反义GAcDNA重组质粒的构建及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的 构建含GA反义基因的重组质粒，研究GA反义基因对结肠癌细胞生物学性状的影响，为利用GA反义基因治疗肿瘤提供依据。方法 应用基因重组技术构建含GA反义基因的重组质粒pcDNA3．0／GA，通过脂质体法转染人结肠癌细胞DH5α，MTT法、电镜观察等方法检测GA反义基因对结肠癌细胞生物学性状的影响。结果获得含GA反义基因的pcDNA3．0／GA，转染结肠癌细胞DH5α后，结肠癌细胞生长速度明显减慢，细胞超微结构呈典型的凋亡改变。结论 GA反义基因可抑制肿瘤细胞内GA基因的表达，使细胞内GA活性下降，并导致肿瘤细胞利用Gln障碍，最终使肿瘤细胞生长受抑制。     

shRNA-聚束蛋白基因对人结肠癌细胞SW-480侵袭和凋亡影响的实验研究

目的探究shRNA-Fascin基因对人结肠癌细胞SW-480侵袭和凋亡影响。方法利用慢病毒转染技术,构建Fascin的shRNA干扰表达载体,RT-qPCR和Western blot等方法检测Fascin基因和凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达。Transwell试剂盒检测人结肠癌细胞的侵袭,以及AV-PI试剂盒检测人结肠癌细胞的凋亡。结果shRNA-Fascin载体慢病毒转染效率为95%以上。实验组SW-480中Caspase-3和Caspase-9的mRNA的相对表达量明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组SW-480中Caspase-3和Caspase-9的蛋白相对表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组SW-480细胞侵袭能力明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组SW-480细胞的凋亡率明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论shRNA-Fascin可以明显的抑制人结肠癌细胞SW-480的侵袭,促进人结肠癌细胞SW-480的凋亡。     

人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达

目的:体外构建携带人卵泡抑素基因(FS)cDNA的真核表达载体,并观察其在幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21)中的表达。方法:从新鲜人卵泡抽提液细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增人FScDNA序列,克隆到pMD-18T载体中,构成pMD-FS重组克隆质粒。经测序鉴定后,双酶切得到人FS基因cDNA序列,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-FS重组表达质粒。pEGFP-FS重组表达质粒经酶切和PCR鉴定,通过脂质体2000介导瞬时转染BHK21细胞,并检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达。结果:成功构建pMD-FS重组克隆质粒,FScDNA序列测序结果与GenBank中公布的序列(Genbank NM_013409.1)同源性为100%;成功构建pEGFP-FS重组表达质粒,将其转染BHK21细胞后,观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了人FS的pMD-FS重组克隆质粒和pEGFP-FS重组表达质粒,为进一步研究FS对哺乳动物卵泡发育的影响奠定了基础。     

HBsAg重组腺病毒载体的构建及在树突状细胞的表达

目的构建能高效转导HBsAg基因的重组腺病毒Ad-S,证实其能在小鼠树突状细胞内表达,以用于基因治疗的实验研究。方法应用AdEasyTMXL腺病毒载体系统,首先将HBV S基因克隆到p-shuttle-CMV形成重组穿梭载体,用PmeⅠ酶切使之线性化,电转化到BJ5183-AD-1细胞中形成重组腺病毒Ad-S质粒,后者以PacⅠ酶切线性化,转染到AD293细胞包装为重组腺病毒Ad-S。Ad-GFP或Ad-S以MOI为100转染经GM-CSF、IL-4和TNF-α等细胞因子诱导培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞,用流式细胞仪分析细胞荧光表达,Western blot、RIA和ELISA法检测HBsAg的表达。结果PCR、序列测定和酶切鉴定证明HBsAg重组腺病毒Ad-S构建正确,扩增到的病毒颗粒滴度为108/ml;流式细胞仪分析细胞荧光表达率为(92.93±2.35)%,荧光强度达236.67±45.72;Western blot、RIA和ELISA法均检测到Ad-S转染的树突状细胞能表达HBsAg。结论HBsAg重组腺病毒Ad-S构建正确并能高效转染树突状细胞和表达HBsAg,为进一步研究腺病毒介导HBsAg基因修饰的DC疫苗的免疫治疗作用奠定了基础。     

人乳头瘤病毒重组质粒的构建及蛋白表达

目的 构建重组原核表达质粒获得人乳头瘤病毒18型L1片段(HPVl8LI)活性蛋白。为进一步研制人乳头瘤病毒18型(HPV18)基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板，利用PCR方法扩增HPV18L1DNA片段。将HPV18L1DNA与质粒(pUC19)重组构建重组质粒(pUC19-HPV18L1)。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用质粒(pQE32)做表达载体构建重组质粒(pQE32-HPV18L1)，并用酶切电泳验证。将重组质粒pQE32-HPV18L1转入工程菌(M15)。用酶切电泳验证重组工程菌(pQE32-HPV18L1／M15)正确性。利用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测HPV18L1目的蛋白。采用不同浓度异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)、不同诱导时间来优化HPV18L1目的蛋白表达条件。利用Western印迹检测蛋白质(Western blot)鉴定HPV18L1目的蛋白的特异性。结果PCR扩增DNA片段约为1．7Kb。与预期结果相同。克隆重组质粒pUC19-HPV18L1酶切后显示的酶切图谱与预期相同。而且测序验证插入片段全序列无改变。表达重组质粒pQE32-HPVl8L1酶切图谱亦与预期相同。蛋白表达条件优化结果为1mmol／LIPTG诱导4h后，获得HPV18L1最佳蛋白表达量：SDS-PAGE显示，约63KD处可见目的蛋白带，与预期结果一致。Westem blot鉴定，在约63KD处可见目的条带，与预期结果一致。结论 成功构建表达重组质粒pQE32-HPV18L1并能表达HPV18L1目的蛋白。     

TC-1蛋白高表达对子宫内膜腺癌细胞凋亡的影响

目的 构建甲状腺癌相关基因1(TC-1)基因的高表达真核表达系统pTRE3G-TC-1,获得重组高表达TC-1蛋白的子宫癌细胞株HEC-TC1,检测TC-1蛋白高表达时对子宫内膜腺癌(HEC)细胞凋亡的抑制作用,为进一步对TC-1基因或蛋白功能及药物研究提供良好模型.方法 采用真核表达载体p3FLAG-CMV构建表达TC-1基因的质粒,脂质体法转染HEC细胞,检测高表达TC-1蛋白,然后用同样的基因,构建pTRE3G-TC-1表达载体,转染HEC细胞,经数周筛选,获得稳定高表达TC-1蛋白的单克隆细胞株HEC-TC1,采用流式细胞术检测该蛋白对HEC细胞的凋亡影响.结果 获得了稳定高表达TC-1蛋白的单克隆细胞株HEC-TC1.免疫组化结果显示在子宫内膜癌组织中癌细胞上具有C8ORF4蛋白高表达现象.C8ORF4蛋白在子宫内膜癌细胞中,胞内与核内均有表达,但转染激活后该基因在胞内与核内有更高表达并具有生物活性;检测转染后激活的高表达C8ORF4基因的细胞株HEC-TC1分别在0h、24h、48h与对照组未转染的HEC细胞比较,转染后C8orf4高表达细胞凋亡数显著少于未高表达组,C8orf4基因表达的蛋白对肿瘤细胞凋亡有显著抑制作用.结论 获得高表达TC-1基因的细胞株,检测该基因对HEC细胞的凋亡具有显著抑制作用,C8ORF4基因可能参与调控HEC细胞凋亡过程.     

HBV核心抗原EGFP融合蛋白表达质粒的构建及在Hep G2细胞中的表达

目的探讨采用构建的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白的可行性.方法克隆HBV核心抗原基因进入真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体法转染HepG2细胞后在荧光显微镜下观察增强型绿荧光蛋白表达,并行RT-PCR及细胞免疫组化分析融合蛋白的表达.结果重组pHBc-EGFP质粒可在HepG2细胞内瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白融合蛋白.结论pHBc-EGFP质粒构建成功,增强型绿荧光蛋白的表达可报告HBV核心抗原表达.     

沙眼衣原体ompA基因真核表达载体的构建及在HeLa细胞中的表达

目的　构建沙眼衣原体 (Ct)ompA基因真核表达重组质粒 ,利用脂质体体外转染HeLa细胞 ,为核酸疫苗的研制作准备。　方法　应用PCR技术从D型Ct基因组中扩增ompA全长基因 ,重组入 pUCm -T克隆载体。将pUCm -T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应 ,亚克隆入 pcDNA3 .1真核表达载体的相应位点 ,进行序列分析和酶切鉴定后 ,运用脂质体将重组体 pcDNA3 .1/ompA转染HeLa细胞 ,免疫组化法观察目的基因的表达。　 结果　PCR扩增得到约 1.2kb的特异性ompA基因片段 ;序列测定证实与发布序列一致 ;构建得到真核表达重组体 ;重组质粒pcDNA3 .1/ompA在HeLa表达MOMP。　结论　CtompA基因能够在体外真核细胞中表达 ,为进一步研究CtDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

人SIK2重组质粒的构建和真核细胞转染

目的 构建人SIK2基因真核表达载体.方法 利用PCR扩增目的基因SIK2,PCR产物经纯化后与pC-MV-Tag 2B线性质粒进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂卡那抗性琼脂糖平板;菌落PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆后,抽提质粒,利用Lipofectamnie 2000TM试剂瞬转293T细胞,24 h后,Western Blot方法检测其在真核细胞内的表达.结果 成功构建pCMV Tag-2B-SIK2重组质粒,并在真核细胞内成功表达.结论 SIK2外源表达载体的构建成功,为进一步研究其功能奠定了实验基础.     

重组慢病毒载体介导不同启动子驱动的绿色荧光蛋白在多种(不同)细胞中的表达影响

目的比较不同启动子的慢病毒转导细胞后,在不同细胞系中驱动绿色荧光蛋白表达的效率高低。方法采用3种不同启动子的转移质粒,与包装质粒共转染293T细胞,转染60 h后,收集慢病毒上清。用等量的三种慢病毒液转导5种细胞系(293A、MOLT-4、PC3、DU145及RM1),72 h后,荧光显微镜下观察转导效果;流式细胞仪计数转导效率。结果不同启动子(Ubiquitin,EF1α,CMV)在5种细胞系中驱动绿色荧光蛋白的表达及转导效率不同。在293A和PC3细胞中,CMV为最强启动子,转导率分别为(94.83±2.87)%和(20.90±3.15)%;但在MOLT-4和DU145细胞中,EF1α为最强启动子,转导率分别为(74.27±2.14)%和(25.13±4.95)%;在RM1细胞中,Ubiquitin为最强启动子,转导率为(16.77±0.38)%。结论在慢病毒载体介导基因表达研究中,要考虑选取合理的细胞和启动子以获得高效的转导效率。     

嗜肺军团菌重组蛋白momp-Linker-pip的重组质粒构建及鉴定

目的 利用自带Linker的引物,重组嗜肺军团菌pip和momp基因,构建其重组质粒pET-MLP,以获得其原核细胞表达产物并进行鉴定。方法 首先制备足量的pET-pip、pET-momp以及空质粒pET-32a（+）;通过PCR扩增pip、momp基因,将其定向克隆至pET-32a（+）并进行纯化筛选和鉴定;最后利用含有Linker的引物,将重组质粒pET-pip和pET-momp基因进行连接,完成pET-MLP的构建、筛选和鉴定。结果 利用PCR、限制性核酸酶切电泳进行结果鉴定,于NCBI中将重组质粒的核酸序列与LP1型军团菌的相应序列对比,结果表明其同源性达到98%。结论 实验成功构建、表达了重组质粒pET-MLP,为下一步以重组蛋白MLP作为诊断抗原进行嗜肺军团菌血清学检测奠定了基础。     

核转录因子GATA6和转录激活因子4在结肠癌中的表达及临床意义

目的 探讨核转录因子GATA6蛋白信号传导和转录激活因子4(STAT4)在结肠癌中的表达及与临床特征和预后的关系.方法 选取本院2011年3月-2015年8月收治的156例结肠癌患者为研究对象,收集156份癌组织标本及癌旁组织标本,行GATA6与STAT4蛋白的检测.采用X2检验分析GATA6与STAT4蛋白表达与临床...     

Lipofectamine2000转染psiRNa-STAT3质粒对乳腺癌细胞作用的影响

目的研究Lipofectamine2000转染psiRNa-STAT3质粒对4T1细胞侵袭及凋亡的作用。方法 Transwell小室检测psiRNa-STAT3质粒对乳腺癌细胞侵袭能力影响,Western-blot检测Cyclin-D1、Caspase-3蛋白表达水平。结果 Mock组与Scramble组穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05),psiRNa-STAT3组穿膜细胞数与Scramble组比较差异有统计学意义(P<0.05);western-blot检测Scramble组Cyclin-D1、Caspase-3蛋白表达水平与Mock对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。psiRNa-STAT3组Caspase-3及Cyclin-D1蛋白表达量与Scramble组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 psiRNa-STAT3质粒可能通过下调Caspase-3、Cyclin-D1蛋白表达从而抑制乳腺癌细胞侵袭能力,诱导细胞凋亡。     

研究平足蛋白在结肠癌组织中的表达差异及预后相关性

目的 通过检索Oncomine和GEPIA数据库,研究平足蛋白(PDPN)在结肠癌中的表达水平及临床意义.方法 利用Oncomine数据库分析PDPN在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达差异,并对数据资料进行二次分析,研究其在结肠癌中表达的荟萃分析.GEPIA数据库对结肠癌中PDPN表达进行生存分析.RT-PCR检测结肠...     

绿色荧光蛋白基因与乙肝病毒e抗原基因在家蚕细胞中的表达

用绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｅ抗原基因融合，构建了家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）重组转移载体ｐＢｍＧＨｅ，使融合基因处于多角体基因（ｐｌｈ）启动子控制之下。共转染后得到的重组病毒ｒＢｍＧＨｅ能在家蚕细胞中表达约５０ｋＤａ的ＧＦＰ／ＨＢＶｅ融合蛋白。被感染的细胞在紫外光下发射出美丽的绿色荧光。用ＥＬＩＳＡ检测，ＨＢｅＡｇ抗原活性滴度达到１１２８００。这种既能发射绿色荧光又具有抗原活性的双功能融合蛋白为研制一种新型的发光免疫诊断试剂开辟了一条新路。     

阴道毛滴虫AK基因原核表达质粒的构建及在大肠埃希菌中的表达

目的 构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kinase,以下简称AK)基因原核表达质粒并予以表达.方法 AK DNA的克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AKDNA片段,T4连接酶连接到含有2个酶切位点的原核表达载体PUC18,构建出重组原核表达质粒PUC18-AK,经PCR、酶切鉴定.重组质粒PUC18-AK经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在大肠埃希菌中进行初步表达.结果 AK基因体外扩增产物大小均为690 bp,重组原核表达质粒经PCR及酶切鉴定表明获得正确重组子.在大肠埃希菌中表达出AK蛋白,经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析与理论预测值相符.经蛋白质印迹法(westerm blotting)鉴定具有免疫原性.结论 成功地构建了AK基因原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达了AK蛋白.     

胸腺素α1重组原核表达质粒的克隆及诱导表达

目的：构建胸腺素α1（Tα1）基因的原核表达质粒，并诱导表达。方法：根据Tα1的DNA序列设计引物，采用PCR法扩增Tα1的cDNA，将其克隆入T-vector，形成中介重组体pT—Tα1，再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-3X，构建重组质粒pGEX-3X-Tα1，用内切酶酶切鉴定及DNA测序分析；将pGEX-3X-Tα1转入大肠杆菌，用RT-PCR方法检测宿主菌中Tα1mRNA，经IPTG诱导，用SDS—PAGE检测有无相应大小的Tα1融合蛋白表达。结果：经DNA测序和SDS—PAGE法鉴定，成功构建了Tα1重组质粒基因工程菌，表达和纯化了具有Tα1融合蛋白。结论：构建的Tα1重组质粒基因工程菌，表达和纯化了具有Tα1融合蛋白，为今后的研究打下了基础。     

家兔pEGFP-N1/rCNP质粒的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

[目的]构建真核表达载体pEGFP-N1/rCNP并转染体外培养的人脐静脉内皮细胞,观察CNP基因在其中的表达。[方法]利用RT-PCR方法从家兔腹主动脉组织扩增获得CNP基因全场全长编码区,克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组载体pEGFP-N1/rCNP。利用LipofectaminTM 2000脂质体将重组质粒转染人脐静脉内皮细胞。[结果]重组质粒pEGFP-N1/rCNP构建成功;将其转染人脐静脉内皮细胞,观察到目的基因CNP表达。[结论]成功构建了家兔腹主动脉CNP基因的真核表达载体pEGFP-N1/rCNP,并可转染人脐静脉内皮细胞。     

HO-1真核表达质粒的构建及在肾小管上皮细胞中的表达

[目的]构建HO-1基因真核表达质粒,转染大鼠肾小管上皮细胞,检测其在细胞中的表达效果.[方法]从大鼠肾组织中提取总RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增大鼠HO-1基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,运用脂质体将重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1转染大鼠肾小管上皮细胞,通过RT-PCR和Western blot分析HO-1基因细胞转染及表达的效果. [结果]成功构建了HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1.RT-PCR及Western blot分析显示,HO-1基因能转染大鼠肾小管上度细胞并在细胞内有效表达. [结论]HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1的成功构建及其在肾小管上皮细胞中的有效表达为深入研究其生物学作用奠定了基础.     

LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.