LacZ基因在体内外骨骼肌中的表达

采用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导基因转移技术，将含有大肠杆菌β－半乳糖苷酶的结构基因（ＬａｃＺ基因）及Ｒｏｕｓ肉瘤病毒启动子的质粒（ｐＲＳＶ－ＬａｃＺ）导入体外培养的大鼠原代骨骼肌内；另外，分别将具有ＲＳＶ启动子和巨细胞病毒ＣＭＶ启动子的ＬａｃＺ基因直接注射到活体小鼠肌肉组织内。经转染的体外培养骨胳肌细胞和取自活体的肌肉组织切片行Ｘ－ｇａｌ组织化学检测以判断ＬａｃＺ基因的表达情况。实验结果证明，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的骨胳肌基因转染率约为１０％～２０％。直接肌肉注射含有不同启动子的ＬａｃＺ基因后，肌细胞内均有该基因表达。结果表明，无论在体内或体外，骨骼肌细胞均能被外源性基因所转染并能表达该报告基因。因此，有望使用经遗传工程改造的骨胳肌细胞作为体细胞基因治疗的有效运载细胞。     

基因转移的骨骼肌细胞及其在基因治疗中的应用

基因转移的骨骼肌细胞及其在基因治疗中的应用田竟生郑少鹏近年来发现，若将外源基因包括报告基因及目的基因克隆到哺乳动物表达性质粒载体或病毒载体上，再将质粒ＤＮＡ以裸露方式或用脂质体包裹，直接注射或先体外后体内（ｅｘｖｉｖｏ）法，即经骨骼肌的前体细胞——成...     

外源基因在体内表达实验研究

目的：探讨Ｗｉｓｔａｒ大鼠舌肌是否具有摄取外源ＤＮＡ并表达其携带基因的能力。方法：将质粒ｐＳＶ４０－β－ａｇｌ扩增，纯化后溶于３０％蔗糖溶液中，取５０μｇ质粒ＤＮＡ直接注射于Ｗｉｓｔａｒ大鼠舌肌中。１周后用Ｘ－ｇａｌ组织化学染色分析质粒ＤＮＡ在体仙表达。结果：在Ｗｉｓｔａｒ大鼠舌肌中检查出报导基因产物β－半乳糖苷酶的表达。     

人肿瘤坏死因子α基因cDNA直接注入小鼠骨骼肌表达的初步研究

本实验将带有人肿瘤坏死因子α基因（ＴＮＦ－α基因）ｃＤＮＡ的重组表达质粒直接注入小鼠骨骼肌内，观察了外源基因在小鼠体内的表达情况。双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ法显示，实验组小鼠肌注１５ｄ后血浆中ＴＮＦ蛋白含量逐渐增高并达高峰，然后开始下降。ＲＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ结果显示，肌注２０ｄ时实验组中ＥＬＩＳＡ阳性的小鼠，其肌注处肌肉组织有ＴＮＦ－α基因表达。由此表明，直接将外源ＤＮＡ导入骨骼肌细胞内是基因转移     

外源基因在周围神经吻合口中的表达

目的　应用外源基因缝线行周围神经吻合 ,探讨神经吻合口直接转基因并使外源基因在吻合口得以表达的可行性。方法　构建含有大肠杆菌 (Escherichiacoli,E coli ) β 半乳糖苷酶 (β galactosidase,β Gal)的结构基因(lacZ基因 )及人类巨细胞病毒 (cytomegalovirus,CMV)启动子的PCMVβ质粒。应用通过浸泡处理的 8 0医用尼龙无创缝线行兔坐骨神经外膜缝合。对照组应用浸泡过蔗糖PBS溶液的缝线 ,实验组应用浸泡过PCMVβ质粒溶液的缝线进行神经缝合。分期取出神经吻合部 ,进行 β 半乳糖苷酶组织化学染色及 β 半乳糖苷酶活性检测。结果　组织化学染色显示对照组术后各期的所有吻合部神经组织均无蓝染阳性细胞 ,而实验组术后各期的所有吻合部神经组织均有蓝染的阳性细胞 ;对照组术后各期吻合部神经组织中均未检测到 β 半乳糖苷酶活性 ,实验组吻合部神经组织从术后 2d到 30d都可检测到 β 半乳糖苷酶活性。 结论　应用外源基因缝线可使外源基因转移至周围神经吻合口中并表达出具有生物活性的外源基因表达产物 ,为应用基因治疗促进神经功能的恢复提供了可行途径。     

人凝血因子Ⅸ基因直接注射入小鼠骨骼肌内表达的进一步研究

目的：观察人凝血因子ⅨｃＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌后的存在和表达部位。方法；采用免疫组化和酸杂交检测人Ⅸ因子ｃＤＮＡ注入小鼠肌肉后的存在和表达情况。结果：免疫组化和斑杂交显示肌注４周时有Ⅸ因子的蛋白质和ｍＲＮＡ表达，原位杂交显示肌注４周时局部肌细胞内仍有Ⅸ因子ｃＤＮＡ存在。结论：Ⅸ因子ｃＤＮＡ肌注４周时在局部细胞内仍存在的并有较高的表达。     

不同阳离子脂质体介导基因转染效率的比较研究

目的评估不同脂质体介导基因转染条件及效率。方法以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，比较三种阳离子脂质体（lipen、lipotecfamine和Dosper）在不同的脂质体：DNA比例、不同细胞汇合度、不同转染时间及血清存在条件下转染情况。通过x-gal染色法观察不同脂质体的转染效率。结果三种阳离子脂质作的最优条件不同。Dosper转染效率最高，蓝染细胞达18％。结论通过条件优化可使脂质体转染效率提高。有望成为一种有效的非病毒基因转移方法应用于基因治疗。     

骨骼肌高表达质粒VR／TPO在CHO细胞中瞬时表达及动物实验

目的：构建肌肉高表达质粒ＶＲ／ＴＰＯ,将其在体外定量表达,并初步了解其体内表达活性。方法;以重组ＴＰＯ ＣＤＮＡ为目的基因,构建人ＶＲ／ＴＰ炕效表达质粒,用脂质体法将共转染ＣＨＯ细胞,ＲＴ－ＰＣＲ法检测ＭＲＮＡ表达,ＥＬＩＳ 表达量,并不入体内了解其对巨核各级造血的影响。结果：ＶＲ／ＴＰＯ可在ＣＨＯ中高效表达,其在表量超过ＰＣＤＮＡ３ＴＰＯ,并初步发现有促进血小板增加作用。结论：ＶＲ／ＴＰＯ为一高     

肿瘤转移相关基因的表达谱研究

目的：运用基因表达谱芯片技术对肿瘤转移相关基因的表达谱进行研究。方法：对临床切除的肝癌和胰腺癌组织及相应的对照正常组织进行总ＲＮＡ抽提,纯化后的ｍＲＮＡ进行逆转录制备杂交探针,应用ＢｉｏＤｏｏｒ４０９６和ＢｉｏＤｏｏｒ１２８００的全长基因ＤＮＡ芯片筛选与肝癌和胰腺癌转移相关的基因。杂交后的信号用ＳｃａｎＡｒｒａｙ３０００扫描,结果用ＩｍａＧｅｎｅ３．０软件分析。结果：对肝癌和胰腺癌基因表达谱进行分     

dd—PCR法研究中草药促神经生长过程中的基因差异表达

目的 :为探讨中药促神经生长的分子机理提供实验依据。方法 :采用 dd-PCR方法 ,从体外培养大鼠背根神经节细胞加中药组和不加中药组中获得两者的差异表达片段 ,并克隆测序分析。结果 :获得 7个差异条带 ,其中 2个条带的 c DNA序列分别与酪氨酸磷酸酶受体 ( PTPR) m RNA、促生长素抑制素受体 ( SSTR) m RNA的序列部分同源。结论 :在中药促神经生长过程中 ,神经元基因具有选择性表达的变化     

INCREASED EXPRESSION OF DIRECT GENE TRANSFER INISCHEMIC SKELETAL MUSCLES OF RABBITS

ResumeOhjectifEnvuedetrouverunenouveuetechniquedelivraisongdndtiquedansietraitementdesmaladieschroniquesd'Occlusionartdrielle,l'expressiongendtiquedansiesmusclessquelettiquesischdmiquesparl'injectiongdnetiquedirecteavaitatedtudiee.MethodesApresl'dtablissementchezlapinsdumoduleischemiquemusculairedesmembrespostdrieursdanslesquelsplasmidePSV--p--galcommegenerdcepteuradiddirectementtransldrd,l'activitddep--galactosidaseadiddeceldepartechniquehistochmique.Resultalsl'expressiongdndtiqueplusdlevde…     

RNA-DNA杂交法研究乳酸脱氢酶-C基因在睾丸中特异性表达

用同位32~P标记乳酸脱氢酶-C(LDH-C)cDNA作为探针,与小鼠胸腺、脑、胰、心肌、骨骼肌、睾丸、肾、肺、肝的RNA以及人胰、皋丸、肝、骨骼肌、心肌及脑的RNA分别作点溃杂交(dot blot hybridization)及Northern印迹杂交,证实LDH-C基因只在睾丸中特异性表达。     

人突变CD59基因表达蛋白功能的研究

①目的构建8种突变CD59基因真核表达系统，观测突变的人CD59基因在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达及抗补体活性。②方法以荧光活化细胞分类法、免疫荧光法及免疫印迹法检测突变CD59基因转染CHO细胞表达的情况，染料释放实验检测正常突变的CD59分子糖基化前后的抗补体活性。③结果转人突变CD59基因组荧光阳性细胞百分率明显高于对照组，染料释放率低于对照组。④结论CD59突变基因可在CHO细胞表面得到有效表达，该CD59分子具有抗补体活性，但在高糖环境下易被糖基化失活而失去抗补体活性。     

PTEN基因在卵巢子宫内膜异位症组织中的表达

①目的　探讨卵巢子宫内膜异位症 (内异症 )组织中PTEN基因表达及临床意义。②方法　用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) ,检测内异症组织和正常卵巢组织中PTEN基因外显子 1 9和 5 9mRNA的表达水平 ,同时结合病人的临床资料进行分析。③结果　内异症组织中PTENmRNA外显子 1 9、5 9相对表达水平与正常卵巢组织比较 ,差异有显著性 (t=3.12 2、2 .2 0 9,P <0 .0 1、0 .0 5 )。内异症组织中PTENmRNA表达水平与病人年龄、囊肿大小无关 (t =0 .111～ 1.4 4 7,P >0 .0 5 ) ;与临床分期有关 (t =2 .6 78、2 .2 84 ,P <0 .0 5 )。④结论PTENmRNA转录水平的异常可能是内异症恶变的早期事件。     

平滑肌肿瘤组织中DNA含量和bcl-2基因的表达

①目的　探讨平滑肌肿瘤中DNA含量、异倍体率及bcl 2表达与病理学特征的关系。②方法　采用IMS型彩色病理图像分析系统对 38例平滑肌肿瘤细胞DNA含量及倍体特征进行定量分析 ;同时采用免疫组织化学SABC方法检测 33例平滑肌肉瘤中Bcl 2蛋白的表达。③结果　DNA含量 (DI值 )在平滑肌瘤 (LM )、潜在恶性平滑肌瘤 (PMSMT)、平滑肌肉瘤Ⅰ级 (LS Ⅰ )及平滑肌肉瘤Ⅱ级 (LS Ⅱ )间的差异有显著意义 (F =10 .19,P <0 .0 1) ,其中LM组和PMSMT组低于LS Ⅰ和LS Ⅱ组 ,差异有显著意义 (q =3.5 5～ 6 .96 ,P <0 .0 5 ) ,LM组与PMSMT组 ,LS Ⅰ与LS Ⅱ组比较差别无显著性 (q =1.81,0 .74 ,P >0 .0 5 )。恶性平滑肌肿瘤 (包括PMSMT和LS)组织的DNA含量及异倍体率均高于LM ,差异有显著性 (t=2 .16 ,P <0 .0 5 ;P =0 .0 0 16 )。肿瘤直径 >10cm者DNA含量高于直径 <6cm者 (F =4 .97,q =4 .4 5 ,P <0 .0 5 ) ;直径 <6cm者与 6～ 10cm者 ,直径 >10cm者与6～ 10cm者DNA含量比较差异均无显著性 (q =1.6 9,2 .0 3,P >0 .0 5 )。有坏死者与无坏死者DNA含量比较 ,差异有显著性 (t=2 .76 ,P <0 .0 1) ,但其异倍体率比较无显著性差异 (P =0 .0 83)。Bcl 2蛋白阳性率在PMSMT ,LS Ⅰ及LS Ⅱ间比较差别无显著性 (P =0 .0 8～ 0 .75 )。④     

胞外蛋白酶对外源基因表达的影响

根据Ａ蛋白基因产物－Ａ蛋白特异与许多动物的免疫蛋白的Ｆｃ段结合这一特性，应用ＥＬＩＳＡ检测方法，测定Ａ蛋白基因地衣芽胞杆菌ＮＭ１０５中的表达情况，进而研究外蛋白酶对外源基因表达的影响。     

HCMV即刻早期基因原核表达克隆的构建

①目的构建人类巨细胞病毒ＡＤ１６９株即刻早期基因ＵＬ３７×１基因片段的原核表达克隆。②方法通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增目的基因，然后用限制性内切酶将目的基因与原核表达载体ｐＢＶ２２０定向连接。③结果获得了重组的原核表达质粒。④结论用限制性内切酶鉴定原核重组表达质粒构建成功     

RT—PCR技术检测原发上皮性卵巢癌MDR1基因表达

目的建立适于临床检测原发上皮性卵巢癌ＭＤＲ１ｍＲＮＡ表达方法。方法应用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术对３７例原发上皮性卵巢癌、１０例正常卵巢和２０例外周血新鲜标本ＭＤＲ１基因进行了检测。结果原发上皮性卵巢癌标本中ＭＤＲ１基因阳性表达率为３０％,而正常卵巢和外周血标本则无ＭＤＲ１基因表达。结论ＲＴ－ＰＣＲ技术检测原发上皮性卵巢癌ＭＤＲ１基因表达具有灵敏度高、相对定量和结果可靠的优点,适于临床应用。