蓝光致人视网膜色素上皮细胞凋亡与线粒体膜电位和细胞色素C的关系

目的探讨蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡及对线粒体膜通透性转运功能的影响。方法用蓝光光照体外培养的人RPE细胞。实验分为三部分。第一部分:不同光照度,分为3组,第1组光照度(500±100)lx,第2组光照度(2000±500)lx,第3组光照度(3000±500)lx;光照RPE细胞时间6h,光照结束后24h终止培养。第二部分:同一光照度、不同光照时间,检测RPE细胞亚型时分为3组,第1组光照时间6h,第2组光照时间12h,第3组光照时间24h,光照度均为(2000±500)lx;检测线粒体膜电位时也分为3组,第1组光照时间3h,第2组光照时间6h,第3组光照时间12h,光照度均为(2000±500)lx。第三部分:同一光照度和光照时间,光照度(2000±500)lx,光照RPE细胞时间6h;不同细胞培养终止时间分为4组,第1组终止细胞培养时间为光照后6h,第2组为光照后12h,第3组为光照后24h,第4组为光照后36h。利用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色、荧光素标记的AnnexinV-FITC和PI双染流式细胞检测、透射电镜等手段观察RPE细胞凋亡情况。罗丹明123荧光染料孵育人RPE细胞,流式细胞仪检测线粒体膜电位,酶联免疫法测定细胞色素C活性,比色测定法测定Caspase-3的活性。结果第二部分第1组TUNEL染色阳性细胞的体积缩小变圆,胞核浓缩,边聚成新月形或帽状,细胞核碎裂成数个,细胞膜出胞。透射电镜观察发现细胞内线粒体肿胀,线粒体内膜嵴消失,粗面内质网扩张,溶酶体增加。第一部分(500±100)lx光照未引起明显的RPE细胞损伤,但线粒体膜电位明显下降;随着光照度增加,RPE细胞出现凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,同时线粒体膜电位逐渐下降。第二部分光照6和12h,凋亡细胞百分比增加,荧光强度明显下降;光照24h凋亡继发性坏死细胞、坏死细胞百分比增加。第三部分光照后6和12h,RPE细胞凋亡百分比逐渐增加;光照后24、36h凋亡继发性坏死细胞和坏死细胞百分比明显增加,光照后各时间点RPE细胞荧光强度明显下降。以光照度(2000±500)lx照射6和12h,可见光照后24和36h两组的细胞色素C浓度明显升高,未检测到Caspase-3活性变化。结论蓝光照射可导致体外培养的人RPE细胞凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,其损伤程度与光照度和时间相关;蓝光照射导致培养的人RPE细胞损伤过程与线粒体膜电位降低、细胞色素C释放有关;线粒体膜电位可作为检测蓝光致人RPE细胞凋亡的早期指标。     

可见光照对培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

目的 研究可见光照对培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡的影响。 方法 以白色荧光灯为光源，用500 lx、(2000±500) lx及(3400±200) lx不同光照强度,按不同的光照时间(无光照、6、12、24 h)照射培养的人RPE细胞。利用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling, TUNEL)、荧光素标记的连接素V/碘化丙锭(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/Propidium iodium，Annexin V-FITC/PI)双染色流式细胞测定、相差倒置显微镜等手段观察RPE细胞凋亡(分为光照后6、12、24、36 h组)。 结果 可观察到RPE细胞出现两种死亡形式，凋亡与坏死。(1)低于一定阈值(500 lx)的光照对细胞损伤较轻，细胞凋亡及坏死随光照强度的增加而增加。(2)在较短的光照时间(6 h和12 h)内，细胞死亡的增加以凋亡为主；随着光照时间的延长，细胞坏死逐渐明显。(3)随着光照后培养时间的延长，细胞凋亡明显增加(P＜0.05)。光照后6、12、24 h的损伤改变以凋亡为主，但随时间的延长，凋亡继发性坏死的增加显著。光照后36 h，细胞的坏死数显著增高(P＜0.01)。 结论 可见光超过一定照度(500 lx)可导致培养的人RPE细胞凋亡及坏死的显著增加，其损伤程度为光照强度及时间依赖性。较低光照强度及较短光照时间主要诱导细胞凋亡，反之则导致细胞坏死。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 227-230)     

蓝光照射致人视网膜色素上皮细胞线粒体凋亡的途径及机制

背景 研究已证实蓝光照射可导致视网膜色素上皮细胞(RPE)凋亡,但其机制目前尚不完全清楚. 目的 探讨线粒体凋亡通路是否参与蓝光照射诱导体外培养的人RPE细胞凋亡过程.方法 分离新鲜的供体视网膜,对人RPE细胞进行原代培养和传代,用角蛋白单克隆抗体行细胞鉴定.将体外培养的人RPE细胞分为无光照组、单纯光照组、光照+硝苯地平组、光照+钙磷酸结合蛋白C(calphostin C)组、光照+佛波酯(PMA)组.光照组细胞用(2 000±500) lx的蓝光照射人RPE细胞6h,然后继续培养24 h后终止.采用Western blot法比较两个组间RPE细胞中凋亡相关调控因子bax、bcl-2、bcl-xl的相对表达,以评价蓝光照射对RPE细胞凋亡的影响.光照+硝苯地平组、光照+calphostin C组、光照+PMA组细胞在蓝光照射前1h分别在培养基中加入相应药物,然后以(2 000±500) lx的蓝光照射人RPE细胞6h,并继续培养24 h,采用Westernblot法检测5个组细胞中caspase-9蛋白表达量的变化,观察钙通道和蛋白激酶C(PKC)通路对RPE细胞线粒体的影响.结果 培养的细胞生长良好,细胞质内充满色素颗粒,呈铺路石样排列,对角蛋白呈阳性反应.无光照组和单纯光照组均可见bax、bcl-2及bcl-xl蛋白条带,相对分子质量分别为23 000、26 000和30 000.与无光照组比较,单纯光照组bax、bcl-2和bcl-xl蛋白表达相对值(A)下降,差异均有统计学意义(t=-4.409,P=0.012;t=7.575,P=0.002;t=6.068,P=0.004).与无光照组比较,单纯光照组、光照+calphostin C组、光照+PMA组细胞中caspase-9蛋白表达均升高,差异均有统计学意义(P=0.005、0.002、0.000),而光照+硝苯地平组与无光照组比较差异无统计学意义(P=0.191).与单纯光照组比较,光照+PMA组caspase-9蛋白表达升高,差异有统计学意义(P=0.005);而光照+硝苯地平组及光照+calphostin C组caspase-9蛋白表达差异均无统计学意义(P=0.057、0.643). 结论 蓝光致体外培养的人RPE细胞凋亡,同时细胞中caspase-9表达增强,凋亡抑制基因bcl-2及bcl-xl表达下降,凋亡促进基因bax蛋白表达增强.线粒体凋亡通路参与蓝光照射致RPE细胞凋亡的过程;PKC通路可能参与了蓝光导致的人RPE细胞凋亡.     

蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子蛋白激酶C信号通路的影响

 目的 观察蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子（Ca2+）蛋白激酶C（PKC）信号通路的影响。方法 体外培养并鉴定人视网膜色素上皮（RPE）细胞,取第4代人RPE细胞随机分组进行实验。采用蛋白免疫印迹法测定培养细胞PKC蛋白表达,检测佛波酯（PMA）和钙磷酸结合蛋白（calphostin C）对PKC活性的影响,确定PMA与calphostin C影响PKC活性的最适宜浓度。采用非放射性核素法测定蓝光照射处理对培养细胞PKC活性的影响。采用20 W,波长450～500 nm医用蓝光灯作为光源,光照强度（2000±500） Lux,照射6 h,24 h后终止培养,以此制造体外培养人RPE细胞光损伤。将培养细胞随机分成5个组,即无光照、单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合calphostin C、光照联合PMA组。其中,无光照组不接受光照;单纯光照组仅接受光照;光照联合硝苯地平组接受光照和0.1 mmol/L的硝苯地平;光照联合calphostin C组接受光照和100.0 nmol/L的calphostin C;光照联合PMA组接受光照和100.0 nmol/L的PMA。用乙酰氧基甲基酯Ca²⁺荧光探针标记各组培养细胞,激光扫描共焦显微镜测定各组细胞内Ca2+浓度。比较各组细胞内Ca2+浓度差异。结果 经鉴定,体外培养人RPE细胞成功。100.0、200.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量高于0.1、1.0、10.0、50.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=217.537,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L PMA处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.072）。100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量低于5.0、25.0、50.0、75.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=164.543,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.385）。蓝光照射处理后,RPE细胞的PKC活性显著升高,与未接受蓝光照射处理的RPE细胞的PKC活性比较,差异有统计学意义（t=-9.869,P＜0.05）。单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合Calphostin C、光照联合PMA组的RPE细胞内Ca²⁺浓度均高于无光照组,差异有统计学意义（F=26 764.92,P＜0.05）;光照联合PMA组RPE细胞内Ca²⁺浓度高于单纯光照、光照联合硝苯地平及光照联合calphostin C组（P＜0.05）,单纯光照组高于光照联合硝苯地平和光照联合calphostin C组（P＜0.05）。结论 蓝光照射后人RPE细胞内PKC活性增高,Ca²⁺浓度增高。硝苯地平和calphostin C均能降低蓝光照射后人RPE细胞内Ca²⁺浓度,PMA增加细胞内Ca²⁺浓度。     

蓝光所致人视网膜色素上皮细胞损伤与细胞内钙离子含量变化的关系

背景 对蓝光照射所致视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤与细胞内钙离子含量变化关系的深入研究可能对探讨视网膜变性类疾病的发生机制及防治具有重要意义. 目的 建立人RPE细胞蓝光损伤模型,探讨RPE细胞损伤与细胞内钙离子含量变化的关系.方法 将人RPE细胞系培养传代,锥虫蓝染色评估细胞活力.第4代人RPE细胞分别用(2000±500) lx蓝光照射3、6、9、12h,终止细胞培养24 h后,采用TUNEL法检测不同时间点细胞的凋亡情况,确定最适宜的光照度.然后将RPE细胞分为无光照组、光照组、硝苯地平组、光照+硝苯地平组、(-)BayK8644组、光照+(-)BayK8644组.除无光照组外,其他各组细胞均用蓝光照射6h,终止细胞培养24h,采用激光扫描共焦显微镜检测细胞内游离钙离子含量,激发光波长为488 nm,发射光波长为505 nm,每组随机选取30个细胞,扫描细胞图像,采用分析软件分析各组细胞内游离钙离子的荧光强度.结果 锥虫蓝染色证实RPE细胞的活力均在90％以上,TUNEL染色和免疫组织化学染色证实光照3h组未见细胞凋亡,而光照后6、9、12h发现不同数量的凋亡细胞.硝苯地平组RPE细胞内游离钙离子荧光强度比无光照组和光照+硝苯地平组低,差异均有统计学意义(均P=0.000);光照组、(-)BayK8644组、光照+(-)BayK8644组RPE细胞内钙离子荧光强度高于无光照组,差异均有统计学意义(均P=0.000);光照+硝苯地平组与无光照组相比较,(-)BayK8644组与光照+(-)BayK8644组比较,差异均无统计学意义(P=0.339、0.410). 结论 光照度(2000±500)1x、光照6h、终止培养24 h为建立蓝光照射致人RPE细胞损伤模型的最适合条件.蓝光照射所致的人RPE细胞损伤与细胞内游离钙离子含量增加有关.     

组织因子靶向肽对蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

背景 视网膜光损伤可造成视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤,是影响年龄相关性黄斑变性(AMD)发生和发展的重要因素之一.研究表明,组织因子(TF)在氧化损伤的RPE细胞中和AMD患者的脉络膜新生血管(CNV)中呈高表达,推测抑制TF可预防RPE细胞的损伤以及抑制CNV. 目的 观察TF靶向肽(TF-TP)对蓝光诱导的人RPE细胞损伤的保护作用. 方法 体外分离和培养人RPE细胞并分为空白对照组、蓝光照射组和TF-TP组.空白对照组细胞在常规条件下进行处理;蓝光照射组细胞用辐照强度为(4.0±0.5)mW/cm2的蓝光照射12h建立蓝光损伤细胞模型;TF-TP组先分别用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培养细胞24 h,再用蓝光照射12h.采用CCK-8法检测各组细胞的存活率;分别在普通倒置显微镜和透射电子显微镜下观察RPE细胞的形态和超微结构变化;采用Hoechst染色法检测各组细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测各组细胞中TF蛋白和相关凋亡蛋白bax和bcl-2的表达.结果 不同浓度TF-TP组间RPE细胞存活率比较,差异无统计学意义(F=2.15,P=0.11).空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞存活率分别为(100.0±0.00)％、(43.79±6.55)％和(63.45±3.57)％,150 μmol/LTF-TP组细胞存活率较蓝光照射组明显增加,差异有统计学意义(P=0.00),以150.μmol/L TF-TP为后续实验的最适浓度.光学显微镜下和透射电子显微镜下显示,蓝光照射组有较多皱缩、变形、悬浮细胞,可见细胞微绒毛数量减少,部分线粒体嵴断裂和缺失以及细胞空泡样变性,而150 μmol/L TF-TP组异常形态的细胞较少,细胞绒毛结构较完整,细胞质中空泡样结构改变和线粒体损伤改变明显减轻.空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率分别为(0.98±0.19)％、(9.98±0.82)％和(5.73±0.88)％,组间总体比较差异有统计学差异(F=206.18,P=0.00),其中150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率明显低于蓝光照射组,差异有统计学意义(P＜0.05).与空白对照组相比,蓝光照射组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量明显增加,bcl-2蛋白的相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与蓝光照射组相比,150 μmol/L TF-TP组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量均明显下降,而bcl-2蛋白的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 TF-TP预处理后可减少蓝光损伤的人RPE细胞的凋亡及增加细胞的存活率,从而对蓝光诱导的人RPE细胞损伤发挥保护作用,其作用机制可能与TF-TP抑制TF介导的bax/bcl-2凋亡通路有关.     

脂褐质荧光基团N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺在人视网膜色素上皮细胞蓝光损伤中的作用研究

目的探讨成人视网膜色素上皮（hRPE）细胞对脂褐质荧光基团N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺（A2E）的摄取及A2E在hRPE细胞蓝光损伤中的作用。方法全反式视黄醛和乙醇胺混合,体外合成A2E。体外培养hRPE细胞。将A2E加入hRPE细胞培养液中,使A2E的浓度分别为25、50、100μmoL／L。观察hRPE细胞对A2E的摄取。用蓝光（450nm）照射hRPE细胞20min,光照强度70mW／mm^2,CCK-8检测细胞活力,Hoechst 33342荧光素染色、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果全反式视黄醛（100．0mg）和乙醇胺（9．5mg）混合后生成53．8mg的A2E。吞噬A2E的hRPE细胞中能够检测到自发荧光,主要分布在细胞核周围。蓝光照射后,含有A2E的hRPE细胞活力下降,下降程度随A2E浓度增加而增强。不含A2E的hRPE细胞,经蓝光照射后,细胞活力未见明显下降。蓝光照射含有A2E的hRPE细胞,细胞核中出现浓染的碎块状荧光,流式细胞仪检测可见凋亡细胞特有的亚二倍体峰,加入25μmoL／L的A2E,光照后12、24、36及48h,细胞凋亡率分别为（12．11±2．32）％、（31．21±3．72）％、（64．23±3．53）％及（58．71±3．48）％。仅接受光照不加入A2E、不接受光照（加入或不加入A2E）的hRPE细胞凋亡率在光照后各时间点的平均值均小于5％。结论在hRPE细胞蓝光损伤的过程中,单独的光照射不会造成明显的细胞损伤或凋亡,A2E的存在是蓝光损伤的因素之一。提示在老年人中,含有较多脂褐质的hRPE细胞容易受到蓝光损伤。（中华眼科杂志．2007,43：1017-1021）     

全光谱光照对体外培养的人视网膜色素上皮细胞分泌多巴胺功能的影响

目的 探索不同光谱组成的光照射对体外培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌多巴胺功能的影响.方法 实验研究.在细胞培养箱内建立光照系统后,将体外培养的RPE细胞分别放置于无光照（对照组）、全光谱低强度光照、红绿蓝（RGB）光谱低强度光照、全光谱高强度光照、RGB光谱高强度光照环境中进行培养,连续光照24、48 h后进行检测.利用WST-1法检测各处理组之间RPE 细胞增殖率的改变,用高效液相色谱法（HPLC）检测多巴胺分泌水平.用one-way ANOVA对实验数据进行统计学分析.结果 WST-1检测结果显示：连续光照24h后,低强度光照下的全光谱光照与RGB 光谱光照对RPE细胞增殖率的影响差异无统计学意义：而在高强度光照下,全光谱光照组的RPE细胞增殖率低于RGB光谱光照组（P＜0.05）.连续光照48 h后,无论在哪种光照强度下,全光谱光照比RGB光谱光照更能抑制RPE细胞的增殖（P均＜0.01）.HPLC检测结果显示：连续光照24 h后,低强度光照下的全光谱光照与RGB光谱光照相比,对RPE细胞分泌多巴胺功能的影响差异无统计学意义;而在高强度光照下,全光谱光照组的RPE细胞分泌多巴胺的水平高于RGB光谱光照组（P＜0.01）.连续光照48 h后,同一光照强度下,全光谱光照组RPE细胞分泌多巴胺的水平高于RGB光谱光照组（P均＜0.05）.结论 光的光谱组成也是调控RPE细胞分泌多巴胺的重要因素之一,这种调控作用与光照强度和光照时间密切相关.在评估光延缓近视发生发展的作用时应该考虑光的光谱组成.     

蓝光诱导猪视网膜色素上皮细胞复制衰老的实验研究

目的观察蓝光对猪视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞复制衰老过程中衰老相关-β-半乳糖苷酶（senescence associated-beta-galactosidae，SA-β—Gal）的影响。方法将第3—6代猪RPE细胞置于自制蓝光发光二极管（light emitting diode，LED）光源下，波长450～500nm，1h／d；细胞表面水平光照强度分别为（500±100）lux、（1000±200）lux、（2000±500）lux，光照时细胞水平面的温度变化为36．5—37．5℃；对照组用黑纸完全包裹培养瓶。将各组细胞消化后接种于24孔板和96孔板培养24h，进行SA-β-Gal活性的检测和MTT法检测细胞增殖情况。结果随光照强度和传代次数增加，细胞内出现蓝色颗粒的阳性细胞数目逐渐增多，SA-β-Gal活性增高，除高强度与中强度光照组、第4代和第5代之间相比差别没有统计学意义（P〉0．05）外，其余每两组之间的差异均具有统计学意义（P〈0．05）；通过MTT法检测，细胞的增殖能力随光照强度和传代次数增加而降低，除中强度与低强度光照组相比差别没有统计学意义（P〉0．05）外，其余每两组之间的差异均具有统计学意义（P〈0．05）。结论蓝光可以诱导体外培养猪RPE细胞复制衰老，并且光照强度增加可以促进细胞复制衰老。     

蓝光对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响和机制研究

目的:研究蓝光对人视网膜色素上皮细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能机制.方法:利用35W白色冷光灯加用蓝色滤光片建立蓝光损伤体外培养的RPE细胞模型,蓝光控制波长在470~520nm,光照强度控制为2000Lx左右,光照时间控制为24~96h,利用CCK-8法检测RPE细胞的增殖能力,利用real-time PCR技术检测RPE细胞中miR-103的含量.结果:与对照组相比,蓝光照射组的RPE细胞的增殖能力减弱;蓝光照射组的RPE细胞内的miR-103含量较对照组增加;miR-103过表达时,RPE细胞的增殖能力减退,降低miR-103的表达时,细胞增殖能力增强;降低miR-103的表达能够减弱蓝光对RPE细胞增殖的抑制作用.结论:蓝光通过上调miR-103抑制RPE细胞的增殖,miR-103可能成为治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病治疗的新靶点.     

Blue light-induced apoptosis in cultured retinal pigment epithelium cells of the rat

Background: We previously demonstrated that phagosome-free retinal pigment epithelium (RPE) cells in culture can be damaged directly by blue light (wavelength 440±10 nm) as observed by electron microscope. A low intensity (1.0 mW/cm²) of light induced only swelling of mitochondria, while a high intensity (4.0 mW/cm²) induced necrosis in the RPE. The aim of the present study was to investigate what intensity of blue light could induce apoptosis in cultured phagosome-free RPE. Methods: Primary cultured RPE cells, harvested from Long-Evans rats, that contained no phagosomes were exposed to a cool blue light (wavelength 440±10 nm). After exposure, transmission electron microscopy (TEM) and TdT-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) staining were used to detect apoptosis in the RPE cells. To assess the relationship of oxidation to apoptosis by blue light, we added N-acetyl-cysteine (NAC) as a free radical scavenger and investigated its inhibitory effect on apoptosis. Results: In RPE cells exposed to blue light of 2.7 mW/cm² for 24 h, apoptotic bodies were found by TEM. In RPE cells exposed to blue light of 2.0 mW/cm² for 60 h, apoptotic bodies, nuclear condensation and nuclear segmentation were observed by TEM and some RPE cells showed positive TUNEL staining. When 30 mM of NAC was added, TUNEL staining was negative. Conclusion: Our findings demonstrate that apoptotic cell death is induced by blue light exposure in cultured RPE cells in vitro. The findings of our previous experiments and those of the present study suggest that a higher intensity of blue light could induce necrosis, and moderately intense blue light could induce non-necrotic cell death or apoptosis, in RPE cells. Furthermore, it is suggested that blue light caused cell death by a free-radical-associated mechanism. Received: 10 April 2000 Revised: 30 June 2000 Accepted: 29 August 2000     

The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells

PURPOSE: To determine whether the lipofuscin fluorophore A2E participates in blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial (RPE) cells. METHODS: Human RPE cells (ARPE-19) accumulated A2E from 10, 50, and 100 microM concentrations in media, the levels of internalized A2E ranging from less than 5 to 64 ng/10(5) cells, as assayed by quantitative high-performance liquid chromatography (HPLC). Restricted zones (0.5-mm diameter spots) of confluent cultures were subsequently exposed to 480 +/- 20-nm (blue) or 545 +/- 1-nm (green) light for 15 to 60 seconds. Phototoxicity was quantified at various periods after exposure by fluorescence staining of the nuclei of membrane-compromised cells, by TdT-dUTP terminal nick-end labeling (TUNEL) of apoptotic cells and by Annexin V labeling for phosphatidylserine exposure. RESULTS: Nonviable cells were located in blue light- exposed zones of A2E-containing RPE cells, whereas cells situated outside the illuminated areas remained viable. As shown by fluorescence labeling of the nuclei of membrane-damaged cells and by the presence of TUNEL-positive cells, the numbers of nonviable cells increased with exposure duration and as a function of the concentration of A2E used to load the cells before illumination. The numbers of blue light-induced TUNEL-positive cells also increased in advance of the increase in labeling of membrane-compromised cells, a finding that, together with Annexin V labeling, indicates an apoptotic form of cell death. Conversely, blue light- exposed RPE cells that did not contain A2E remained viable. In addition, illumination with green light resulted in the appearance of substantially fewer nonviable cells. CONCLUSIONS: These studies implicate A2E as an initiator of blue light-induced apoptosis of RPE cells.     

不同波长的蓝光对人视网膜色素上皮细胞的影响

目的：探讨不同波长的蓝光对人视网膜色素上皮细胞(RPE)的影响。

方法：将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组、447nm蓝光组、456nm蓝光组、468nm蓝光组,对照组细胞于常规条件下培养,蓝光组细胞使用光强为200Lx的OLED蓝光背光源照射72h,利用细胞活/死染色实验、CCK-8实验、Real-time PCR等方法比较不同波长的蓝光对细胞形态、细胞活性、增殖能力及视循环功能指标和炎症指标mRNA表达的影响。

结果：蓝光照射后,ARPE-19细胞的形态发生变化,细胞融合减少。蓝光波长越短,对细胞增殖抑制作用越明显,细胞内增殖标志物Ki-67 mRNA表达越少,视循环功能指标卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)、视黄醛结合蛋白(CRALBP)、视黄醛脱氢酶(RDH)、光受体视黄醇类结合蛋白(IRBP)mRNA表达下调越明显,细胞内炎症因子单核细胞趋化因子(MCP-1)、白介素-6(IL-6)mRNA表达水平上调越明显。

结论：不同波长蓝光对RPE细胞均有损害作用,且蓝光波长越短,其损害作用越大。     

蓝光诱导大鼠视网膜色素上皮细胞复制衰老

目的 探讨蓝光光照强度、时间与大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞复制衰老的关系.方法 将36只鼠龄12～14周的Wistar大鼠置于悬有波长为(450±10)nm的医用蓝光灯管的自制光照架中.随机分为4组,每组9只大鼠,1组:无光照对照组;2组:自然光照组;3组:500 lx光照组;4组:1000 lx光照组.每组按照照射时间再分为1、2、3个月组3个亚组,分别在1、2、3个月时行10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取出眼球,将右眼球行石蜡切片,苏木精伊红(HE)染色;左眼球行冰冻切片,采用衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色方法观察RPE细胞染色阳性情况.采用SPSS 11.5统计软件对结果数据进行统计学分析.结果 不同光照强度组、不同光照时间组大鼠RPE细胞SA-β-Gal染色阳性细胞个数差异有统计学意义(F=510.309,55.016;P=0.000);组间两两比较,除1组与2组之间差异无统计学意义外(P=0.154),其它各组之间差异均有统计学意义(P=0.000).在单一光照强度条件下,除1组大鼠RPE细胞SA-β-Gal染色阳性细胞个数差异无统计学意义外(P=0.897),其余各组差异均有统计学意义(P＜0.01);在单一时间条件下,各组差异均有统计学意义(P=0.000).结论 同一蓝光光照强度下,随着时间的增加大鼠视网膜RPE细胞逐渐出现复制衰老改变;同一时间条件下,随光照强度增加大鼠视网膜RPE细胞也逐渐出现复制衰老改变.     

Apoptosis of photoreceptor cells in ornithine-induced retinopathy

• Background: The intravitreal injection of ornithine produces selective damage to the retinal pigment epithelium (RPE) and results in a loss of RPE, choriocapillaris and photoreceptor cells. To elucidate the mechanism of secondary retinal atrophy, we investigated the presence of apoptotic cells in a rat model of ornithine-induced retinopathy. • Methods: At 6 and 12 h and 1, 2, 4, 7, 14 and 28 days after an intravitreal injection of L-ornithine hydrochloride in rat eyes, we removed the eyes and subjected them to histopathological examination. We detected apoptotic cells by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate digoxigenin nick end labeling (TUNEL) assay, which stains the 3′-OH ends of fragmented DNA. We used electron microscopy to detect the apoptotic cells morphologically. • Results: RPE cells were selectively damaged immediately after ornithine administration. TUNEL-positive photoreceptor cells appeared exclusively in the photoreceptor cell layer 12 h after ornithine administration. The number of TUNEL-positive cells increased throughout the 2 days following the injection, then decreased markedly. TUNEL-positive cells remained until 28 days, when the photoreceptor cells had disappeared. The ganglion cell layer, inner nuclear layer and damaged RPE cells were negative for TUNEL staining during all stages. The electron microscopic study also revealed the pyknotic nuclei of apoptotic photoreceptor cells. • Conclusion: An intravitreal injection of ornithine caused primary damage to the RPE, and subsequently some of the photoreceptor cells revealed apoptosis by TUNEL assay. These findings suggest the dysfunction of the RPE causes photoreceptor cell death according to the intrinsic program of an apoptotic mechanism. Received: 16 April 1997 Revised version received: 7 July 1997 Accepted: 18 July 1997     

Role of apoptosis in the cytotoxic effect mediated by daunorubicin in cultured human retinal pigment epithelial cells.

To investigate whether apoptosis is involved in the therapeutic effect of daunorubicin on proliferative vitreoretinopathy (PVR), cultured human retinal pigment epithelial cells (RPE) were exposed to a cytotoxic dose of 180 microg/l daunorubicin. After 12-hour treatment with the drug and 24-hour prolonged post-incubation in the drug-free medium, progressive condensation, shrinkage of cytoplasm and nucleus, and fragmented nuclei were identified by light and electron microscopy. TUNEL assay showed the characteristic apoptotic patterns of circumscribed clumps and sometimes even dark masses in nuclei. The expression of bax protein was enhanced, and the integral optical density values for immunocytochemical expression of bax protein increased by 22.0% in the drug-treated group (P < 0.05). The results demonstrated the pivotal role of apoptotic mechanism in the cytotoxic effect mediated by daunorubicin, and confirmed the relationship between the drug-induced apoptosis and overexpression of bax protein. It suggested that the upregulation of bax mediated by daunorubicin could lead to the onset of apoptosis, and therefore contribute to its therapeutic mechanisms for the treatment of PVR.     

手机光照刺激对视网膜色素上皮细胞的影响

目的：观察手机光照刺激体外培养人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium; RPE)后形态及B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl2-Associated X(Bax)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)的mRNA表达变化。

方法：将体外培养的人RPE细胞随机分成4组,根据RPE细胞光照时间长短分为照射3h光照组、6h光照组、12h光照组和0h光照组。在特制的培养箱内,将智能手机屏幕开到最大亮度(200±20Lx)做为光源,持续静音情况下循环播放彩色图片。然后应用苏木精-伊红(HE)染色法,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法观察各实验组RPE细胞形态学改变,并运用聚合酶链反应(PCR)技术检测各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达变化。

结果：用HE染色、TUNEL染色、MTT法观察发现各光照组RPE细胞形态学无明显改变,差异均无统计学意义(P>0.05)。应用PCR技术检测发现RPE细胞在光照刺激3h光照组和6h光照组,细胞内的Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达与0h光照组的差异均无统计学意义(P>0.05)。但随着光照时间持续延长(12h),细胞内的Bcl-2表达下调,Bax、Caspase-3表达水平均上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：手机屏幕等作为人造光源在长期持续高亮度照射下会引起体外培养人视网膜色素上皮细胞的损伤。