胚胎大鼠脑纹状体和中脑神经干细胞的培养

目的研究大鼠脑不同部位胚胎神经干细胞的增殖分化特性。方法采用无血清培养基分离和培养大鼠脑的纹状体和中脑的神经干细胞,通过巢蛋白(nestin)表达和5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine BrdU)染色,鉴定细胞的增殖能力;通过新生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性免疫细胞化学染色,鉴定培养细胞的多潜能性。通过酪氨酸羟化酶的染色(tyrosine hydroxylase,TH)鉴定多巴胺神经元。结果二者在体外培养都可增殖成球,并能分化成神经系统3个谱系的细胞。纹状体增殖传代3个月,中脑培养细胞增殖维持3周。中脑干细胞分化TH阳性细胞比例高于纹状体。结论培养的胎鼠脑细胞是神经干细胞。纹状体干细胞增殖能力高于中脑干细胞,中脑干细胞更倾向于分化成TH阳性细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的培养与鉴定

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点。方法取孕15d的大鼠,采用机械分离法获取海马区细胞,以106个细胞/m l的密度接种到无血清NSCs培养基中培养,分离纯化至第5代。以10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果取NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈小鼠抗巢蛋白(nestin)、小鼠抗微管蛋白(-βtubu lin)、豚鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及小鼠抗O4免疫化学反应阳性。结论大鼠胚胎脑海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

BDNF、EGFP基因修饰大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞的建立

目的建立脑源性神经营养因子（BDNF）、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞（mNSCs）。方法以FuGENEHD转染试剂介导质粒pcDNA3-BDNF、pEGFPN1共转染第三代E14大鼠胚胎mNSCs。荧光显微镜观察EGFP表达情况；免疫细胞化学方法和Western blot鉴定BDNF的表达；体外诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果基因转染12h后EGFP开始表达：免疫细胞化学、Western blot结果表明BDNF能在细胞中正确表达；体外诱导分化研究表明BDNF、EGFP基因修饰不影响大鼠胚胎mNSCs的增殖与分化。结论成功建立了BDNF、EGFP基因修饰大鼠胚胎mNSCs，可为进一步开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础。     

SD大鼠胚胎神经干细胞分离、培养及鉴定

目的 体外培养并鉴定神经干细胞，为相关实验研究奠定基础。方法 分离SD大鼠胎鼠的间脑，加入神经生长因子EGF和bFGF在神经干细胞条件培养基中克隆培养。用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果 分离培养的细胞具有不断增殖的能力，表达神经巢蛋白（nestin），并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论 成功建立了神经干细胞的分离培养方法，可用于进一步的实验研究。     

大鼠胚胎中脑多巴胺神经元的分离培养与鉴定*

背景：神经细胞移植治疗是最有希望治愈帕金森病的方法之一。 目的：探讨大鼠胚胎中脑多巴胺神经元分离、培养与鉴定的方法。 方法：解剖分离E14d SD大鼠胚胎中脑组织,制备单细胞悬液,以神经细胞培养液培养,观察其生长情况并进行RT-PCR和免疫组织化学鉴定。 结果与结论：在神经细胞培养液中,细胞生长良好。RT-PCR和免疫组织化学结果显示大多数细胞表达多巴胺神经元特异性分子标志。证实实验成功建立了大鼠胚胎中脑多巴胺神经元分离培养与鉴定的方法。     

EGFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的建立增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。方法以质粒pEGFPNl转染培养第三代的大鼠胚胎中脑神经干细胞（mNSCs）,经G418筛选后,分别进行nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后ρ-Ⅲ-／ubulin、GFAP、CNPase免疫细胞化学鉴定。结果EGFP在基因转染12h后开始表达,24h后明显增加,48h达到高峰,经G418筛选1月后有阳性克隆形成,EGFP基因修饰不影响大鼠胚胎mNSCs的增殖与分化。结论成功建立EGFP基因修饰大鼠胚胎mNSCs,为进一步开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础。     

胚胎大鼠神经干细胞的体外培养与鉴定

目的利用无血清培养和细胞克隆培养技术从孕鼠(14 d)胚胎中分离出神经干细胞,并进行传代培养和诱导分化。 方法 采用免疫细胞荧光化学染色方法观察不同代数细胞克隆球中nestin、neuN、GFAP阳性细胞比例,鉴定培养的原代和传代的细 胞类型结果随着传代次数增加,克隆球中nestin阳性细胞的比例无明显变化(P>0．05),不同代数的神经干细胞克隆球诱导分化 后均有一定比例的neuN与GFAP阳性细胞。结论 证实从胚胎大鼠大脑皮层分离培养的细胞是神经干细胞,提示体外培养体系中 培养的神经干细胞可以长期传代并保持于细胞的特性。     

大鼠胚胎神经干细胞两种不同分离、传代方法的比较

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),比较不同分离、传代方法对其生长的影响。方法取怀孕15d的大鼠,分别用机械分离法和含0.01%EDTA的胰蛋白酶消化法分离海马区细胞,均以1×106/mL的活细胞密度接种到无血清的NSCs培养基中培养,分离纯化至P5代。以含10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸的DMEM/F12诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果机械分离组获得的活细胞及培养后的神经干细胞球数目明显多于胰蛋白酶消化组,其细胞贴壁率却高于胰蛋白酶消化组。取神经干细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈Nestin、β-tubulin-Ⅲ、GFAP和O4阳性反应。结论大鼠胚胎海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。机械分离法和胰蛋白酶消化法各有利弊,可以根据实验情况交叉采用两种不同的分离方法,以稳定高效地培养出NSCs。     

胚胎大鼠嗅神经干细胞的培养及分化特性

目的建立胚胎大鼠嗅神经干细胞(NSCs)体外培养方法,研究其增殖和分化特性.方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养胚胎14 d(E14)大鼠嗅球NSCs,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSCs及自然分化为特异性神经细胞的类型,测定NSCs的生长曲线.结果从E14大鼠嗅球分离、培养出表达nestin,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSCs.嗅NSCs的增殖依赖表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF.结论从E14大鼠嗅球培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSCs.     

大鼠胚胎脑皮层神经干细胞的分离和培养

目的探讨分离、培养、纯化大鼠胚胎神经干细胞(neuralstem cell,NSCs)的最佳条件,以获得充足的神经干细胞来源,用于中枢神经系统疾病的治疗.方法分离孕13～15 d胎鼠大脑皮层,在无血清含神经生长因子N2培养液中培养,利用有限稀释法单克隆培养和改良法连续传代纯化并扩增NSCs,免疫组织化学法对NSCs及分化细胞进行鉴定.结果可以通过体外培养获得大量神经源性干细胞,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能.结论NSCs的存活和分裂依赖于神经生长因子和N2添加剂的浓度,胚胎脑组织和神经球分离方法影响NSCs的形成速度和数量.掌握NSCs的体外纯化培养和鉴定手段可为进一步研究NSCs生物学特性及神经系统损伤的治疗提供新方法.     

NGF-β、GFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的建立神经生长因子β（NGFβ）基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。方法以质粒pcDNA3-hNGFb、pEGFPN1共转染大鼠胚胎中脑神经干细胞，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）在细胞内的表达，免疫细胞化学、Westernblot鉴定NGF-β在细胞内的表达。体外诱导分化，免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果GFP在基因转染12h后开始表达，免疫细胞化学、Westernblot结果表明NGF-β能在细胞中正确表达且NGF-β、GFP基因修饰不影响其增殖与分化。结论成功建立NGF-β、GFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。     

成年 SD 大鼠海马齿状回神经干细胞分离培养和鉴定的改良

目的：改良成年SD大鼠神经干细胞分离、培养及鉴定方法,观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点,为后续实验提供细胞。方法从成年SD大鼠分离出完整海马齿状回,采用机械吹打法获得原代细胞,用accutase消化传代,利用cck-8法检测神经干细胞的增殖情况,利用多重免疫荧光细胞化学方法鉴定神经干细胞及其分化细胞。结果机械吹打法可高效获得原代神经干细胞,accutase消化传代更有利于神经干细胞的传代培养,cck-8法简单高效的测定了神经干细胞的增殖,多重免疫荧光创新性的动态展示了神经干细胞经诱导分化后的分化过程。结论改良后的方法可更简单高效的获得和培养出大量细胞,经多重免疫荧光鉴定所分离和培养的细胞是神经干细胞。     

GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的 建立脑源性神经营养因子(GDNF)基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞.方法以RT-PCR扩增GDNF基因编码序列,将其克隆至质粒pEGFPN1构建重组质粒pEGFPN1一GDNF,经酶切鉴定及序列分析后,以FuGENE HD转染试剂介导转染大鼠胚胎中脑神经干细胞.免疫细胞化学、western blot鉴定GDNF的表达,诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经酶切产生650bp和4.7kb的片段,序列分析结果与文献报道一致.免疫细胞化学、western blot表明GDNF基因修饰细胞能正确表达GDNF且基因修饰不影响其增殖与分化.结论建立GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞,为进一步应用其开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础.     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞分离、培养和分化特性

目的建立大鼠神经干细胞（NSCs）分离、培养方法，观察其生长、增殖和分化特点。方法利用无血清培养技术，从新生大鼠海马、室管膜下区分离NSCs，进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定NSCs及其分化结果。结果分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力，原代及传代培养均可形成细胞克隆，克隆中的细胞巢蛋白（nestin）表达阳性，显微镜下观察见典型的干细胞特征，诱导后可分化神经元和星形胶质细胞。结论上法分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs，可诱导分化为终末神经细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法从孕14～16d的大鼠胚胎脑皮质中分离NSC，在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖，并用10％的胎牛血清诱导其贴壁分化，应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、Gale-C免疫荧光染色，对NSC及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代，鉴定为Nestin染色阳性细胞，并可诱导分化为神经元细胞（NSE染色阳性细胞）、星形胶质细胞（GFAP染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Gale-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术，可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NSC。     

胚鼠室管膜及成鼠骨髓神经干细胞分离培养及分化鉴定实验研究

目的 :探寻胚鼠室管膜和成鼠骨髓分离培养神经干细胞 (NSC)的可行性。方法 :将分离的胚脑室管膜组织或成年骨髓细胞分别特殊培养。以细胞克隆及免疫细胞化学方法判断NSC增殖并鉴定NSC、神经元和神经胶质细胞。结果 :两种组织来源细胞在相应培养条件下NSC均有快速增殖。可得到具有长突起并建立有网状联系的神经元及胶质细胞。结论 :由胚鼠室管膜和成鼠骨髓诱导分化NSC是可行的     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

新生大鼠全大脑组织分离诱导分化神经干细胞的体外实验

背景：神经干细胞的供体一般以胎鼠和成年鼠为主，利用细胞培养技术分离步骤较繁琐。 目的：以新生大鼠为神经干细胞供体，拟建立一种较为简便、细胞获得率较高的分离培养方法。 设计、时间及地点：以细胞为对象观察性实验，于2006-10/2007-03在重庆医科大学完成。 材料：新生1~3 d 的Wistar大鼠全大脑。 方法：以胰蛋白酶消化、无血清、悬浮培养原代细胞，并加含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养液诱导其分化。 主要观察指标：应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。应用间接免疫细胞化学染色法鉴定神经干细胞及其分化后神经元和胶质细胞标志蛋白的表达。以BrdU标记神经干细胞，观察其增殖情况。 结果：新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续传代和增殖的能力，能稳定表达神经干细胞特异性巢蛋白。诱导分化后的细胞能表达神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性蛋白。 结论：从新生大鼠脑组织分离培养出的神经干细胞获得率高，保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新和多项分化潜能。     

胚胎大鼠神经干细胞分离培养的实验研究

目的探讨胚胎大鼠神经干细胞的分离培养方法,并对其进行鉴定。方法从胚胎大鼠脑组织中分离神经干细胞,采用无血清培养技术,在生长因子的作用下使其在体外不断增殖克隆,同时利用免疫荧光染色的方法对培养的细胞进行鉴定。结果体外培养的细胞增殖成细胞克隆球并能稳定传代,经鉴定,均为nestin染色阳性细胞。结论利用无血清技术和特定生长因子,可以使来源于胚胎大鼠的神经干细胞在体外扩增并稳定传代。