浆细胞以及增生的血管上皮细胞。结论CKLF1基因在RA滑膜中有高水平的表达特征,为进一步深入研究RA的发病机制提供新的研究思路。     

表皮生长因子对类风湿关节炎滑膜细胞的作用

目的 观察表皮生长因子（ＥＧＦ）对类风湿关节炎（ＲＡ）滑膜细胞的作用和细胞中有丝分裂素激活的蛋白激酶（ＭＡＰＫ）的激活情况。方法 ３～５代体外培养的ＲＡ滑膜细胞,＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入检测ＥＧＦ对细胞ＤＮＡ合成的影响;ＥＧＦ刺激后裂解细胞,收获蛋白,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ＭＡＰＫ的活化。结果 ＥＧＦ刺激组和对照组每分钟计数值差异有显著性（Ｐ〈０．００１）。ＥＧＦ能引起细胞内明显ＭＡＰＫ活化。结论     

他克莫司对类风湿关节炎关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子的作用

目的研究他克莫司对类风湿关节炎（RA）患者关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子的作用．并初步探讨其免疫抑制的机制。方法分离培养RA关节滑膜液淋巴细胞，经100nmol/L的他克莫司处理后．用流式细胞仪检测T淋巴细胞协同刺激分子CD28、CD154（CD40L）和B淋巴细胞协同刺激分子CD80、CD86、CD40的表达。同时检测T、B淋巴细胞活化标志CD69、CD25、HLA—DR和CD71的表达．用酶联免疫吸附法（ELISA）检测淋巴细胞培养上清Th1细胞分泌的细胞因子白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ和Th2细胞分泌的细胞因子IL-6、IL-10的水平，并设不加他克莫司处理的为对照组。结果经他克莫司处理后。T淋巴细胞的CD154（CD40L）和B淋巴细胞的CD86表达阳性率低于对照组（P〈0．05），而T淋巴细胞的CD28和B淋巴细胞的CD80、CD40表达阳性率与对照组相比差异无统计学意义；T、B淋巴细胞的HLA—DR表达阳性率明显低于对照组（P〈0．01），而CD69、CD25、CD71表达阳性率与对照组相比差异无统计学意义；淋巴细胞培养上清Th1细胞分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ和Th2细胞分泌的细胞因子IL-6、IL-10的水平与对照组相比均显著下降（P〈0．01）。结论他克莫司能明显抑制RA关节滑膜液淋巴细胞的活化，降低Th1细胞因子和Th2细胞因子的分泌水平，这种作用可能是通过下调淋巴细胞的协同刺激分子的表达而实现。     

RNAi抑制类风湿关节炎成纤维细胞环氧合酶-2合成及对炎症因子的影响

目的体外合成和筛选特异性阻断人滑膜成纤维细胞（RASF）环氧合酶-2（hCOX-2）的小分子干扰RNA（siRNA），同时了解COX-2抑制对炎症因子表达水平的影响。方法设计4条针对人COX-2mRNA siRNA（1#-4#siRNA），1条随机序列作为对照。分成A～H组，A组为空白阴性对照，B～F组处理依次为随机siRNA、1#-4#siRNA。应用LipofectAMINE 2000将上述siRNA转染入RASF，各培养孔加入100nmol／L的佛波酯。转染48h后，分别应用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和Western Blot检测hCOX-2mRNA和蛋白表达水平。采用酶联免疫吸附（ELISA）方法检测各组上清液中前列腺素E2（PGE2）和白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、血管内皮生长因子（VEGF）水平。结果4#siRNA转染的RASF表达hCOX-2mRNA和蛋白水平明显低于其他siRNA干预组和阴性对照，且其上清液PGE2和IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF水平较其他各组明显下降。结论4#siRNA能有效抑制COX-2mRNA表达和COX-2蛋白的合成，且上清液中PGE2和IL-1β、IL-6、TNF-α及VEGF水平最低。     

类风湿关节炎滑膜细胞的增殖及细胞周期的研究

目的　研究类风湿关节炎 (RA )患者滑膜细胞增殖变化及其机制。方法　应用MTS/PMS比色法和流式细胞分析技术分别测定RA患者滑膜细胞的细胞增殖水平和细胞周期 ,以骨关节炎 (OA)病人及因外伤截肢的正常人作对照。结果　RA患者滑膜细胞接种后第 4天增殖水平 (0 .5 3 63± 0 .0 0 7)显著高于对照组 (0 .4187± 0 .0 0 8,P <0 .0 5 ) ,细胞周期分析显示RA患者滑膜细胞G1期的比例 (61.92 % )比对照组明显降低 (74.2 8% ) ,P <0 .0 5 ,而S、G2期的细胞比例比对照组则明显增加 ;加入RA患者滑液能以剂量依赖性明显提高滑膜细胞的增殖水平 ,并使G1期细胞进一步降低 ,S、G2期细胞进一步增加。结论　含有多种免疫调节因子的滑液使RA患者滑膜细胞在G2、S期的滞留 ,是滑膜细胞过度增殖 ,从而导致RA发病的重要因素。