逆转录病毒介导的重组TNF－α抗小鼠肿瘤效应的研究

利用逆转录病毒介导的基因转移技术，将重组ＴＮＦ－α基因导入小鼠平滑肌肉瘤细胞系Ｓ１８０中，对转导后肿瘤细胞的增殖、致瘤效应等进行体外和体内的观察。结果表明；逆转录病毒中介的重组ＴＮＦ－α基因导入，在小鼠体外和体内都有显著的抗肿瘤效应，这为ＴＮＦ－α的肿瘤基因治疗的临床应用奠定了基础。     

肿瘤基因治疗的研究进展

基因治疗是指将外源正常基因通过基因转移技术导入靶细胞,纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的的一种生物治疗方法。本文从自杀基因、基因沉默、抑癌基因、免疫基因、抑制血管生成基因等几方面综述了近几年肿瘤基因治疗的研究和发展现状。自杀基因治疗系统包括HSV-tkGCV系统、H19 RNA、hTERT等,HSV-tkGCV系统是自杀基因治疗系统研究最多的一种,TK基因是药敏基因,肿瘤细胞转染该基因后,对前体药物丙氧鸟苷(GCV)或无环鸟苷(ACV)变得敏感而能被杀死。RNA干扰是基因沉默治疗的主要方式,通过沉默肿瘤相关基因IDO2、DUSP6、IGF1R、ORAOV1等基因可以明显抑制肿瘤生长。抑癌基因激活或过表达可以抑制肿瘤生长,p53和PTEN是两个最有意义的抑癌基因,重组腺病毒p53和PTEN可以显著抑制肿瘤生长。免疫基因治疗是将细胞因子或共刺激分子基因导入肿瘤细胞或体细胞内,通过激发或调动机体免疫功能来控制或杀伤肿瘤细胞,常用的免疫效应细胞有TIL、CTL、LAK、NK等,可供选择的目的基因有肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子、干扰素、趋化因子等。抑制血管生成基因可以通过抑制肿瘤新生血管的生成,来阻止肿瘤生长和侵袭,VEGF-Trap、PEDF、ES通过腺病毒导入肿瘤可以显著抑制肿瘤生长。目前肿瘤基因治疗在特异性、安全性和靶向性方面依然存在亟需解决的问题。      

血管生成抑制素基因对人原发性肝细胞癌裸鼠移植瘤的治疗作用

目的：研究血管生成抑制素基因对人原发性肝癌裸小鼠皮下移植瘤的治疗作用。方法：建立人原发性肝癌裸小鼠皮下移植瘤模型。将荷瘤裸小鼠随机分为3组；肿瘤对照组，空载体组及angio基因治疗组分别瘤内直接注射裸露DNA质粒，不同时段观察皮下肿瘤生长情况，绘制计算皮下肿瘤生长曲线：病理学检查；原位末端标记（TUNEL）法检查细胞原位凋亡；放射免疫法检测裸小鼠血清甲胎蛋白变化；透射电镜观察细胞超微结构变化。结果：皮下肿瘤生长曲线及病理学检查结果显示，angio基因瘤内注射可部分抑制肿瘤生长。TUNEL法检测显示，angio组凋亡指数明显高于肿瘤对照组。扫描电镜观察细胞超微结构变化。发现angio基因治疗组内有明显的细胞凋亡发生。结论：angio基因直接瘤内注射能抑制人原发性肝癌裸小鼠移植瘤肿瘤生长。其作用机理可能为抑制肝癌的血供从而抑制肿瘤生长。     

逆病毒载体介导的双耐药基因在小鼠骨髓细胞的转移

目的　增强造血细胞对化疗药物的耐受性 ,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因导入在造血细胞保护性基因治疗中的作用。方法　应用电穿孔基因转移法将逆转录病毒载体G1Na MGMT IRES MDR1导入病毒包装细胞GP E86及PA3 17,以VCR加压筛选后的阳性克隆上清感染小鼠骨髓细胞 ,应用PCR、Southernblot及流式细胞仪检测耐药基因MGMT及MDR1在细胞中的转移与表达。结果　加压筛选及乒乓效应使病毒滴度由 ( 0 .2～ 7.6)× 10 4CFU/mL提高到 ( 1.9～ 5 .7)× 10 6 CFU/mL ,从DNA、RNA及蛋白水平上分别证实了双耐药基因在小鼠骨髓细胞中获得了有效转移和表达 ,而转基因后的小鼠骨髓细胞对VCR、高三尖杉酯碱和BCNU的耐药性比未转导细胞分别提高了 5 .7、5 .0和 8.5倍。结论　双耐药基因成功导入小鼠骨髓细胞为肿瘤基因治疗的临床研究提供了实验基础。     

一种新型基因传输载体-磷酸钙纳米颗粒用于肿瘤基因治疗的研究

目的研究新型非病毒栽体磷酸钙纳米颗粒的生物学特性，评估其在肿瘤基因治疗中应用的前景。方法化学方法制备，氯化钙修饰纳米颗粒，用琼脂糖凝胶电泳分析磷酸钙纳米颗粒与DNA的结合效率及对DNA的保护作用，用绿色荧光蛋白基因作报告基因，将磷酸钙纳米颗粒为基因栽体转染鼻咽癌（CNE-2）细胞和在动物体内转染肿瘤细胞；以及将磷酸钙纳米与自杀基因yCDglyTK结合，并在体外对鼻咽癌进行基因治疗。结果电镜观察证实磷酸钙纳米颗粒进入细胞内，磷酸钙纳米颗粒与DNA结合后，能对DNA起保护作用；磷酸钙纳米颗粒作为基因转染的栽体，将绿色荧光蛋白基因导入CNE-2细胞，用荧光显微镜观察到高水平的绿色荧光蛋白表达；体内转染结果显示，纳米介导的基因在肿瘤组织中有很好的表达：以磷酸钙纳米为栽体介导自杀基因yCDglyTK在体外治疗鼻咽癌的实验中显示，在加入5-FC后大量的CNE-2细胞出现死亡。结论磷酸钙纳米颗粒具有优良的生物学特性。是有应用前景的基因转染和基因治疗栽体之一。     

基因-病毒载体的研制及其抗肿瘤作用的初步研究

目的：研究一种结合肿瘤基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统,即基因－病毒载体系统。方法：利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒的病毒基因组中,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素12表达量及病毒复制情况。结果构建了一种新型基因－病毒载体系统,该载体系统腺病毒E1b55000蛋白缺失,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX－015的相似功能,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖,而在正常细胞内不能复制及增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞。该载体系统还可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应该该载体系统携带该报告基因荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系,而在正常细胞内低表达,表达量与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12,也产生类似结果。电镜也证实该载体系统携带抗肿瘤基因小鼠白细胞介素12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论：基因－病毒载体将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组,可数百倍乃至上万部提高抗癌基因的表达量,进一步提高抗肿瘤的疗效。     

Gene-viral vectors: a promising way to target tumor cells and express antican cer genes simultaneously

目的：研究一种结合肿瘤基因治疗与美丽治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统,即基因-病毒载体系统。方法：利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒基因组中,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素12表达量及病毒复制情况。结果：构建了一种新型基因-病毒载体系统,该载体系统腺病毒E1b-55kDa蛋白缺失,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX-015相似功能,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖,而在正常细胞内不能复制及增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞。它还具有更大的优势,即该载体系统可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应用该载体系统携带该报告基因绿色荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系,而在正常细胞内低表达,与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12,也产生类似结果,并在电镜中证实该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论：基因-病毒载体是将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组,通过肿瘤增殖病毒在肿瘤细胞内特异性复制及增殖,从而数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量。它充分利用了肿瘤基因治疗与病毒治疗优势,进一步提高抗肿瘤的疗效,克服了传统基因治疗转染率低、表达量少及靶向性弱等缺点及病毒治疗的杀伤力低的缺点。它将成为肿瘤治疗最有希望的治疗方案之一。     

逆转录病毒介导的重组TNF—α抗小鼠肿瘤效应的研究

利用逆转录病毒介导的基因转移技术，将重组ＴＮＦ－ａ基因导入小鼠平滑肌肉瘤细胞系Ｓ１８０中，对转导后肿瘤的增殖、致瘤效应等进行体外和体内的观察。结果阴明；逆转录病毒中介的重组ＴＮＦ－ａ基因导入，在小鼠体外和体内都有显著的抗肿瘤效应，这为ＴＮＦ－ａ的肿瘤基因治疗的临床应用奠定了基础。     

基因体内导入法与肝癌基因治疗

研究表明,基因导入方法在实现基因治疗目的上起关键性作用,本文就肝癌基因治疗中基因体内导入方法的应用作一综述。一、基因体内导入方法概述基因治疗的效果首先取决于治疗基因在体内转移到相应靶细胞所选择的转移方法。目前肝癌基因治疗的重点在体内(In vivo)组织或肿瘤细胞原位直接基因转移的方法上。接近临床应用的体内基因转移方法应该是简单、经济、直接而且有特异性器     

人肺巨细胞癌株(PLA801-95D)细胞球体在体内外侵袭和体内转移的观察

利用人肺巨细胞癌株PLA801-95D细胞悬液,在通气的旋转摇动培养系统中形成球体。在体外,直径0.2mm的PLA801-95D球体与圆形预培养的鸡胚心肌块(PHF)接触培养,表现出很强的侵袭力和很高的恶性程度。在体内,直径0.3mm的PLA801-95D球体分别移植于裸小鼠耳廓皮下和背部皮下,结果耳廓皮下移植裸小鼠未见肿瘤生长,背部皮下移植5只裸小鼠中3只在接种局部出现侵袭性生长,并有引流淋巴结和肺转移。提示PLA801-95D细胞株在体内外恶性程度均较高。     

血管内皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体的改进与体内 …

目的 通过构建一种有相对靶向性的基因治疗载体,将外源基因导入新生血管内皮细胞,为开展靶向于肿瘤新生血管的基因治疗奠定基础。方法 根据血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）与ＶＥＧＦ受体结合位点,修改本实验室已有的酸体寡肽ＧＶ１、ＧＶ２氨基酸序列,并合成了基因转移载体系统。用载体包裹外源ＤＮＡ（β－ｇａｌ）,进行体内实验,观察外源基因在体内的分布和不同时间的表达情况。结果 报告基因在心、肺、肝和肾中无明显地表     

靶向survivin的siRNA对裸鼠肾癌移植瘤生长的影响

目的 观察生存素(survivin)小干扰RNA(siRNA)在体内是否能抑制肾癌移植瘤体的生长.方法 BALB/c雌性裸鼠皮下种植786-O细胞,将成瘤阳性的裸鼠按照随机区组法分为8组(A～H组),每组5只.选取2组survivin序列特异性双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),导入裸鼠皮...     

小干扰RNA沉默MAT1基因治疗胰腺癌的实验研究

目的了解体外转录法合成的小干扰RNA（siRNA）沉默MAT1基因对胰腺癌的体内体外抗癌效应。方法用siPORT-脂质体（1ipid）中性阳离子脂质体转染由体外转录法合成、Cy3荧光标记的双链siRNA人胰腺癌BxPC3细胞,观察对胰腺癌细胞生长和细胞周期曲线的影响,检测MAT1基因被siRNA沉默后mRNA和蛋白质的表达水平。在裸鼠胰腺癌皮下移植瘤瘤体内直接注射siRNA观察抑瘤效应。结果合成的4条MAT1-siRNA序列中有一半可显著抑制BxPC3细胞的生长。体外转染MAT1-siRNA72h后,BxPC3细胞生长抑制率达34．9％（P〈0．01）;83．9％的BxPC3细胞滞留于G。／G,期,而空白对照组仅59．86％（P〈0．01）。体外转染MAT1-siRNA48h后MAT1-mRNA水平下调了80．12％,72h后MAT1蛋白质水平下调了50．12％,与各对照组相比差异均有统计学意义（均P〈0．01）。MAT1-siRNA注射组裸鼠移植瘤重量和体积均明显低于对照组（均P〈0．05）,抑瘤率达42．53％。结论siRNA介导的MAT1基因沉默在体外实验中显著抑制了胰腺癌细胞的生长,在体内实验中对裸鼠胰腺癌皮下移植瘤产生明显的抑瘤效应。     

靶向PEG10的siRNA真核表达载体对裸鼠肝癌移植瘤生长的影响

目的探讨靶向PEG10的siRNA真核表达载体(psiRNA-PEG10)对裸鼠人肝癌移植瘤生长的影响。方法建立人肝癌细胞HepG2的荷瘤裸鼠模型,在接种后第14天分别将psiRNA空载体和psiR-NA-PEG10瘤内多点注射进行治疗,观察肿瘤大小变化、组织形态学及超微病理改变。结果psiRNA-PEG10治疗组肿瘤生长受到明显抑制,与生理盐水组和psiRNA组比较差异有显著性(P<0.001),抑瘤率明显高于其他两组,电镜下可见明显的细胞凋亡。结论靶向PEG10的siRNA真核表达载体对裸鼠肝癌移植瘤生长有抑制作用。     

基因枪在肿瘤基因治疗中的应用价值

目的 研究基因枪经小鼠皮肤转移基因的效率、被转基因的表达量、表达时间,以及对小鼠肿瘤的治疗效果,探讨作为一种 基因转移工具,基因枪在基因治疗中应用的可能性。方法 （１）用荧光显微镜观察基因枪对体外培养细胞系的基因转导效率和被转基因表达时间;（２）通过基因枪向小鼠皮肤转Ｌａｃ￣Ｚ基因后,取转瓣皮肤做冰浇灌发片进行β－ｇａｌ染色,观察转基因蛋白在皮人中表达的部位;（３）用ＥＬＩＳＡ法检测向小鼠皮肤转ｍ     

联合转染血管生成抑素和Fas基因对裸鼠移植瘤生长的影响

目的探讨联合转染血管生成抑素（AS）基因和Fas基因对移植于裸鼠的人结肠癌生长的影响。方法构建pcDNA3-As和pcDNA3-Fas质粒。建立裸鼠皮下移植人结肠癌模型，通过瘤内注射分别将As、Fas、AS和Fas基因转染皮下肿瘤，定期检测肿瘤大小，用免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果成功构建了pcDNA3-As和pcDNA3-Fas质粒。质粒转染后6d，Fas组和联合转染组的肿瘤体积明显小于对照组（P〈0．05）；质粒转染后9d，AS组的肿瘤体积明显小于对照组（P〈0．05）；质粒转染后12d，联合转染组的肿瘤体积明显小于Fas组和AS组（P〈0．05）。质粒转染后15d，联合转染组和AS组肿瘤的MVD明显小于对照组（P〈0．05）。结论联合转染AS和Fas基因对裸鼠移植人结肠肿瘤有协同抑制作用。     

应用cDNA表达芯片研究复方黄连对CNE1鼻咽癌移植瘤基因表达的影响

目的 :研究复方黄连对鼻咽癌裸鼠移植瘤基因表达的影响。方法 :培养的鼻咽癌细胞系CNE1细胞接种Balb/C裸鼠 ,待移植瘤形成后灌喂复方黄连 ,然后从移植瘤组织提取RNA ,经逆转录标记后的cDNA作为探针 ,与高通量cDNA表达芯片杂交并用激光共聚焦扫描仪分析基因表达。通过逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)半定量技术进一步分析差异表达基因的表达。结果 :复方黄连处理移植瘤裸鼠 30d后 ,移植瘤明显减小 ,其抑瘤率为 2 9.5 %。同时 ,移植瘤组织基因表达发生显著变化。用该复方处理的CNE1鼻咽癌移植瘤组织有 147条基因表达发生改变 ,包括 10 2条下调表达的基因和 45条上调表达的基因。RT PCR半定量技术分析证实有 3条基因为真正差异表达 ,它们分别是MAD3,H731和CHK1基因。其中 ,MAD3和H731基因表达上调 ,CHK1基因表达下调。结论 :复方黄连可抑制CNE1鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长并可影响其基因的表达 ,它对CNE1鼻咽癌移植瘤的抑制作用与其调节移植瘤基因表达密切相关。     

应用cDNA表达芯片研究复方黄连对CNE1鼻咽癌移植瘤基因表达的影响

目的：研究复方黄连对鼻咽癌稞鼠移植瘤基因表达的影响。方法：培养的鼻咽癌细胞系CNE1细胞接种Balb/C裸鼠，待移植瘤形成后灌喂复方黄连，然后从移植瘤组织提取RNA，经逆转录标记后的cDNA作为探针，与高通量cDNA表达芯片杂交并用激光共聚焦扫描仪分析基因表达。通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)半定量技术进一步分析差异表达基因的表达。结果：复方黄连处理移植瘤裸鼠30d后，移植瘤明显减小，其抑瘤率为29．5％。同时，移植瘤组织基因表达发生显著变化。用该复方处理的CNE1鼻咽癌移植瘤组织有147条基因表达发生改变，包括102条下调表达的基因和45条上调表达的基因。RT-PCR半定量技术分析证实有3条基因为真正差异表达，它们分别是MAD3，H731和CHK1基因。其中，MAD3和H731基因表达上调。CHK1基因表达下调。结论：复方黄连可抑制CNE1鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长并可影响其基因的表达，它对CNE1鼻咽癌移植瘤的抑制作用与其调节移植瘤基因表达密切相关。     

MicroRNA-16抑制人卵巢癌在裸鼠皮下移植瘤生长的研究

目的:探讨microRNA-16(miRNA-16)转染对人卵巢癌细胞株SKOV-3在裸鼠皮下移植瘤形成的抑制作用。方法:将成熟miRNA-16双链模拟物及其阴性对照序列转染人卵巢癌SKOV-3细胞株,然后分别接种于裸鼠皮下,观察两组肿瘤出现时间及肿瘤体积变化,接种20d后取出肿瘤组织称重,计算抑瘤率。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肿瘤组织中Bcl-2mRNA表达,并进行免疫组化检测两组肿瘤组织中Bcl-2蛋白表达。结果:miRNA-16转染组肿瘤生长相对延缓,种瘤20d后miRNA-16转染组移植瘤重量明显小于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率达38.46%;PCR结果显示miRNA-16转染组Bcl-2 mRNA表达量与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);移植瘤组织免疫组化分析两组Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:miRNA-16对人上皮性卵巢癌裸鼠移植瘤生长有抑制作用,可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点。     

胡桃醌不同给药途径对人肝癌细胞BEL-7402裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的采用裸鼠皮下移植瘤模型,通过不同给药途径对胡桃醌抗肿瘤活性和毒性进行评价。方法建立人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过腹腔注射和局部注射两个给药途径观察胡桃醌抑制肿瘤生长的效果。结果①以600、300和150μg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,发现该剂量胡桃醌对肿瘤生长没有明显的影响;NK细胞活性检测发现,600、300μg/kg胡桃醌对裸鼠免疫功能有影响(P均<0.01),150μg/kg胡桃醌则没有影响(P>0.05);与阳性对照组(5-Fu)相比,600μg/kg胡桃醌组NK细胞活性差异无显著性(P>0.05),300和150μg/kg胡桃醌组NK细胞活性差异有显著性(P<0.05,P<0.01),结果提示胡桃醌对小鼠免疫系统有一定的损伤作用。②以4.5、3和1.5 mg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,抑瘤率分别为为78.24%、66.57%、48.94%;4.5、3 mg/kg胡桃醌的抑瘤作用可与阳性对照组比拟(P均>0.05)。但4.5 mg/kg胡桃醌组裸鼠出现明显的皮下脂肪减少、消瘦,并有死亡现象。③以pH...