C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎的冷冻保种技术.方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测.结果 体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的平均复苏率是67.78％,移植产仔率是21.31％,后代的阳性率是23.08％;体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,平均复苏率是63.33％,移植产仔率是15.78％,后代的阳性率是33.33％.结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法.     

Dicer 1转基因小鼠模型的建立

目的 建立Dicer1转基因小鼠模型.方法 构建pcDNA3.I-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导人BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内.出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基冈表达.结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern榆测6只均为阳性.对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达.对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常.结论 成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础.     

STK15转基因小鼠模型的建立

STK15基因是丝/苏氨酸激酶家族成员之一，其扩增和高表达能引起中心体复制扩增，染色体不稳定性增加，最终导致细胞的恶性转化，从而诱发恶性肿瘤。而且，STK15基因在多种恶性肿瘤组织中都具有高表达。目前，研究者们都是通过取人体不同部位的肿瘤组织来研究STK15基因与恶性肿瘤发生发展的关系，本次实验首次以建立STK15转基因小鼠模型，来进一步研究STK15基因与恶性肿瘤的关系，为今后的基因诊治提供理论基础。实验方法是首先提取人胚肺细胞总RNA作为模版，根据GenBank中STK15基因序列设计一对引物，用RT-PCR技术扩增出1200bp的STK15基因片段，克隆到pTZ57R/T载体，通过测序证实序列的正确性。用BamH1和XbaI双酶切载体pcDNA3.1和pTZ57R/T载体-STK15，然后回收、连接pcDNA3.1-STK15、转化、鉴定，从而成功构建了pcDNA3.1-STK15表达载体。然后对小鼠进行超排获得其原核期胚胎，应用显微注射法进行转基因操作，结果是注射成功率77%（701/907），移植鼠共30只，新生小鼠为106只，PCR检测转基因阳性为3只，经过Southern杂交检测有1只转基因阳性鼠，从而建立了转STK15的转基因小鼠模型。通过建立STK15肿瘤动物模型，找出与人类肿瘤相近的病理生理变化以及控制这些变化的遗传基础，为今后所有的恶性肿瘤的基因诊治提供坚实、有力的理论依据。     

抗菌肽转基因小鼠模型的建立

目的:制备抗菌肽转基因小鼠模型.方法:显微注射pcDNA3.1-PCMG到FVB小鼠受精卵雄原核中,注射存活胚胎移植到假孕母鼠输卵管内发育产生子代小鼠.结果:在生出的119只小鼠中经PCR和Southern blot检测到7只阳性.结论:通过显微注射法使外源基因pcDNA3.1-PCMG在FVB小鼠基因组中得到整合,为抗菌肽抗菌谱的研究,抗病毒、抗肿瘤机制的研究提供有价值的抗病动物模型.     

人胰岛素转基因小鼠模型的建立

目的:建立人胰岛素的转基因小鼠模型.方法:通过原核显微注射法,把外源基因pEF1α-mINS注射入FVB种小鼠受精卵,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠获得子代小鼠.结果:移植注射胚胎204枚给38只假孕小鼠共出生108只后代鼠,经PCR和Southern blot检测到5只阳性小鼠.结论:通过显微注射法使外源基因pEF1α-mINS在小鼠基因组中得到整合,建立了人胰岛素的转基因小鼠模型.     

HBV—C转基因小鼠快速胚胎冷冻方法的建立

目的 建立用于转基因小鼠种质保存的快速胚胎冷冻方法。方法 用乙二醇作为抗冻保护剂,对携带HBV—C基因的转基因小鼠模型进行了玻璃化胚胎冷冻保存的研究。结果 发现含体积分数30％乙二醇的冷冻液可达到最佳的冷冻效果,有81．54％的冷冻胚胎在体外可进一步发育,其中69．81％达到孵化阶段,比较不同发育阶段的胚胎的冷冻效果发现,致密桑椹胚解冻后的孵化率显著高于囊胚。不同的装管方法对胚胎的回改率也有影响,五段法的胚胎回收率显著高于二段法。将解冻后形态正常的胚胎82枚移植给8只假孕母鼠,5只怀孕,怀孕率为62．5％,产下28只小鼠,产仔率为54．9％。结论 一步法玻璃化冷冻方法可用于转基因小鼠的种质保存。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

HBV转基因小鼠胚胎玻璃化冷冻保存研究

目的研究OPS法对不同基因型的HBV转基因小鼠胚胎玻璃化冷冻的效果，为建立转基因小鼠胚胎库奠定基础。方法采用乙二醇作为冷冻保护剂，以野生型P21^ / 小鼠为对照，用OPS法对P21^HBsAg／HBsAg及P21^HBx/HBx两种HBV转基因小鼠3．5d的胚胎进行玻璃化冷冻，并比较不同基因型小鼠的超数排卵数，胚胎的复苏率及发育率。结果P21^ / 、P21^HBsAg／HBsAg及P21^HBx/HBx小鼠平均超排数分别为27．89、15．56、9．14枚；复苏率分别为88．7％、81．1％、80．3％；发育率分别为82．6％、79．4％、56．6％。结果表明HBV转基因小鼠的超排数明显低于野生型小鼠的超排数，解冻后三种小鼠的胚胎复苏率之间无显著差别，而解冻后发育率，P21^HBx／HBx小鼠要明显低于其它两种小鼠。结论超排数、胚胎复苏率及解冻后发育率受小鼠的基因型影响。     

C57-ras癌症转基因小鼠模型冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型的冷冻保种技术。 方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测。结果 冷冻体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的复苏率是67.78%?.08,移植产仔率是21.31%?.09,后代的阳性率是23.08%?.14;冷冻体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,复苏率是63.33%?.03,移植产仔率是15.56%?.04,后代的阳性率是33.33%。 结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法。     

转基因技术和冷冻胚胎技术的实验数据建立

目的 建立一系列转基因技术和冷冻胚胎技术的实验室数据库。方法 a)显微注射法注射1864个1-细胞期受精卵,注射后存活的1283个胚胎进行胚胎移植,获得20只阳性转基因动物。b)设计不同单位的激素剂量(PMSG HCG)获得每个品系的小鼠平均排卵量和最佳激素剂量。e)采用常规法和玻璃化法进行胚胎冷冻保存,并就囊胚和桑椹胚两个不同时期进行复苏成活率的比较。结果 和讨论a)建立转基因技术和胚胎冷冻保存的实验数据库(随着实验技术的不断提高还将不断的完善)。胚胎显微注射存活率为68．8％;转基因阳性鼠出生率为16．16％;基因整合率为1．56％。b)激素诱发5种品系小鼠的平均超排卵数为：C57BL/6J(日本)15．6;C57BL/6J 19．6;BDF1(日本)21．4;C3H(日本)14．8;KM 30。e)胚胎冷冻保存复苏,出生幼子存活率为30％～31％。     

GFP小鼠对三维体外着床模型的定位及验证

目的 本研究将基于已经建立的三维小鼠体外胚胎着床模型,运用绿色荧光（GFP）小鼠胚胎替代ICR小鼠胚胎,验证三维着床模型的可行性。方法 将孕第4天GFP小鼠及ICR小鼠囊胚与ICR小鼠的内膜组织进行体外共培养。观察两组胚胎黏着率的差异。对GFP小鼠囊胚组通过荧光显微镜进行观察,共培养后进行组织学研究。结果 GFP小鼠囊胚及ICR小鼠囊胚与ICR小鼠子宫内膜组织共培养28h后的胚胎黏着率分别为46.6%及54.8%;两组黏着率之间差异无统计学意义（P=0.364）。GFP小鼠囊胚与ICR小鼠子宫内膜组织共培养28h及40h后均可在荧光显微镜下见到胚胎,组织学研究证实GFP小鼠囊胚可以黏着于ICR小鼠子宫内膜。结论 三维着床模型确实能够实现不同来源小鼠胚胎的黏附着床。运用GFP小鼠胚胎还发现了胚胎与子宫内膜组织之间存在着信息及分子联系。     

绿色荧光蛋白转基因雄鼠肝细胞移植重建雌鼠的造血功能研究

目的 用荧光雄鼠的肝细胞回输半致死量射线照射的C57BL雌鼠,观察肝细胞是否有重建造血功能的作用.方法 用荧光雄鼠的肝细胞回输给半致死量射线照射的C57BL雌鼠,在移植后18、39和53 d剪鼠尾,采血并用CD4-PE和CD8-PE标记,再用氯化铵溶血,上流式细胞仪检测.移植87 d后杀鼠取骨髓用荧光原位杂交检测Y染色体阳性细胞的百分比,并取外周血、脾细胞、肝细胞和骨髓细胞检测绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞的百分比.结果 回输肝细胞的雌鼠外周血中检测到GFP阳性细胞,同时检测到一部分GFP阳性细胞转化成了CD4+或CD8+T细胞,外周血中GFP阳性细胞的比例与荧光原位杂交分析的骨髓中的Y染色体阳性比例呈正相关.同时在鼠的脾细胞、肝细胞和骨髓细胞中都检测到了GFP阳性细胞.而脾细胞中检测到的GFP阳性细胞百分比高于其他细胞,相比有统计学意义(P =0.003).结论 成年鼠肝细胞含有一定量的造血干细胞,在移植鼠体内存活并分布在多脏器,重建了雌鼠的造血功能.     

四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白转基因斑马鱼模型建立

目的 探索tet-on四环素诱导表达系统在斑马鱼体内应用策略与技术路线,构建四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼,为条件型功能基因研究及组织特异转基因斑马鱼疾病模型的建立奠定基础。方法 构建肝脏特异启动子fabp10启动rtTA蛋白表达的重组质粒pfabp10-rtTA,联合pTRE-Tight-BI-AcGFP1质粒转染HeLa细胞后给予doxycycline诱导,Western blot法验证;pfabp10-rtTA联合pTRE-Tight-BI-AcGFP1质粒注射斑马鱼1-细胞期受精卵后,30礸/ml doxycycline诱导,荧光筛选稳定整合个体。结果 共转染pfabp10-rtTA与 pTRE-Tight-BI-AcGFP1的HeLa细胞经1礸/ml浓度doxycycline诱导培养液诱导, GFP表达量显著高于不加doxycycline培养液对照组;筛选获得的稳定整合斑马鱼幼鱼,在浓度为30礸/ml doxycycline条件下,肝脏明显有绿色荧光表达,对照组幼鱼肝脏位置未有明显绿色荧光。结论Tet-On四环素诱导表达系统可用于建立四环素调控斑马鱼肝脏特异表达外源基因;利用该技术可建立诱导肝脏表达GFP建立转基因斑马鱼品系,为建立条件型转基因斑马鱼疾病模型、探索肝脏器官发生发育等研究提供良好的模式动物工具     

GFP在绿色荧光裸鼠不同组织中的表达及分析

摘要：目的：研究外源绿色荧光蛋白（Green Fluorescence Protein,简称GFP）基因在BALB/c绿色荧光裸鼠主要器官组织中的表达及其差异。方法：小动物成像系统以及RT-PCR方法检测GFP的组织分布以及荧光表达水平情况。结果：经活体荧光影像系统观察及PCR方法检测发现GFP可以在裸鼠多个器官组织中表达,其中在胰腺、心脏、全脑、皮肤、睾丸中表达量较高。结论：外源绿色荧光蛋白可以在模型动物体内成功表达且稳定遗传,其中在胰腺组织中高表达。     

以绿色荧光蛋白为报告基因的酿酒酵母表达载体的构建

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的酿酒酵母表达载体。方法：利用通用载体质粒融合系统（UPS），首先将GFP片断连入donor载体，随后在Cre酶作用下与acceptor载体融合，获得了带有GFP片断的酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）表达载体。结果：成功构建了以GFP为报告基因的酿酒酵母载体，并在酵母中得到表达。结论：GFP是一种理想的报告基因。同时，利用UPS能够高效、简便地进行酵母表达载体的构建。     

利用GFP/A549建立人NSCLC裸鼠原位种植转移模型

目的：利用人肺腺癌细胞株GFP/A549建立非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)转移模型。方法：将表达GFP的质粒pRNAT U6.1/Neo转染人肺腺癌细胞A549，G418筛选获得稳定表达GFP细胞，对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死。HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。利用KODAK IS2000MM系统检测肿瘤播散情况。结果:获得了稳定表达GFP的转染后细胞；细胞的体外和体内生长未受转染的影响。裸鼠原位种植GFP/A549，利用KODAK IS2000MM确认4只有肝转移，9只有脑转移。HE染色、免疫组化确认4只有肝转移，11只有脑转移，与KODAK IS2000MM检测结果对比差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:GFP标记人肺腺癌细胞A549原位种植法能更简便的建立NSCLC转移模型；KODAK IS2000MM能够非侵入性和无创性检测肿瘤转移。     

GFP-HPVl8 E2删除突变体融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人乳头瘤病毒18型早期蛋白2(HPV18 E2)删除突变体N端(TAD)、C端(DBD)与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,为研究HPV18 E2基因与宫颈癌发生的关系提供实验基础.方法 用PCR扩增HPV18 E2 TAD、DBD基因序列,用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pEGFP-Cl载体与TAD、DBD基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定.结果 阳性克隆质粒经双酶切后,琼脂糖凝胶电泳可见4.7 kb、618 bp和243 bp附近的片段.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒分别含有618 bp与243 bp的目的基因片段,无碱基错配和移码突变,读码框完全正确.结论 成功地构建了GFP-HPV18 E2删除突变体融合蛋白真核表达载体pEGFP-C1/TAD与pEGFP-C1/DBD.     

不同转染方式对GFP表达质粒在小鼠肝脏的表达影响

目的 研究经流体力学注射、门静脉和腹腔常规注射3种不同途径注射GFP表达质粒后,目的基因在小鼠肝脏的表达情况及其转基因效率.方法 将裸质粒或脂质体包裹的质粒DNA分别应用流体力学注射、门静脉及腹腔常规注射法注入同种异体小鼠体内,48h后分别取血和肝组织,通过荧光显微镜观察3种转染途径对质粒DNA在小鼠肝脏的表达影响.结果 流体力学注射组及门静脉常规注射组均可见大量绿色荧光蛋白表达,两组的荧光表达量差异无统计学意义(P>0.05),腹腔注射组小鼠的肝脏仅见少量的绿色荧光表达,但3组内脂质体/质粒DNA复合物组绿色荧光表达量均明显高于裸质粒组(P<0.05).结论 应用流体力学注射及门静脉常规注射脂质体/质粒DNA复合物途径,目的基因均在小鼠肝脏高效表达,两种途径无明显差异,流体力学注射可广泛用于肝靶向性的活体基因转染.     

小鼠胚胎冷冻保存技术研究进展

随着生物工程小鼠的大量出现，建立一种完善的胚胎冷冻保存技术体系保存这些资源至关重要。自20世纪70年代对小鼠胚胎冻存成功以来，胚胎冷冻技术已得到飞速发展。目前研究焦点在于寻找更好的冷冻保护剂和简化操作方法等方面。本文对小鼠胚胎冷冻保存技术的冷冻保护剂、冷冻方法及所涉及的主要原理和目前的研究进展进行了评述。