间充质干细胞成骨分化过程中骨形态发生蛋白的作用研究

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族的成员,在胚胎发育和器官形成方面具有多种功能,尤其在骨发育和骨形成中起着至关重要作用。研究者通过多种基因敲除模型证明BMP信号通路中断会导致骨及骨外组织发育的异常,并阐明了与此相关的机制。BMP信号通路不但自身具有较复杂的调控机制,而且与其他信号通路相互联系、相互影响,从而组成了一个更复杂而精细的调控网络,共同参与成骨细胞分化及骨形成的调节。其中,BMP-2、BMP-6、BMP-7以及BMP-9等均可在体内和体外促进间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向成骨细胞分化。这种显著的成骨效应使得BMP在治疗骨缺损及骨发育异常方面具有光明的前景。     

骨形态发生蛋白-2诱导成骨过程中血管内皮生长因子的表达及分析

近年来，骨形态发生蛋白（bone mophorgenetic protein，BMP）作为一种有价值的生长因子越来越受到人们的重视，然而其诱导成骨的机制目前却并不完全清楚。最近的研究发现，血管内皮生长因子（VEGF）在骨形成和修复过程中发挥着重要的调节作用，多种生长因子可促进VEGF的分泌，如转化生长因子-β1（TGF-β1）、成纤维细胞生长因子（FGF）、成骨蛋白-1（OP-1）等，从而提示VEGF可能是某些骨生长因子的中介因子。     

TGF-β超家族分子在软骨内成骨中的作用

转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族分子包括TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)等30多个成员。它们在软骨组织分布广泛，在软骨内成骨的各个阶段皆具有重要功能。TGF-β分子可以促进软骨细胞细胞外基质合成，抑制软骨细胞的肥大分化和矿化。BMP分子可以诱导间充质细胞分化为软骨细胞，促进合成细胞外基质，抑制软骨细胞的终末分化。另外，TGF-β、BMP分子可以和IHH-PTHrP信号通路相互作用协调软骨细胞分化，BMP和FGF分子相互拮抗控制软骨细胞增殖、IHH分子表达和软骨细胞的终末分化。但是，TGF-β超家族分子在软骨内成骨中的详细作用机制仍需进一步的研究来阐明。     

骨形态发生蛋白信号在软骨细胞的传导

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成员，在骨与软骨生长发育的各种局部调节因子中，它们可能是最重要的软骨细胞成熟与分化的调节因子。笔者主要对BMP信号系统中BMP-Smads通路在软骨细胞不同水平的传导及作用机制进行综述。     

骨形态发生蛋白的生物学作用

1965年,美国学者Urist首次报道成功应用牛脱钙骨基质植入肌肉内诱导间充质细胞分化成新的软骨和骨,并预言在脱钙骨基质中含有一种特殊蛋白质称骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Pro-tein,BMP)。经过近20年的研究和探索,Urist于1982年首先从牛骨中成功提纯出BMP,并制定了一整套BMP的提取方法,从而在理论上证实了骨形成的诱导学说。1988年,Wocney报道了BMP1、BMP2a、BMP2b和BMP3的cDNA结构及其在真核细胞和原核细胞中的表达,揭开了BMPn的基因克隆化研究。同年,樊代明成功地制备出抗BMP活性位点的单克隆抗体(BMP—McAb),为更精确地了解BMP的理化特性、生物学活性、骨诱导机理及其在人体细胞内的合成与分泌等提供了有效工具。     

骨形成蛋白2重组腺病毒的构建及异位诱导成骨的研究

目的 构建骨形成蛋白2（BMP2）重组腺病毒,探讨其诱导成骨的作用。方法 将BMP2基因克隆到转移载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP2重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒。然后,用其进行裸鼠异位诱导成骨。结果经过PCR及酶切鉴定,证明获得了BMP2转移质粒pAdTrack-BMP2和BMP2腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。组织学观察显示,2周时局部大量纤维样细胞聚集,软骨细胞分化;5周时骨小梁形成,软骨细胞已退化。结论 BMP2组腺病毒的构建及其异位诱导成骨的功能为其在BMP2基因治疗中的应用奠定了良好的基础。     

老年大鼠骨缺损的骨形态发生蛋白-2的基因治疗

目的 通过组织工程和基因工程结合的方法从种子细胞、生长因子、细胞支架三方面满足老年机体骨修复的需要，为这些方法在老年机体的应用提供参考。方法 体外分离、扩增、骨形态发生蛋白-2（BMP2）基因修饰MSCs，检测细胞上清液中BMP2的表达；通过检测成骨细胞标志性蛋白如碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（COL Ⅰ-α1）、骨涎蛋白（BSP）、骨桥素（OPN）的表达观察老年大鼠MSCs的成骨分化能力；检测BMP2基因修饰的MSCs与磷酸三钙（TCP）复合物在裸鼠体内的异位成骨能力；将BMP2基因修饰的MSCs／TCP植入老年大鼠骨缺损部位，修复自体股骨6mm节段性骨缺损。结果 BMP2基因修饰的MSCs可以有效分泌BMP2，诱导后第7天有ALP、COLⅠ-α1、OPN、BSP的明显表达，并可诱导裸鼠体内异位成骨。放射学及组织学检测证明BMP2转染的MSCs与TCP载体复合后可成功修复老年大鼠股骨节段性缺损。结论 BMP2基因修饰的老年MSCs可以恢复成骨分化能力，在体内可以成功修复老年大鼠股骨节段性骨缺损，组织工程和基因工程方法可能成为治疗老年性骨骼疾病的新途径。     

骨形态发生蛋白9促进小鼠颅骨间充质祖细胞成骨分化的实验研究

目的：研究腺病毒载体介导的骨形态发生蛋白9（BMP-9）对小鼠永生化颅骨间充质祖细胞（iCAL）成骨分化的诱导作用。方法以iCAL为模型,设置绿色荧光蛋白（ GFP）对照组和BMP-9诱导组,于诱导后的3、5、7 d对早期成骨分化指标碱性磷酸酶（ ALP）活性进行定性和定量检测;于诱导后的14 d通过茜素红染色检测骨钙结节形成;荧光定量PCR法和Western印迹检测成骨细胞分化标志基因Runx2、OCN表达情况。结果 BMP-9诱导组细胞内ALP活性高于GFP对照组,差异具有统计学意义（P＜0．05）;BMP-9诱导组形成较多的钙盐结节沉积;荧光定量PCR检测结果显示诱导组中Runx2、OCN的mRNA表达量明显上调,差异具有统计学意义（P＜0．05）,Western印迹检测3 d Runx2蛋白表达上调,5 d OCN蛋白表达上调。结论 BMP-9促进小鼠永生化iCAL成骨分化。     

骨形态发生蛋白诱导成骨过程中转化生长因子β1的mRNA表达

目的：通过观察骨形态发生蛋白（bone morphogenesic protein,BMP)诱导成骨过程中转化生长因子β１（transforming growth factor β,TGF-β1)的基因表达情况,探讨诱导成骨过程中是否有其他生长因子参与,进一步阐述ＢＭＰ诱导成骨的机制,方法：采用日本大耳白兔１６只,手术造成左尺骨中上段１２mm骨缺损实验模型,随机分为实验组及对照组,实验组缺损内植入以牛松质骨基质颗粒（经脱钙,脱蛋白及高温,高压处理）为载体的牛骨形态发生蛋白（bBMP)10mg,对照组缺损内仅植入牛松质骨载体,分别于术后第３,７,１４,２１天取两组缺损内组织冰冻切片,采用原位杂交方法,检测组织中ＴＧＦ－β１的mRNA表达并作图像分析,结果：实验组和对照组早期各时相均有ＴＧＦ－β１的mRNA表达并作图像分析,结果：实验组和对照组早期各时相均有ＴＧＦ－β１的mRNA表达,表达细胞主要为间充质的细胞,。软骨细胞和成骨细胞,表现为在这些细胞胸装内出现此蓝色颗粒,颗粒的大小及颜色的深浅表示基因表达信号的强弱,实验组ＴＧＦ－β１的mRNA表达术在１４天达高峰,此时正为软骨细胞和成骨细胞大量形成期,对照组各时相ＴＧＦ－β１的mRNA表达信号民均明显弱于同期实验组,图像分析结果采用方差分析,显示两组间差异有显著性意义,结论：ＴＧＦ－β１的mRNA表达在ＢＭＰ诱导成骨中明显增强,ＢＭＰ具有促进TGF-β1合成及分泌的作用,ＢＭＰ的诱导成骨需要以ＴＧＦ－β为代表的其他生长因子的协同与参怀,ＢＭＰ的诱导成骨是一个由多因子协同和参与的复杂的生物过程。     

降解材料隔膜引导性骨再生的实验研究

目的 观察长管骨降解材料隔膜引导性骨再生现象,探讨其作用机制。方法 采用胶原隔膜、制做长管骨引导性骨再生动物模型。术后进行Ｘ线观察;不同时期处死取材,进行组织学观察及碱性成纤维细胞生长因子,转移生长因子－β（ＴＧＦ－β）,骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）免疫组化染色,并对３种骨诱导因子的含量进行测量。结果 （１）胶原隔膜能够成功引导骨再生、１２周时修复骨缺损。（２）术后１周时,胶原隔膜即在骨缺损处形成密闭     

骨形成蛋白与磷酸钙复合材料对椎体骨缺损的修复作用

 目的 探讨骨形成蛋白(BMP)与磷酸钙骨水泥(CPC) 复合材料在椎体骨缺损的修复能力及其作为椎体成形术的生物活性灌注剂可能性.方法 将CPC作为BMP的载体复合成为CPC/BMP生物活性人工骨材料.在16只羊腰1～ 3椎体侧前方制成约1 cm×1 cm×1 cm的骨缺损,分别植入CPC/MBP生物活性人工骨材料和CPC.术后3、6个月行X线、组织学检查和电镜扫描.观察新骨形成和材料降解情况.[ HTH〗结果 术后所有的动物成活.CPC/BMP植入3个月时植入材料与受区骨间出现软骨细胞向成骨分化,新骨组织长入材料并与材料紧密结合.6个月时新骨多为板层骨,植入材料范围缩小,材料大量溶解,出现较大的空隙.BMP与CPC复合有效地促进了新骨的形成和新骨的钙化,同时也加速CPC材料的降解.而CPC材料降解速度缓慢,新骨形成量少,仅在材料的表面.结论 CPC是BMP理想的载体,CPC/BMP生物活性人工骨材料椎体骨缺损有较强的修复能力,可作为椎体成形术的生物活性灌注剂.     

Bone morphogenetic proteins and tendon repair

Bone repair is controlled by signalling proteins as well as mechanical stimuli. Bone morphogenetic proteins (BMPs), implanted or injected into a fracture site, can enhance bone healing, and so can mechanical stimulation. Possibly, mechanical signals can alter BMP expression, but furthermore, tissue differentiation initiated by an implanted BMP could be guided into the required direction by mechanical signals. Mechanical stimulation also has profound effects on tendon repair. We studied the effects of 3 different BMPs in a rat tendon repair model. One of these, osteogenic protein 1 (OP-1) induced bone formation in the tendon at the expense of mechanical strength and thus overrode any mechanical control system. On the other hand, cartilage derived morphogenetic protein 1 and 2 (CDMP-1 and -2) both made the tendon callus bigger and stronger at an early time point.     

rhBMP-2对兔下颌骨牵引成骨的影响及BMP-4的表达

 目的 通过观察兔下颌骨牵引成骨过程,探讨不同剂量重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)在不同时间对成骨区新骨生成的影响及其BMP-4的表达.方法 日本大耳白兔48只行单侧下颌骨牵引,分别将不同剂量 rhBMP-2胶原复合物植入骨切开处,间歇期5 d,牵引速度0.4 mm/d,2/d,共牵引5 d.用免疫组化方法观察牵引成骨新骨生成区BMP-4在固定1、7、14、28 d时的表达及新骨生成情况.结果 随着稳定期延长,牵引间隙内新骨逐渐生成.1.5 mg BMP-2剂量组的新骨生成优于对照组,3 mg BMP-2剂量组的新骨组织在同一时期内最多.BMP-4主要定位于成骨细胞和软骨细胞中,表达高峰出现在稳定期的1、7 d,此后逐渐下降,第28天阳性表达微弱.结论 rhBMP-2能促进牵引成骨,并具有浓度依赖性,BMP-4可能在牵引成骨的早期发挥重要作用.     

髋关节表面置换术后股骨近端及髋臼骨密度初步研究

目的 评价髋关节表面置换术（RSAH）对股骨近端及髋臼侧骨量的影响.方法 选择符合入组标准的单侧RSAH病人26例,于术后1年行髋关节手术侧及健侧的股骨近端和髋臼的骨密度检查,参考Taylor及Wilkinson方法分别将术后股骨近端及髋臼分为6个（1～6区）和3个（A1～A3）兴趣区,测量各兴趣区骨密度,用t检验对各区手术侧与健侧骨密度值进行比较.结果 手术侧的股骨近端5、6区的骨密度值大于健侧的,两者差异有统计学意义（P＜0.05）;1、2、3、4区的骨密度值在手术侧与健侧间的差异无统计学意义（P＞0.05）.髋臼侧全部区域中髋臼头侧（A1区）密度值,手术侧小于健侧,两者差异有统计学意义（P＜0.05）;手术侧与健侧的髋臼内侧及尾侧（A2、A3区）的骨密度比较,其差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 关节表面置换术后股骨近端骨量可以得到有效保存和恢复,而髋臼侧骨质有丢失可能.     

Ossification of the ligamentum flavum associated with osteoblastoma: a report of three cases

We report three cases of spinal osteoblastoma with ossification of the ligamentum flavum (OLF) adjacent to the tumor. The patients in this report, all young adults, had no symptoms except for back pain. Computed tomography (CT) demonstrated a typical radiolucent nidus in the spinal pedicle/lamina with a dense sclerotic rim. In addition, ectopic bone formation at the insertion point of the ligamentum flavum adjacent to the tumor was clearly illustrated. Magnetic resonance imaging (MRI) revealed the tumor and surrounding inflammatory responses, but OLF was not detected clearly. Histological examination revealed endochondral ossification of the ligamentum flavum that is quite unusual for normal young adults. Immunohistochemical assays in one case demonstrated that bone morphogenetic protein (BMP)-2/4 was expressed in the osteoblastic tumor cells. This case raises the possibility that BMPs secreted from the tumor cells triggered ectopic ossification in the spinal ligament. Received: 7 August 2000 Revision requested: 15 November 2000 Revision received: 15 December 2000 Accepted: 19 December 2000     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

血红素加氧酶-1在间充质干细胞免疫抑制效应中的作用

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）中血红素加氧酶-1（HO-1）的表达及其对MSCs免疫抑制效应的影响。方法：从人骨髓中分离培养MSCs,流式细胞术检测其纯度。尼龙棉柱法分离外周血T淋巴细胞,用植物血凝素（PHA）刺激后,将其与MSCs共孵育,再加入HO-1特异性抑制剂Znpp,MTF法测定T细胞的增殖并计算增殖转化抑制率。RT—PCR法检测MSCs中HO-1mRNA的表达。结果：人MSCs中有HO-1mRNA的表达,MSCs可使异体T细胞增殖转化受抑,加入Znpp可使MSC对T淋巴细胞免疫抑制效应减弱。结论：HO-1在MSCs对T淋巴细胞的免疫抑制效应中可能发挥重要的作用。     

伴放线放线杆菌在高血糖大鼠牙周炎致病作用的实验研究

目的探讨伴放线放线杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa）增强牙周组织炎症反应及促进细胞凋亡的内在联系。方法制备高血糖大鼠动物模型,并以血糖正常大鼠作为对照,口内接种Aa,并以抗生素及caspase-3抑制药治疗,通过检测牙龈Aa抗体、牙龈组织凋亡、静脉血炎细胞变化分析Aa在牙周病,尤其是高血糖环境下发病过程的作用。结果Aa接种于高血糖或正常血糖大鼠口内后,均可以引起宿主局部炎症反应,牙龈Aa抗体均升高,高血糖组明显高于血糖正常组（P〈0．01）,牙龈凋亡水平也具有同样的表现。从静脉血观察炎细胞改变发现两组间无显著差异（P〉0．05）,仅粒细胞百分比升高（P〈0．05）。此外,通过应用抗生素及caspas-3抑制药可以缓解牙周炎症及凋亡水平。结论高血糖大鼠接种Aa后牙周炎症明显加重,其机制与宿主局部炎症反应增强,以及细胞凋亡增多相关。另外抗生素治疗能够显著改善高血糖大鼠牙周炎症反应,但不能有效减少凋亡。     

骨髓干细胞动员对创伤失血犬免疫功能的调节作用

目的观察创伤失血犬自体骨髓干细胞动员后外周血干细胞、免疫细胞亚群和细胞因子含量动态变化,为干细胞治疗战创伤提供依据。方法健康比格犬10只,采用手术方法切除左侧肾后,经肾动脉放血至血压60mmHg并维持30min。实验组（n=5）皮下注射GM-CSF5μg/kg,隔日1次,连续3次,对照组（n=5）同步注射等量生理盐水,分别于0、2、4、6、8、10d采集外周血,计数白细胞总数、淋巴细胞和中性粒细胞比例,测定CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD56＋、CD34＋、CD133＋细胞比例和血清TNF-α、IL-1、IL-2含量。结果与0d比较,实验和对照犬在创伤失血后白细胞总数、中性粒细胞比例均逐渐升高,第4～6d达到高峰（P〈0.05）,然后逐渐下降,但实验组高于对照组（P〈0.05）;两组淋巴细胞的比例均下降（P〈0.05）,但实验组高于对照组（P〈0.05）;CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD56＋细胞的比例下降（P〈0.05）,到第4～6d达到最低（P〈0.05）,随后逐渐升高,至第10d时接近正常,其中实验组高于对照组（P〈0.05）;两组CD34＋、CD133＋细胞比例均逐渐升高,至第2～4d达到高峰（P〈0.05）,随后逐渐下降,但实验组在整个实验过程中均高于对照组（P〈0.05）;实验组血浆TNF-α、IL-1、IL-2的含量均逐渐升高,至第6d达到高峰（P〈0.05）,随后下降至第10d时接近正常。结论骨髓干细胞动员可提高创伤失血犬外周血免疫亚群细胞比例和细胞因子含量,提示具有保护创伤失血犬免疫功能的作用,但也有促进炎症反应的作用。