正常和退变腰椎间盘蛋白质的双向电泳和质谱鉴定

背景:近年来对于退变腰椎间盘组织蛋白质成分改变的研究取得了很大进展,但是对于正常和退变腰椎间盘整体蛋白质成分改变的分离和差异鉴定却鲜见报道.目的:建立正常和退变腰椎问盘蛋白质的双向电泳图谱,鉴定差异表达蛋白,探讨腰椎间盘退变的生物学机制.设计、时间及地点:对比观察,于2007-06/2008-12在南方医科大学病理生理实验室完成.材料:由自愿者提供的正常和退变腰椎间盘组织各6例,年龄21～45岁,其中男9例,女3例;取材范围L3-L5.方法:氯化铯梯度离心去除正常和退变腰椎间盘组织蛋白多糖,通过崮相pH梯度(IPG)等电聚焦和梯度聚丙烯酰胺双向电泳分离蛋白质,分析电泳图像,使用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行分析鉴定.主要观察指标:正常腰椎间盘及退变腰椎间盘组织IPG等电聚焦双向凝胶电泳结果.结果:双向电泳显示正常和退变腰椎间盘蛋白质图谱差异显著,从中选取16个差异明显的位点进行质谱仪分析,确定了6种具有显著性意义的差异蛋白质.结论:双向电泳可有效地分离正常和退变腰椎问盘组织蛋白质,通过质谱仪鉴定可以确定其之间差异蛋白质的性质.     

兔脊髓缺血再灌注损伤与正常组蛋白质组的差异分析

目的建立脊髓缺血再灌注损伤双向凝胶电泳图谱,对照观察蛋白质的差异表达。方法建立脊髓缺血再灌注损伤模型,获取损伤和正常脊髓的蛋白质组双向电泳荧光图谱,观察差异蛋白的不同时间点的变化规律,建立缺血再灌注24 h与正常脊髓蛋白质组的匹配差异图谱,鉴定差异蛋白。结果成功建立损伤和正常的双向电泳荧光图谱和肽质量指纹图谱,比较再灌注损伤24 h组与正常组可检测到46个蛋白差异点,鉴定出10个差异蛋白。结论损伤24 h组较其他组变化明显,与正常脊髓的蛋白质组存在明显差异。     

骨髓白血病细胞蛋白质组双向电泳技术的建立与优化

本研究旨在建立和优化人骨髓白血病细胞蛋白质组双向电泳分析方法，以获得分辨率高、重复性好的图谱。提取骨髓中白血病细胞总蛋白质，以等电聚焦为第一向和垂直SDS-PAGE为第二向分离蛋白，显色后用PDQuest7．4软件分析电泳图谱，比较不同的实验条件对图谱的影响。结果显示：通过优化样品制备和电泳中的实验环节，获得了蛋白点分离清晰的图谱，平均蛋白点数为780±73，重复实验所得蛋白点匹配率为82±5％。结论：成功建立了人骨髓白血病细胞的蛋白质组双向电泳分析方法，该方法适用于后续各亚型白血病比较蛋白组学研究。     

蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质

背景:氧化修饰蛋白质在脑老化及阿尔茨海默病等老年变性神经病的发病机制中扮演着重要角色。蛋白质组学技术可以发现氧化修饰蛋白质,为相关疾病的药物治疗选择新的靶标。目的:建立以双向电泳结合Western blot及生物质谱技术分离、鉴定人脑氧化修饰蛋白质的方法。方法:取3个无神经系统疾患的男性脑组织蛋白,第一向等电聚焦电泳后,固相pH梯度胶条同二硝基苯肼反应,然后行第二向SDS-PAGE电泳。2张相同凝胶中的1张行考马斯亮蓝染色,另1张凝胶上免疫荧光显色。同PVDF膜上显色点相对应的考染凝胶上的蛋白质点即为氧化修饰蛋白质。凝胶蛋白胶内酶解,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱鉴定氧化修饰蛋白质。结果与结论:从提取的脑组织中鉴定出β-肌动蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸甘油酸激酶、1,3-磷酸甘油醛脱氢酶、碳酰还原酶1、磷酸丙糖异构酶、转酮醇酶、丙酮酸激酶、血清白蛋白前体、二氢嘧啶酶相关蛋白质2、热休克蛋白60为氧化修饰蛋白质。说明实验成功建立了用蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质的方法。     

建立人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳的分离体系

背景:双向电泳分离技术是蛋白质组学研究的核心技术之一,但蛋白质样品的分离效果受各种实验条件的影响较大.因此,针对不同来源的蛋白样品进行实验条件的优化可获得具有较高分辨率的双向电泳图谱.目的:拟建立优化的人肾小管上皮细胞株蛋白质组双向电泳分离体系.方法:常规培养人肾小管上皮细胞株HK-2细胞并裂解提取全蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化.等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整.改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色.采集电泳图谱并分析双向电泳图谱中蛋白斑点的数量、图像分辨率及背景条纹的变化.结果与结论:通过对实验条件的筛选和优化,成功建立了具有较高的分辨率和重复性的人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳分离体系.其中,优化后的裂解液配方成分为1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/L Tris,8mol/L尿素,2 mol/L硫脲:采用pH 4～7的IPG胶条;上样方式选择被动的水化上样.等电聚焦过程中使用预设的缓慢升压模式,充分聚焦后选用合适的电压模式进行SDS-PAGE电泳,然后采用改良硝酸银法进行染色,最终获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱.     

蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质

背景：氧化修饰蛋白质在脑老化及阿尔茨海默病等老年变性神经病的发病机制中扮演着重要角色。蛋白质组学技术可以发现氧化修饰蛋白质,为相关疾病的药物治疗选择新的靶标。目的：建立以双向电泳结合Westernblot及生物质谱技术分离、鉴定人腩氧化修饰蛋白质的方法。方法：取3个无神经系统疾患的男性脑组织蛋白,第一向等电聚焦电泳后,吲相pH梯度胶条同二硝基苯肼反应,然后行第二向SDS-PAGE电泳。2张相同凝胶中的1张行考马斯亮蓝染色,另1张凝胶显示免疫荧光盟色。同PVDF膜上显色点相对应的考染凝胶上的蛋白质点即为氧化修饰蛋白质。凝胶蛋白胶内酶解,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱签定氧化修饰蛋白质。结果与结论：从提取的脑组织中鉴定出β-肌动蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、粜糖二磷酸醛缩酶、磷酸甘油酸激酶、1,3一磷酸甘油醛脱氢酶、碳酰还原酶1、磷酸丙糖异构酶、转酮醇酶、丙酬酸激酶、血清白蛋白前体、二氢嘧啶酶相关蛋白质2、热休克蛋白60为氧化修饰蛋白质。说明实验成功建立了删蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质的方法。     

大鼠肾移植蛋白质组学双向电泳技术体系的建立

目的建立优化的大鼠肾移植急性排斥反应异基因移植物蛋白质组学研究双向电泳技术体系。方法利用双向电泳技术研究大鼠同种异基因移植3d、7d后肾脏组织蛋白质,对IPG胶条范围、样品制备、上样量及染色方法进行比较,优化实验条件。结果获得了大鼠肾移植急性排斥反应肾脏组织蛋白质组电泳图谱。结论建立了大鼠肾移植急性排斥肾脏组织蛋白质组学研究地双向电泳技术平台,为其他肾脏病学研究提供了一套切实可行的的技术方案。     

河南食管癌高发区同一患者食管癌手术前后血清蛋白质组变化分析

目的应用双向电泳和质谱技术分析食管癌患者手术前后血清中蛋白质变化情况，寻找用于食管癌早期诊断的特异标志物。方法双向电泳分离正常人及食管癌患者手术前后血清总蛋白，银染显色；ImageMaster2．DE软件分析得到其蛋白表达谱。结果正常人及食管癌患者手术前后血清电泳平均筛选出的蛋白点数目分别为655、662、677；术前组与正常对照组蛋白点的密度和分布差异不明显，术后组与术前及正常组比较发现7个蛋白点存在明显差异：6个蛋白点表达上调，1个蛋白点表达下调。选取其中3个蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定，结果显示此3个点的蛋白分别为血清淀粉样蛋白-A、血清淀粉样蛋白和触珠蛋白。结论血清淀粉样蛋白-A、触珠蛋白等可能与食管癌变和／或肿瘤手术本身有一定的相关性，它们与食管癌变的关系尚需更多的研究来证实；本研究为食管癌血清蛋白质组图谱的建立提供了有益的信息资料。     

吸烟大鼠淋巴细胞蛋白质组的双向电泳分析

目的应用双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)方法分析烟染毒大鼠外周血淋巴细胞蛋白质组表达的改变。方法雄性Wistar大鼠随机分正常对照组和烟染毒组,烟染毒组分小、中、大剂量,分离各组大鼠的外周血淋巴细胞,提取总蛋白,2-DE分离总蛋白,电泳凝胶银染显色,用ImageMaster 2D Platinum软件对获得的蛋白图谱加以分析,寻找差异蛋白点。结果与正常对照组大鼠图谱比较,烟染毒组图谱中与剂量有相关性变化的差异表达蛋白点有10个,其中6个随烟染毒剂量增加表达下降,4个随烟染毒剂量增加表达增强。结论2-DE可以有效分离大鼠外周血淋巴细胞蛋白质,大鼠烟染毒后淋巴细胞蛋白质的表达发生改变。     

人骨肉瘤蛋白质组双向电泳图像分析方法的建立

目的建立和优化人骨肉瘤蛋白质组双向电泳图像分析方法。方法对第一向双向电泳的关键因素与环节(如样品处理、电泳参数和凝胶浓度等)进行一系列优化。进一步采用双向凝胶电泳分离骨肉瘤组和正常组总蛋白质,银染显色,Image Master图像分析系统分析电泳图谱。结果重复性实验结果显示同组样品在3次不同实验中所的蛋白质斑点数目相对标准差。(变异系数平均值%):骨肉瘤组和正常组分别为23.00±10.11、20.33±9.90。(变异系数范围%):骨肉瘤组和正常组分别为3.80-6.89、2.70-6.89。同一蛋白质斑点在3次实验中等电点、分子量的相对标准差分别为8.93%±1.17%,10.16%±2.02%和10.87%±3.86%。获得了优于传统实验方法的分辨率和可重复性的双向凝胶电泳图谱。结论优化的双向凝胶电泳图象分析技术适合于骨肉瘤蛋白质组研究。     

国人胃癌蛋白质组分析中双向凝胶电泳技术建立及优化

目的　初步建立、优化用于胃癌蛋白质组研究的双向凝胶电泳技术和计算机图像分析技术 ,提高其分辨率及重复性 ,得到一种分析胃癌蛋白质组双向凝胶电泳新方法。方法　提取胃癌组织中蛋白质 ,对以固相pH梯度为第一向双向电泳的关键因素与环节 ,如样品处理、电泳参数和凝胶浓度进行一系列优化。进一步采用双向凝胶电泳分离胃癌组和正常组总蛋白质 ,银染显色、图像分析软件分析电泳图谱。结果　重复性实验结果显示同组样品在 3次不同实验中所得蛋白质斑点数目相对标准差 (变异系数平均值 % ) :胃癌组和正常组分别为 2 3.0 0± 10 .11、2 0 .33± 9.90。变异系数范围 (% ) :胃癌组和正常组分别为 3.80～ 6 0 .10、2 .70～ 5 6 .89。同一蛋白质斑点在 3次实验中等电点、分子量的相对标准差分别为 8.76 %± 5 .14 % ,13.0 0 %± 4 .2 2 %和 10 .84 %± 9.16 %。获得了较好的分辨率和重复性的双向凝胶电泳图谱。结论　蛋白质组双向电泳的建立及优化表明适合于胃癌蛋白质组差异表达研究。     

突触蛋白质组学分析中双向电泳技术的优化

背景：双向电泳是突触蛋白质组学分析中最流行最通用的蛋白质分离方法之一.但文献中突触蛋白双向电泳对线性固相pH梯度（immobilized pH gradients,IPG）胶条和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroph-oresis,SDS-PAGE）浓度的选择很多,尚未见统一标准.目的：对突触蛋白双向电泳的IPG胶条和SDS-PAGE凝胶浓度进行优化,以获得高质量的突触蛋白双向电泳图谱.方法：以大鼠海马突触蛋白为试材,比较pH 5.0-8.0与pH 3.0-10.0线性IPG胶条,线性与非线性pH 3.0-10.0IPG胶条,以及单一浓度10％与12％ SDS-PAGE对双向电泳的影响.此外,还使用计算机检索了1989至2013年中国知网及PubMed数据库中关于突触蛋白双向电泳的文献,对文献中选择的IPG胶条、SDS-PAGE凝胶浓度进行了统计和评价,并总结了突触蛋白在不同pH值IPG胶条和不同浓度SDS-PAGE凝胶的双向电泳图谱上的分布特征.结果与结论：结果表明,使用pH 3.0-10.0的非线性胶条及单一浓度10％ SDS-PAGE凝胶进行突触蛋白双向电泳较为适宜,电泳图谱质量好,实验操作便利;同时还推荐合并使用pH 4.0-7.0和pH 6.0-11.0的IPG胶条,以及线性梯度浓度9％-16％ SDS-PAGE凝胶,也适用于突触蛋白双向电泳分析.     

急性脊髓损伤后差异蛋白的表达

背景：在质谱分析中,任何一种同位素标记相对和绝对定量试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比,而在串联质谱中,信号离子表现为不同质荷EL（114—121）的峰,因此可以分析得到相关蛋白质的定量信息。目的：建立大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织差异蛋白质谱,应用同位素标记相对和绝对定量技术联合LC．MS／MS质谱技术从分子水平来探索脊髓差异蛋白的表达情况。方法：取8只SD大鼠,参照Allen’s等方法建立大鼠急性脊髓损伤模型,随机分为脊髓损伤后0h组和8h组,每组各4只。损伤后取脊髓组织,用同位素标记相对和绝对定量技术分析大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织的差异蛋白质。结果与结论：共鉴定到了220个差异表达的蛋白,上调的差异蛋白数是116个,下调的差异蛋白有104个。其中相关神经再生的差异蛋白12个,其中上调的有7个,下调的有5个。提示实验中检测到的多种差异蛋白及表达明显的神经生长因子可能作为急性脊髓损伤的生物标记物或可能作为临床管理监测急性脊髓损伤的损伤进程、靶向治疗及评估疗效的有力证据。     

急性颈髓损伤合并肺部感染的临床研究

目的探讨急性颈髓损伤 (CSCI)患者肺部感染的防治。方法对 1988— 2 0 0 4年住院的 2 78名急性创伤性颈髓损伤患者的资料进行回顾性研究。结果肺部感染是急性CSCI后最主要的肺部并发症 ;在伤后 3— 3 3天胸片证实有肺部感染 ,且均为院内感染 ,菌株以G-杆菌为主 ,主要是铜绿假单胞菌 ;美国脊柱损伤协会评分标准 (ASIA)≤ 6分患者的肺部感染发生率显著高于 >6分者 (P <0 .0 0 1)。结论CSCI患者发生肺部感染与损伤平面和是否为完全性损伤有关 ,院内感染的G-杆菌为主要致病菌。     

脊髓损伤后大鼠骨代谢和骨密度变化

目的:了解脊髓损伤后不同时期大鼠骨代谢和骨密度的变化。方法:60只SD大鼠按体重随机分为6组,对20只大鼠采用脊髓横断法在第10胸椎段横断脊髓制作完全性脊髓损伤模型,分为脊髓损伤6周和12周组;20只在同水平处切断棘突、椎板制作假手术对照组,分为假手术6周和12周组;另20只分为正常6周和12周对照组。分别在脊髓损伤后6周和12周时处死动物。结果:脊髓损伤6周、12周时,脊髓损伤组血Ca较对照组明显升高(P<0.05),碱性磷酸酶和骨钙素则较对照组无明显变化(P>0.05)。脊髓损伤6周时,股骨近端、远端骨密度(BMD)均较对照组显著降低(P<0.001),损伤12周时,除股骨近端、远端外,中段BM D也明显降低(P<0.05)。L5BMD在SCI6周和SCI12周与对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:脊髓损伤6周时,大鼠骨代谢已发生明显改变,骨量出现明显丢失,12周时骨代谢稍有改善,但股骨骨量丢失持续存在。     

急性脊髓损伤后并发重度低钠血症的临床分析

目的:探讨急性脊髓损伤后并发重度低钠血症的临床特点和治疗方法。方法:1997年10月至2005年12月间我科共收治358例急性脊髓损伤患者,其中121例(33.8%)发生低钠血症(血清钠<135mmol/L),对其中8例重度低钠血症(血清钠<120mmol/L)患者资料进行回顾性分析。结果:8例中男5例,女3例,年龄25～51岁,平均36岁,均因车祸或高处坠落致伤,7例为颈脊髓损伤,1例为胸髓损伤,均为完全性脊髓损伤(AsiaA级),2例合并有轻度闭合型颅脑损伤。平均出现低钠血症时间为伤后(5.7±1.8)d,最低血清钠浓度为(111.6±4.0)mmol/L,出现低钠高峰时间为伤后(8.1±2.0)d,低钠持续时间(20.9±5.9)d。8例均给予深静脉插管,行中心静脉压监测。6例经限水、补钠等治疗后低钠血症纠正,2例低钠血症进行性加重,出现呼吸、循环衰竭死亡。2例合并有肺部感染。结论:急性脊髓损伤后早期易并发低钠血症,由于其症状隐匿,常不被重视,一旦出现重度低钠血症,治疗非常棘手,死亡率高。     

急性颈髓损伤并发应激性溃疡的临床处理

目的研究急性颈髓损伤后发生应激性溃疡的机制、相关因素及预防措施.方法回顾性分析8例急性颈髓损伤并发应激性溃疡患者的临床资料.结果5例经保守治疗后治愈,1例手术后治愈,2例因并发呼吸循环衰竭而死亡.结论急性颈髓损伤后发生的应激性溃疡是危重并发症,须早期积极预防.