IFNγ调控人肺癌A549细胞Fas／FasL表达对T淋巴细胞生长的影响

为探讨IFNγ调控有肺癌细胞Fas/FasL表达对T细胞生长的影响，分别采用FACScan,RT-PCR方法检测Fas/FasL蛋白质及mRNA表达；以荧光染色及FACScan法观察细胞凋亡；用苔酚兰排除实验分析细胞生长。结果表明，人肺癌细胞A549及T－细胞系（Jurkat)均有Fas及FasL表达；IFNγ可引起A549Fas表达上调，且与剂量相关，并增加了A549细胞凋亡诱导的敏感性；A549细胞与Jurkat细胞共培养实验证明：人A549细胞通过Fas/FasL介导导致Jurkat细胞生长抑制及凋亡诱导；IFNγ处理A549细胞后，减少了其对Jurkat细胞的生长抑制。上述结果提示：Fas/FasL途径介导了A549细胞与Jurkat细胞之间的凋亡，IFNγ通过对人肺癌细胞Fas/FasL系统表达调控，使A549细胞自身对凋亡诱导的敏感性增加，并对T细胞生长的抑制作用减弱，提示IFNγ在防止肿瘤细胞逃避免疫监控有一定作用。     

CpG-ODN下调HeLa细胞功能性Fas配体的表达

为观察CpG-ODN对宫颈癌细胞系HeLa细胞Fas配体(FasL)表达水平的影响,探讨其对由HeLa细胞Fas-FasL途径诱导的淋巴细胞凋亡作用。采用实时荧光RT-PCR方法检测HeLa细胞、正常宫颈上皮细胞中FasL和Jurkat T淋巴细胞中Fas的表达水平,应用HeLa细胞与Jurkat细胞共培养的方法体外研究HeLa细胞FasL诱导T淋巴细胞凋亡作用。结果显示:①HeLa细胞、正常宫颈上皮细胞中FasL表达阳性,其表达水平分别是(0.99±0.05)、(0.68±0.03),差别具有统计学意义(P=0.0007);Jurkat细胞Fas表达呈阳性;②HeLa细胞与Jurkat细胞共培养后Jurkat细胞的凋亡率为(38.23%±4.98%),应用抗体NOK-2中和HeLa细胞的FasL后,Jurkat细胞凋亡率减少为(3.54%±1.61%),两者相比,差别有显著性意义(P=0.0001);③HeLa细胞用CpG-ODN处理前后FasL的表达水平分别是(0.99±0.05)、(0.79±0.04),差别有统计学意义(P=0.005);CpG-ODN预处理的HeLa细胞与Jurkat细胞共培养后Jurkat细胞凋亡率为(6.41%±2.81%),而没有用CpG-ODN预处理的HeLa细胞与Jurkat细胞共培养Jurkat细胞凋亡率为(29.23±6.85)%,二者的差别有统计学意义(t=13.39,P=0.006)。HeLa细胞可能通过表达FasL主动诱导T淋巴细胞凋亡从而在肿瘤的免疫逃逸中发挥作用,CpG-ODN可通过下调FasL的表达而减少肿瘤细胞主动诱导的T淋巴细胞凋亡。     

层黏素受体靶向RNA干扰在削弱直肠癌免疫逃逸中的作用探讨

为探讨层黏素受体(laminin receptor,LNR)靶向RNA干扰在直肠癌免疫逃逸中的作用,将pGenesil-3-shLNR重组质粒转染SW480细胞,对比干扰组、对照组和空载组细胞中LNR mRNA和蛋白表达情况。建立SW480细胞与人Jurkat细胞Transwell小室旁分泌共培养模型,检测共培养48 h后SW480细胞和Jurkat细胞的凋亡率,并检测2种细胞Fas、FasL、Caspase-8 mRNA和蛋白表达情况。结果显示,重组质粒转染效率为(65.30±6.03)%。与对照组、空载组比较,干扰组LNR mRNA和蛋白相对表达量均较低(P0.05);SW480细胞凋亡率较高(P0.05),Jurkat细胞凋亡率较低(P0.05);SW480细胞Fas、Caspase-8 mRNA和蛋白相对表达量均较高,FasL mRNA和蛋白相对表达量较低,Jurkat细胞Fas、Caspase-8 mRNA和蛋白相对表达量均较低,FasL mRNA和蛋白相对表达量较高(P0.05)。对照组与空载组LNR mRNA及蛋白相对表达量,SW480细胞和Jurkat细胞凋亡率,SW480细胞和Jurkat细胞Fas、FasL、Caspase-8 mRNA及蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P 0.05)。以上结果提示LNR靶向RNA干扰可抑制直肠癌细胞中LNR表达,可能通过调节SW480细胞和Jurkat细胞中Fas/FasL信号通路使SW480细胞诱导Jurkat细胞凋亡率降低,同时增强Jurkat细胞杀伤SW480细胞能力,削弱直肠癌细胞的免疫逃逸能力。     

miR-363下调HepG2细胞Mcl-1蛋白的表达并诱导其凋亡

目的:探讨微小RNA-363(microRNA-363,miR-363)的作用靶点及其对Hep G2细胞的抑制作用。方法:通过生物信息学分析预测Mcl-1基因是否受microRNA调控。实时荧光定量PCR检测正常肝细胞系LO2及肝癌细胞系Hep G2、Huh7、PLC的miR-363和Mcl-1的表达水平。将miR-363转染人Hep G2细胞,检测miR-363对Mcl-1表达水平的影响。MTT法检测Hep G2细胞在转染miR-363后的相对细胞活力,Annexin V/PI染色法检测miR-363转染对Hep G2细胞凋亡的影响。结果:Mcl-1 mRNA 3’-非翻译区(3’-UTR)存在miR-363的假定结合位点,在肝癌细胞中转染miR-363后Mcl-1的表达下降。转染miR-363可抑制Hep G2细胞的活力并诱导其发生凋亡。结论:miR-363过表达可显著抑制Hep G2细胞的活力并诱导其发生凋亡,其机制可能与miR-363能下调Hep G2细胞Mcl-1蛋白的表达有关。     

ICA、PJA逆转人高转移肺癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸机制的研究

目的：研究ICA、PJA对人高转移肺癌细胞PG细胞免疫逃逸的逆转作用。方法：MTT法检测ICA、PJh对PG细胞增殖的影响以及对CD3AK杀伤敏感性的影响。流式细胞仪检测细胞表面分子Fas、FasL表达水平和细胞凋亡。应用PG细胞与Jurkat T细胞其培养的方法体外研究FasL诱导T淋巴细胞凋亡的作用。结果：PG细胞高表达FasL，低表达Fas，对CD3AK细胞杀伤敏感性较低，并在与Jurkat T细胞共培养中诱导高表达Fas的Jurkat T细胞凋亡。：ICA、PJA对PG细胞有明显的增殖抑制作用。ICA可明显提高PG细胞Fas的表达率。ICA、PJA可明显降低PG细胞FasL的表达率。ICA、PJA可使PG细胞与Jurkat T细胞共培养中，降低Jurkat T细胞的凋亡率。ICA、PJA可提高CD3AK细胞对PG细胞的杀伤活性。结论：ICA、PJA可逆转人高转移肺癌细胞PG通过Fas／FasL途径逃避机体免疫活性细胞的攻击。     

Fas/FasL途径介导的人肺癌细胞免疫逃逸

目的：观察在3种人肺癌细胞（A549、EBC-1、LCSC）和人T细胞(Jurkat) Fas/FasL表达情况，探讨人肺癌细胞免疫逃逸及反杀伤作用与Fas/FasL途径的关系。 方法： 用FACScan、RT-PCR方法检测Fas/FasL蛋白及mRNA表达；以荧光染色法观察细胞调亡；用台盼蓝拒染法检测细胞存活。 结果： 3种人肺癌细胞及T-细胞系(Jurkat)均表达 Fas及 FasL；肺癌细胞与Jurkat细胞共培养时，肺癌细胞可导致Jurkat细胞生长抑制(P<0.05)及凋亡；在共培养体系中加入FasL中和性抗体NOK1，可封闭肺癌细胞对Jurkat细胞的生长抑制作用(P>0.05)。 结论： Fas/FasL途径可介导上述3种人肺癌细胞对Jurkat细胞的生长抑制及致凋亡作用；中和性抗体可有效阻断Fas信号转导途径，抑制肿瘤细胞的反杀伤作用，有效保护免疫系统。     

人参总皂苷和小檗碱对肺癌PG细胞"Fas反击"的影响

目的：探讨人参总皂苷（Ginsenosirde，Gs）和小檗碱（Berberine，Ber）对肿瘤“Fas反击”免疫逃逸机制的影响。方法：首先建立肺癌PG细胞与Jurkat细胞的共培养体系；Giemsa染色和流式细胞仪观察和检测共培养后的Jurkat细胞的凋亡；SABC免疫细胞化学法检测Gs和Ber处理后的PG细胞FasL、Fas分子的表达。结果：Jurkat细胞与PG细胞共培养后产生凋亡，Gs和Ber处理的PG细胞诱导的Jurkat细胞凋亡更为显著；Gs和Ber可以上调PG细胞FasL、Fas分子的表达。结论：Gs和Ber可以促进PG细胞诱导Jurkat细胞凋亡的作用，其机制可能与Gs和Ber上调PG细胞FasL分子的表达有关。     

中药淫羊藿苷抑制肝癌HepG2.2.15细胞增殖和免疫逃逸作用研究

目的:观察中药淫羊藿苷(ICA)对HepG2.2.15细胞增殖及对CD3AK细胞杀伤活性的影响,探讨ICA对肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸的逆转作用,为ICA的开发应用提供新的理论和实验依据.方法:MTT法检测细胞增殖和细胞杀伤活性;流式细胞术检测细胞表面分子表达水平和细胞凋亡率.结果:50 μg/mlICA作用HepG2.2.15细胞48、72小时的增殖抑制作用明显,抑制率分别为22.04%、29.68%(P＜0.05),呈时间依赖效应.HepG2.2.15细胞经ICA处理后,FasL的表达率由16.22%显著下降至8.29%,Fas表达率由0.79%提高到1.70%(P＞0.05).ICA可明显抑制HepG2.2.15细胞诱导Jurkat细胞凋亡,凋亡率从46.66%下降为18.20%.ICA处理HepG2.2.15细胞后,不同效靶比的CD3AK细胞的杀伤活性,可分别由对照组的15.81%、35.04%、42.85%显著提高至42.58%、67.55%、88.93%(P＜0.05,P＜0.01),呈效靶比依赖效应.结论:ICA能有效地抑制HepG2.2.15细胞增殖,并有一定时间依赖效应;ICA可下调FasL的表达,上调细胞表面Fas的表达,对HepG2.2.15细胞诱导的T淋巴细胞凋亡作用有一定阻断,逆转肿瘤细胞的免疫逃逸作用;ICA显著增强HepG2.2.15细胞对CD3AK细胞杀伤的敏感性.     

转导反向6A8α—甘露糖苷酶cDNA对抗Fas抗体诱导Jurkat细胞凋亡的影响

用梯形DNA电泳与Gimsa染色研究T细胞瘤细胞株Jurkat在转导编码人6A8α-甘露糖苷酶基因的反向cDNA后,对抗Fas抗体诱导凋亡敏感性的变化,并用间接免疫荧光染色（流式细胞仪）检测细胞表面Fas分子的表达。结果表明,抗Fas抗体诱导细胞24h后,野生型及转导空载载体的Jurkat细胞出现明显的梯形DNA,两者之间无明显差异,但转导反向6A8cDNA的细胞未见明显的梯形DNA。Gimsa染色结果显示转导反向6A8cDNA的Jurkat细胞中凋亡细胞数明显减少,而转导空载载体则无影响。Jurkat细胞为Fas(CD95,Apo-1)全阳性细胞,转导反向6A8cDNA或空载载体对Fas表达阳性率与Fas表达强度无明显影响。以上结果提示,转导编码6A8α-甘露糖苷酶基因的反向cDNA使人T细胞株Jurkat对抗人Fas抗体诱导的凋亡作用产生耐受。     

水通道蛋白9表达水平影响HepG2肝癌细胞的生物学行为及对As_2O_3的敏感性

目的研究水通道蛋白9(AQP9)表达水平对三氧化二砷(As2O3)诱导Hep G2肝癌细胞凋亡及对其生物学行为的影响。方法采用MTT法筛选As2O3对肝癌细胞Hep G2增殖抑制作用;将重组质粒p EGFP-N1-AQP9和pshRNA-AQP9转染肝癌细胞,反转录PCR检测AQP9 mRNA的表达,Western blot法检测AQP9蛋白表达;将As2O3加入转染后及未处理的Hep G2细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术分析周期和凋亡情况;TranswellTM实验验证迁移侵袭能力的改变;酶标仪检测caspase-3活性。结果重组质粒对AQP9有明显的过表达及抑制表达作用,转染p EGFP-N1-AQP9组肝癌细胞的增殖抑制作用明显大于单纯As2O3处理组,侵袭及迁移能力显著减弱,细胞周期停滞在G0/G1期,凋亡明显多于单纯As2O3处理组,活化的caspase-3活性最高。转染pshRNA-AQP9组细胞的增殖抑制作用及caspase-3活性小于单纯As2O3处理组,侵袭迁移能力强于单纯As2O3处理组,细胞周期停滞在G0/G1期的数量及凋亡率较少。结论调节AQP9的表达影响Hep G2肝癌细胞的生物学行为并影响As2O3对Hep G2肝癌细胞的敏感性。     

Induction of FAS ligand expression in a human hepatoblastoma cell line by HCV core protein

Tumour cells and virus infected cells expressing Fas ligand (FasL) can evade immune surveillance by inducing apoptosis in T cells expressing Fas. In order to characterise a possible role of hepatitis C virus (HCV) core protein in similar mechanisms during HCV infection, we investigated Fas ligand expression and activity in a human hepatoblastoma cell line (HepG2) constitutively expressing this protein.Strong FasL induction was detected by immunoblotting and flow cytometry analysis in the core expressing cell lines Hep39. In contrast, vector transfected cells or cell lines expressing HCV E1-E2 proteins did not show FasL expression. Co-cultivation experiments of Hep39 cells with a Fas-sensitive T cell line indicated that FasL induced by the core protein had apoptotic activity toward target cells. Effect of the core protein on induction of FasL promoter was further examined by co-transfection of HepG2 cells with core-bearing plasmid and a vector in which luciferase gene expression is driven by human FasL promoter. Results of the luciferase assay indicated a positive regulation of FasL promoter by the core protein. In conclusion, HCV core protein plays a role in the induction of functional FasL in hepatoblastoma cell line and apoptosis in a target T cell line expressing Fas. Similar mechanisms may contribute, in vivo, to establishment of chronic infection and development of hepatocellular carcinoma (HCC).     

幽门螺杆菌致T细胞凋亡：Fas/FasL介导的T细胞无反应性

目的 评价幽门杆菌（Hp）致T细胞死亡的方式和机制,探讨这种作用与Hp感染致宿主产生免疫耐受的关系。方法 应用AnnexinV染色流式细胞术检测Hp致T细胞死亡的方式;应用细胞毒实验（JAM技术）和FasIgG抗体、caspase8抑制剂组断实验评价T细胞凋亡与Fas/FasL作用的关系,并通过流式细胞术直接检测Hp对T细胞FasL表达的上调作用及其与T细胞产生凋亡的时效关系。结果 AnnexinV染色和JAM技术证实H致T慢以凋亡方式进行的。这种细胞凋亡能被抗Fas抗体和caspase8抑制剂阻断,因而是Fas依赖,TH2细胞较TH1样T细胞对这种作用更敏感。由于Hp能直接上调T细胞的FasL且其发生时间与凋亡出现时间吻合,证实Hp是通过凋节T细胞之间Fas/FasL相互作用而致其凋亡的。Hp能通过调节Fas/FasL作用而负调节T细胞的生长,这可能是Hp感染致宿主发生T细胞耐受的机制之一。     

Activation through CD40 ligation induces functional Fas ligand expression by Langerhans cells

Langerhans cells (LC) are professional antigen-presenting cells of dendritic cell (DC) lineage and are critical for the induction of primary immune responses in skin. Following antigenic stimulation, LC migrate to regional lymph nodes and induce antigen-specific activation of T cells. After primary expansion, the majority of T cells undergo Fas/Fas ligand (FasL)-mediated apoptotic cell death, thereby suppressing their excessive expansion. Although recent investigations have indicated an immunoregulatory function for DC, whether LC could be involved in Fas/FasL-mediated suppression of activated T cells is still unclear. In this study, we found that LC express FasL after activation triggered through CD40 molecules on their surface, but not by stimulation with LPS or IFN-gamma. The functional significance of FasL expression by LC was demonstrated using two different assays for apoptosis induced in Jurkat cells. The apoptosis in Jurkat cells was completely blocked by anti-FasL blocking antibody, suggesting a Fas/FasL-mediated mechanism. These results indicate a new feedback mechanism to down-regulate T cell activation by LC through the interaction of the TNF receptor/ligand superfamily, CD40/CD40L and Fas/FasL.     

Regulation of cell surface expression of Fas (CD95) ligand and susceptibility to Fas (CD95)-mediated apoptosis in activation-induced T cell death involves calcineurin and protein kinase C, respectively

We show that an influenza hemagglutinin-specific CD4+ murine T cell hybridoma (IP-12-7) enters the apoptotic suicide program via the Fas ligand (FasL)/Fas-mediated pathway upon T cell receptor (TCR) stimulation. These cells express Fas and FasL mRNA, cell surface Fas and intracellular FasL, but do not enter apoptosis upon Fas ligation prior to TCR stimulation. TCR stimulation additionally results in protein synthesis-dependent cell surface expression of the preformed FasL. Addition of phorbol dibutyrate (PBu2) alone was sufficient to induce susceptibility to Fas ligation induced apoptosis, while addition of both PBu2 and calcium ionophore A23187 were required to induce FasL cell surface expression. Addition of cyclosporin A completely inhibited TCR-mediated death and FasL cell surface up-regulation, but had no effect on apoptosis induced directly by Fas ligation following TCR stimulation. Inhibitors of protein kinase C (PKC) (G? 6976 and GF 109203X) completely inhibited TCR-induced susceptibility to Fas ligation, but only partially inhibited TCR-induced cell surface expression of FasL. PKC isoenzymes alpha, beta, delta and zeta were expressed by this cell line and only the alpha and betaI isoforms translocated to the membrane fraction upon TCR stimulation. Our data suggest that in activation-induced T cell apoptosis PKC is involved in pathways that mediate the acquisition of Fas susceptibility, while calcineurin is required for cell surface expression of the preformed FasL.     

TNF相关凋亡诱导配体对肝癌细胞系生物学活性的影响

 目的：探讨新型凋亡分子TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)对人肝癌细胞系的作用及生物学活性的影响。 方法： 免疫细胞化学法检测HepG2细胞表面膜结合型TRAIL的表达，ELISA法检测HepG2细胞分泌型TRAIL的表达。MTT和TUNEL法分别进行细胞毒实验和凋亡的检测。HepG2细胞内端粒酶的活性由TRAP-PCR法检测，端粒酶催化亚单位hTERT的表达由流式细胞术进行检测。 结果： HepG2肝癌细胞系表面组成性表达TRAIL分子，并有适量的sTRAIL呈分泌表达。细胞毒实验显示TRAIL能够显著抑制肝癌细胞的生长，TUNEL检测结果显示TRAIL具有诱导肝癌细胞凋亡的效应。端粒酶的活性检测显示，TRAIL能够有效抑制肝癌细胞系内端粒酶的活性以及端粒酶催化亚单位的表达。 结论： TRAIL是一个有效的抑癌分子，能够通过诱导细胞凋亡、抑制端粒酶活性等途径控制肿瘤细胞的生长和进一步杀伤肿瘤细胞。     

再生障碍性贫血患者外周血T细胞FasL的表达分析

目的 比较分析再生障碍性贫血(AA)患者T细胞上Fas配体(FasL)的表达及其在胞内外的分布情况，观察AAT细胞胞浆FasL的释放特性及细胞毒作用。方法 以正常人“静息”T细胞和人为诱导活化的T淋巴母细胞为参照，采用免疫荧光标记和流式细胞技术，检测FasL在AAT细胞表面及胞浆中的分布；用体外大剂量PHA-过性刺激的方式诱导T细胞胞浆FasL的释放；以Jurkat细胞为靶向，同时辅以单抗阻断及超速离心的方法，观察AAT细胞FasL的释放特性和杀伤效应。结果 AA T细胞表面及胞浆中均有FasL的异常表达，其中胞浆FasL的异常表达尤为显著；高浓度胞浆FasL可在大剂量PHA-过性刺激时迅速向胞外释放；PHA刺激后的AAT细胞培养上清有明显的Jutkat细胞杀伤活性，该效应可被FasL McAb阻断，或经超速离心加以去除。结论 AAT细胞是一种处于预活化状态的细胞，具有与T淋巴母细胞相似的活化特征，含有高浓度、能以细胞外体形式诱导释放、具备完整活性的胞浆FasL是其异常活化的一大特点。     

雷公藤红素诱导CEM-6T细胞凋亡的机制研究

在已经证明雷公藤红素能诱导人T淋巴细胞株CEM 6T细胞凋亡的基础上 ,进一步探讨此凋亡过程的机制。本项目研究雷公藤红素诱导CEM 6T细胞凋亡过程中Fas/FasL、ICEmRNA的变化以及ICE抑制剂、磷酸酶抑制剂对凋亡的影响。结果发现 ( 1)CEM 6T细胞表达Fas,不表达FasL ,雷公藤红素处理不能改变这一情况 ;( 2 )雷公藤红素不能改变ICEmRNA的表达水平 ,但ICE抑制剂Ac YVAD CHO能使雷公藤红素诱导CEM 6T的凋亡率下降 ;( 3) 1 5 μmol/L磷酸酶抑制剂okadaicacid能使凋亡率下降。提示雷公藤红素诱导CEM 6T细胞凋亡不依赖Fas/FasL ,而与细胞内原已存在的ICE有关 ,蛋白去磷酸化参与了此凋亡过程