全长型人Smac基因真核表达载体构建及表达

目的 构建全长型(full length,FL)人Smac基因(hSmac)真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中表达.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人宫颈癌细胞株Hela中扩增到Smac CDs基因片段,构建重组真核表达载体peDNA3.1 -FL hSmae.PCR、酶切鉴定重组质粒正确后,通过脂质体介导将其和作为阴性对照的空载体pcDNA3.1 分别转染人肝癌细胞株(SMMC-7721).同时转染含EGFP的质粒pcDNA3.1 -EGFP.利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率.采用RT-PCR、western blot法检测外源基因Smac的表达.结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人Smac基因克隆成功.且鉴定证实真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac构建成功.流式细胞术检测到转染效率高达48%,荧光显微镜下也可见非常明亮的绿色荧光.无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,转染后的细胞中外源基因Smac表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中明显表达,为研究Smac基因在细胞凋亡过程中的调控作用.以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提代基础依据.     

HIV-1 gag/IFNα-2b表达产物的免疫原性研究

目的构建艾滋病病毒核心蛋白（gag）与干扰素（IFNα-2b）融合基因表达质粒,观察其与痘苗病毒共表达的结果,研究其意义。方法利用基因重组技术,将IFNα-2b基因片段插入到gag基因的nt 531位点,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选,挑出重组病毒。经免疫荧光、蛋白印迹分析（Western blot）和斑点酶联免疫（Dot ELISA）鉴定表达产物。结果间接免疫荧光实验显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹实验与Dot ELISA结果均显示,转染重组质粒的细胞裂解物中存在表达的gag/IFNα-2b蛋白。结论成功地构建了重组真核细胞表达质粒,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。     

HIV Ⅰ型外膜蛋白/干扰素A-2b的构建与表达

目的 构建艾滋病病毒外膜蛋白（env）与干扰素（IFNα-2b）融合基因表达质粒，观察其在痘苗病毒中共表达结果。方法 利用基因重组技术，将IFNα-2b基因片段插入到env基因的nt8383位点，经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选，挑出重组痘苗病毒。经免疫荧光、免疫印迹（Western blot）和斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）鉴定表达产物。结果 间接免疫荧光实验结果显示，转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。Westem-blot与Dot-ELISA结果均显示，重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的env／IFNα-2b蛋白。结论 成功地构建了重组真核细胞表达质粒，表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。     

LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.     

表达肺孢子菌p55多表位串联基因腺病毒重组载体的构建

目的构建携带肺孢子菌p55多表位串联基因(p55TAG)的腺病毒重组载体,鉴定其在真核细胞HEK293中的表达情况。方法将人工合成的p55TAG目的片段与腺病毒载体(p HBAd-EF1-MCS-GFP)连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,经Amp抗性筛选得到重组载体p HBAd-p55TAG,将重组载体与腺病毒骨架质粒p BHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)验证转染结果,收集包装成功的病毒进行PCR扩增,扩增产物测序验证,用Western blot检测病毒在感染细胞后的目的蛋白表达情况。结果构建的p HBAd-p55TAG腺病毒重组载体转染HEK293细胞后检测到绿色荧光蛋白表达,包装好的病毒PCR扩增产物测序结果与原始序列一致,Western blot检测结果显示在60 k Da处有成功表达目的条带。结论本研究成功构建了表达肺孢子菌p55多表位串联基因的腺病毒重组载体,并验证其能在真核细胞中有效表达。构建的载体为进一步研究抗肺孢子菌感染疫苗奠定了基础。     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET32_α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32_α(+),构建重组质粒pET32_α-Sj32,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET32_α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为55 ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的23%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32_α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达

目的:体外构建携带人卵泡抑素基因(FS)cDNA的真核表达载体,并观察其在幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21)中的表达。方法:从新鲜人卵泡抽提液细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增人FScDNA序列,克隆到pMD-18T载体中,构成pMD-FS重组克隆质粒。经测序鉴定后,双酶切得到人FS基因cDNA序列,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-FS重组表达质粒。pEGFP-FS重组表达质粒经酶切和PCR鉴定,通过脂质体2000介导瞬时转染BHK21细胞,并检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达。结果:成功构建pMD-FS重组克隆质粒,FScDNA序列测序结果与GenBank中公布的序列(Genbank NM_013409.1)同源性为100%;成功构建pEGFP-FS重组表达质粒,将其转染BHK21细胞后,观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了人FS的pMD-FS重组克隆质粒和pEGFP-FS重组表达质粒,为进一步研究FS对哺乳动物卵泡发育的影响奠定了基础。     

HO-1真核表达质粒的构建及在肾小管上皮细胞中的表达

[目的]构建HO-1基因真核表达质粒,转染大鼠肾小管上皮细胞,检测其在细胞中的表达效果.[方法]从大鼠肾组织中提取总RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增大鼠HO-1基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,运用脂质体将重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1转染大鼠肾小管上皮细胞,通过RT-PCR和Western blot分析HO-1基因细胞转染及表达的效果. [结果]成功构建了HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1.RT-PCR及Western blot分析显示,HO-1基因能转染大鼠肾小管上度细胞并在细胞内有效表达. [结论]HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1的成功构建及其在肾小管上皮细胞中的有效表达为深入研究其生物学作用奠定了基础.     

重组质粒pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG的构建及其在细胞内的表达和定位

目的分别构建先天性长QT综合征(LQTS)相关HERG基因和E637K突变基因与红色和绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-bERG,观察其在细胞内的表达和定位情况。方法将克隆在pcDNA3上的HERG和E637K片段分别亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1上,转染HEK293T细胞,24 h后利用western blot技术和荧光显微镜观察重组质粒蛋白表达和细胞内定位情况。结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误。转染pmCherry-WT-hERG野生型质粒的细胞可以检测到135 kD和155 kD 2条蛋白质条带,而转染pEGFP-E637K-bERG突变型质粒的细胞仅显示1条135 kD蛋白质条带,155 kD处条带缺失。融合蛋白发出的红色和绿色荧光表明,突变型蛋白分布于胞浆中,而野生型蛋白主要位于胞膜上。结论成功构建了pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,为LQTS突变基因的进一步功能研究奠定了基础。     

过表达CHD1L基因对结肠癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的初步探索人CHD1L基因在结肠癌细胞中的生物学功能。方法取肝癌患者手术切除肝癌标本并提取总RNA逆转录为c DNA,扩增CHD1L基因CDS序列,插入p LVX-puro慢病毒质粒,脂质体感染人SW480结肠癌细胞。Puro筛选建立稳定转染细胞株。免疫印迹证实CHD1L基因在SW480结肠癌细胞高效表达。CCK-8方法检测SW480结肠癌细胞增殖,Transwell方法检测SW480结肠癌细胞侵袭和迁移。结果 Western blot证实成功构建p LVX-CHD1Lpuro重组质粒及CHD1L基因成功在SW480结肠癌细胞中高效稳定表达,且CHD1L基因能够促进SW480结肠癌细胞过度增殖、侵袭和迁移。结论过度表达CHD1L基因显著促进SW480结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移。     

GFP-MOMP融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的 构建GFP-MOMP融合蛋白真核表达重组质粒pEGFP／MOMP，利用脂质体体外转染Heb细胞，观察MOIMP在真核细胞中的表达。方法 PCR法从D型Ct基因组中扩增MOMP全长基因，克隆至pEGFP真核表达载体的相应位点，进行序列分析和酶切鉴定后，脂质体介导重组体pEGFP／MOMP转染Heb细胞，荧光显微镜、Western blot鉴定MOMP基因的表达。结果 PCR扩增得到约1．2kb的特异性MOMID基因片段；成功的构建真核表达重组体pEGFP／MOMP；重组质粒pEGFP／MOMP在HeLa表达出约71kDa大小的融合蛋白。结论 GFP-MOMP能够在体外真核细胞中表达，为进一步研究该蛋白的生物学功能及核酸疫苗的制备提供实验依据。     

H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA。方法采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒。双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞。采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达。结果成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白。结论成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒I型Tat真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类免疫缺陷病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Western Blot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,RT-PCR和Western blot方法证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达HIV-1 Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1 Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

刚地弓形虫HSP70真核表达质粒构建及评价

目的构建刚地弓形虫热休克蛋白70(TgHSP70)真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T细胞内获得表达,为制备基因疫苗奠定基础。方法扩增TgHSP70基因,双酶切后与真核表达质粒p3×Flag-CMW-14连接,经酶切、PCR及测序鉴定;脂质体法将重组体转染HEK 293T细胞中,TgHSP70的表达产物通过RT-PCR和western blot在基因和蛋白2个水平鉴定。结果 PCR扩增获得约495 bp的HSP70基因片段,p3×Flag-CMW-14-TgHSP70重组质粒构建成功,经双酶切、PCR及测序鉴定,重组质粒基因序列完全正确;将p3×Flag-CMW-14-TgHSP70转染到HEK 293T细胞中,经RT-PCR检测获得预期大小目的基因条带,Western-blot检测表达产物大小约19 kDa。结论成功构建了真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T正确表达。     

小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白基因真核表达载体的构建及其生物活性的鉴定

目的克隆小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白(CCSP)基因并构建其真核表达重组体,鉴定重组CCSP的生物学活性。方法采用TRIzol法提取小鼠肺组织总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对CCSP基因进行扩增,Bam H I和XhoⅠ双酶切扩增产物与真核表达载体p CDNA3.1(+),酶切产物连接并转化入感受态细胞Trans 5α,阳性重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过DNAfectin 2100 DNA转染试剂将重组质粒转染人胚肾(HEK293T)细胞,采用Western blot法检测表达产物。脂多糖分别刺激转染有p CDNA3.1(+)-m CCSP和p CDNA3.1(+)质粒DNA的HEK 293T细胞,利用磷脂酶A2的水解作用,以掺入大肠杆菌膜的[3H]标记的油酸为酶解底物,检测HEK 293T细胞内PLA2的活力。结果聚合酶链反应结果显示,从小鼠肺组织中扩增出约290 bp的片段。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP构建成功且序列正确。Western blot结果显示,在转染p CDNA3.1(+)-m CCSP的HEK293T细胞中有CCSP蛋白的表达,蛋白质分子量约为10 k Da,而转染空质粒组未见表达。CCSP蛋白可以显著降低脂多糖诱导的HEK 293T细胞内PLA2的活力。结论成功构建了真核表达重组体p CDNA3.1(+)-m CCSP,且重组蛋白CCSP具有生物学活性,为进一步研究其功能奠定了基础。     

psiRNA—hHDEK的构建及其对CasKi细胞生物学特性影响的研究

目的观察DEK基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖、细胞周期及凋亡、衰老的影响,为探索防治人类宫颈癌的新方法提供依据。方法根据siRNA设计原则和Genebank中DEK核苷酸序列,利用软件设计出针对DEK位点的特异性小干扰RNA,克隆至siRNA真核表达载体psiRNA-hHlneo中,应用脂质体介导重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞株,用RT-PCR和Western blot检测转染后DEKmRNA和蛋白表达,转染后48hMTr法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期改变、SA-β-半乳糖苷酶细胞化学染色鉴定细胞衰老。结果转染质粒psiRNA—hHDEK组DEKm RNA及蛋白的表达明显减少（0．28±0．02）,DEK基因沉默后CaSki细胞增殖能力下降,细胞周期阻抑,细胞凋亡率增加,衰老细胞增多。结论成功构建表达DEK siRNA的真核表达质粒psiRNA-hHDEK,并能够有效沉默CaSki细胞中DEK基因表达。DEK基因沉默后能够诱导CaSki细胞凋亡和细胞衰老。DEK基因在宫颈癌发生和演变中发挥重要作用,其既是衰老抑制基因,又是凋亡抑制基因。     

北海道型汉坦病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的 构建北海道型汉坦病毒(HOKV)核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于HOKV的检测及诊断.方法 应用RT-PCR方法扩增HOKVFusong-Cr-247株的NP基因,并将该基因片段克隆到PCR[R]2.1TA载体,转化到One ShortTM TOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用Kpn I和Not I双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast PUUV-S重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后.转化到DH10BacTM E.coli 感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Baemid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h后收获细胞.用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果 实验应用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统,成功构建了含普马拉类汉坦病毒核蛋白基因的重组杆状病毒表达载体.并在昆虫细胞中获得表达.IFA结果显示,感染细胞的胞浆中有亮绿色荧光颗粒,SDS-PAGE和Western blot检测细胞表达产物的50×103(M)的蛋白条带,证实重组病毒感染昆虫细胞后表达了相应的重组核蛋白,与预计的结果相符.并能与抗汉坦病毒抗体结合.结论 成功表达具有HOKV免疫原性及反应性的重组核蛋白,为研制HOKV的诊断试剂奠定了基础.     

增强型绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子包装细胞系的建立及鉴定

目的：建立及鉴定产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的PA317包装细胞系。方法：采用脂质体转染法将pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒转染至PA317包装细胞,分为空白细胞组（未转染组）、pLNCX-EGFP-C1转染组（对照组）、pLNCX-EGFP-C1-hRI转染组（实验组）,每组设3个复孔,转然后用RT-PCR和Western blot方法检测egfp-hRI基因在PA317细胞的表达。结果：RT-PCR和Western blot方法显示,转染后在PA317细胞中检测到egfp-hRI基因表达;用脂质体转染法获得了G418阳性的PA317包装细胞克隆。结论：实验成功建立了产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的PA317包装细胞系,为后续试验奠定了基础。     

Dectin-1融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠Dectin-1融合蛋白真核表达质粒并进行真核表达初步研究.方法 运用RT-PCR技术扩增小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因的细胞外碳水化合物识别域(CRD),与真核表达载体pSecTag2C进行双酶切之后进行连接反应,构建重组融合表达载体,转染入293细胞中,目的 蛋白在细胞培养基中分泌表达,表达产物经蛋白浓缩、纯化后经SDS-PAGE、Western印迹鉴定.结果 获得重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,测序结果 证明质粒DNA序列完全正确,并在转染入293细胞后检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,为进一步纯化蛋白研究真菌检测方法 及Dectin-1与真菌相互作用机制、功能等奠定了基础.     

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。