改良型生物硅胶膜对大鼠神经干细胞增殖与分化的影响

目的观察改良型生物硅胶膜对神经干细胞（NSCs）增殖与分化的影响,为选择NSCs培养载体提供依据。方法选取孕16d胎鼠的大脑皮质作为细胞来源,建立胚胎NSCs的体外培养体系并随机分为观察组和对照组,其中观察组接种于改良型生物硅胶膜上、对照组接种于普通培养皿中。普通倒置显微镜及电镜下观察细胞生长发育形态学变化,免疫荧光染色技术对NSCs及诱导分化细胞进行鉴定,四甲基偶氮唑蓝（MTr）法检测细胞增殖情况。结果培养2d后,显微镜下两组均可见神经细胞球生成,贴壁良好,细胞球边缘有突起呈辐射状向外发出,神经球NSCs特异标志物神经巢蛋白均呈阳性;培养7d后,观察组和对照组贴壁分化的神经元烯醇化酶阳性细胞率分别为25．14％±1．98％、24．67％±2．05％,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率分别为59．48％±2．07％．60．87％±1．08％,组间比较,P均〉0．05;两组生长曲线亦无显著差异（P〉0．05）。结论改良型生物硅胶膜对NSCs的生长、增殖及诱导分化无明显影响,但能促进细胞之间突起的增长,可作为培养载体用于研究力学因素对NSCs增殖、诱导分化的影响。     

脐血单个核细胞体外向神经干细胞的诱导及Foxg1基因的表达

目的探讨人脐血单个核细胞（UBC-MNCs）体外向神经干细胞（NSCs）的诱导分化机制及NSCs中Foxg1基因表达的意义。方法从脐血中分离出UBC—MNCs,用含hEGF、bFGF和B27因子的Neurobasa1培养基联合诱导其向NSCs方向分化,观察NSCs形态学及增殖分化特点;免疫组化法检测培养细胞中神经细胞标志抗原Nestin、NSE、GFAP的表达情况,BrdU标记靶细胞;RT-PCR法检测分离后、培养3、6、9、12d细胞中Foxg1基因的表达。结果UBC—MNCs可定向诱导分化为神经元样细胞,表达Nestin、NSE、GFAP标记抗原。Foxg1 mRNA在诱导前细胞中低表达,诱导后逐渐升高（P〈0．05）,6d达高峰,之后逐渐下降（P〈0．05）。结论体外定向诱导培养可获得UBC-MNCs源性NSCs,Foxg1基因是NSCs增殖分化关键调控因子,脐血可成为NSCs的新来源。     

盐酸法舒地尔对体外培养大鼠神经干细胞分化的影响

目的观察盐酸法舒地尔对体外培养神经干细胞（NSCs）分化的影响。方法体外分离培养NSCs,通过不同浓度的盐酸法舒地尔干预后,采用免疫细胞化学及流式细胞技术检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果分离培养的NSCs具有自我复制、增殖能力,可以表达Nestin;诱导分化后的细胞可以表达NSE和GFAP。免疫细胞化学染色提示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞显著高于对照组（P〈0．05）,但是不同浓度盐酸法舒地尔之间元统计学差异（P〉0．05）。流式细胞仪检测结果显示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞比例明显增加,与对照组相比有统计学差异（P〈0．05）。结论盐酸法舒地尔可以促进NSCs向神经细胞方向分化。     

CCN 3对骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的影响

目的：探讨肾母细胞瘤过度表达基因（CCN3）对骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）向内皮细胞分化的影响。方法：以含50ng/ml血管内皮生长因子培养基诱导 BM-MSCs向内皮细胞分化作为阳性对照组,以含100ng/ml重组CCN3蛋白并50ng/ml血管内皮生长因子培养基诱导BM-MSCs向内皮细胞分化作为CCN3组,并以单纯完全培养基培养BM-MSCs为阴性对照组,采用细胞免疫荧光化学法和半定量逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检查诱导16 d后假性血友病因子（vWF）表达以评价内皮细胞分化,以半定量 RT-PCR法检测 BM-MSCs 诱导分化前后Notch1基因mRNA表达。结果：BM-MSCs 诱导分化16d 后,阳性对照组可见部分细胞 vWF 荧光染色阳性, CCN3组阳性染色细胞明显多于阳性对照组,且 vWF mRNA 表达明显强于阳性对照组[吸光度（OD）值比：（0.550±0.090）比（0.358±0.080）,P＜0.01],阴性对照组未见阳性染色细胞;此外,诱导分化前,三组Notch1基因mRNA均呈低表达,组间两两比较无明显差异（P 均＞0.05）,诱导分化16d后阳性对照组和 CCN3组 Notch1基因 mRNA表达明显强于阴性对照组[OD值比：（0.232±0.047）、（0.352±0.029）比（0.132±0.033）,P均＜0.01],但与阳性对照组相比,CCN3组 Notch1基因 mRNA表达明显更高（P＜0.01）。结论：肾母细胞瘤过度表达基因通过激活 Notch1信号通路可增强骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的能力。     

Notch1蛋白在胚胎干细胞向神经细胞诱导分化过程中的表达及意义

目的探讨胚胎干细胞（ESC）向神经细胞（NC）定向诱导分化过程中跨膜信号分子Notch1蛋白的表达情况及意义。方法体外培养ESC,在培养基内添加5×10^-7mol/L维甲酸（RA）进行诱导分化。分别取ESC及RA诱导分化1、5、9d的细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学、Western Blot法及流式细胞术检测各相应时间点Notch1蛋白的表达。结果随诱导时间延长,ESC分化出的成熟神经元标志微管相关蛋白（MAP-2）阳性神经细胞逐渐增多,并形成较为单一密集的神经网络结构。ESC阶段Notch1蛋白为高水平表达,诱导分化后Notch1蛋白表达随时间延长逐渐下降。结论在ESC向NC的诱导分化过程中,Notch1信号逐渐关闭;Notch1可能对ESC向NC的特异性分化起重要作用。     

微小RNA-449a对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响

目的探究微小RNA(microRNA,miR)-449a通过靶向Notch1调节自噬对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)向神经元样细胞分化的机制。方法人BMSC分为对照组、miR-449a类似物(mimic)组、mimic+Notch1组和Notch1组。通过质粒转染过表达miR-449a和(或)Notch1。qPCR检测miR-449a和Notch1 mRNA。免疫荧光染色检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE),并分析BMSC向神经元样细胞分化情况。Western blot检测Notch胞内结构域(NICD)、酵母ATG6同源物(Beclin1)蛋白水平。结果与对照组比较,mimic组Notch1 mRNA及蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。与mimic组比较,mimic+Notch1组Notch1 mRNA及蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,mimic组NSE和微管相关蛋白2水平明显升高,Notch1组NSE和微管相关蛋白2水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。与mimic组比较,mimic+Notch1组NSE和微管相关蛋白2水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,mimic组NICD和Beclin1水平明显降低,Notch1组NICD和Beclin1水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。与mimic组比较,mimic+Notch1组NICD和Beclin1水平明显升高(1.17±0.12 vs 0.92±0.07,2.38±0.25 vs 1.21±0.11,P0.05)。结论上调BMSC中miR-449a会通过下调Notch1相关通路抑制自噬,促进神经元标志蛋白NSE和微管相关蛋白2表达,使BMSC向神经元样细胞分化。     

糖尿病肾病大鼠肾小球叉头状转录因子O1的表达和作用

目的观察糖尿病肾病大鼠肾小球叉头状转录因子O1（FoxO1）的表达,探讨其与糖尿病肾病发生、发展的关系。方法8周龄健康雄性sD大鼠30只,链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病大鼠模型,采用随机数字表法分为糖尿病组（13只,普通饲料连续喂养4周）和糖尿病肾病组（13只,普通饲料连续喂养12周）。选取健康同龄大鼠18只作为正常对照组（NC组）。4、12周末检测体质量（BW）、血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24h尿蛋白（UPro／24h）及尿白蛋白定量（UAIb）。处死动物后计算肾重指数（KI）;分光光度计测定大鼠肾皮质丙二醛（MDA）含量和总超氧化物歧化酶（SOD）活性;免疫组化法检测肾小球FoxO1蛋白、胶原Ⅳ及纤连蛋白水平;RT—PCR检测肾皮质Fox01mRNA水平;光镜及电镜下观察肾脏组织形态学变化。组间比较采用独立样本t检验。结果糖尿病肾病组肾皮质MDA蛋白、肾小球胶原Ⅳ和纤连蛋白水平显著高于糖尿病组[分别为（3．49±0．31）VS（2．34±0．28）nmol／mgProt,20．1±1．3VS10．1±1．0,10．6±1．3VS6．3±1．0,t值分别为9．290、20．967、9．119,均P〈0．05];糖尿病肾病组肾皮质SOD活性蛋白、Fox01mRNA表达水平明显低于糖尿病组[分别为（23±8）VS（43±6）U／mgProt,0．20±0．06VS0．35±0．05,t值分别为7．069、6．717,均P〈0．05]。FoxO1蛋白表达水平各组问比较无显著差异（均P〉0．05）。结论糖尿病肾病大鼠肾皮质FoxO1 mRNA表达水平降低,其机制可能通过下调其抗氧化靶基因使。肾脏氧化应激反应增强,从而参与糖尿病肾病发生发展的过程。     

脑缺血损伤中Notch信号通路活性的非配体依赖性改变及其作用

目的观察脑缺血损伤Notch信号转导通路的非配体依赖性活性变化及其对缺血损伤的影响。方法建立神经元样PC12细胞氧糖剥夺(OGD)模型模拟脑缺血损伤。OGD 12 h行Notch1-siRNA,实时PCR技术检测Notch1 mRNA表达,Western印迹技术检测Notch1、Notch1胞内段NICD蛋白表达,流式细胞仪检测Notch1-siRNA对缺血损伤细胞凋亡率。结果 OGD组Notch1 mRNA表达较正常对照组显著升高,OGD+Notch1-siRNA组较OGD组显著降低(P<0.05);OGD组Notch1及NICD蛋白表达较正常对照组均显著升高,OGD+Notch1-siRNA组较OGD组显著降低(P<0.05);OGD+Notch1-siRNA组细胞凋亡率较OGD组显著升高(P<0.05)。结论缺血性脑损伤可诱导非配体依赖性的Notch1信号转导通路活化,其可能在脑缺血特定时程发挥抗凋亡脑保护作用。     

叉头状转录因子O1与吡格列酮干预对肝癌HepG-2细胞葡萄糖消耗的影响

目的研究叉头状转录因子O1（FoxO1）及吡格列酮干预对高胰岛素诱导的肝癌HepG-2细胞葡萄糖消耗的影响及机制。方法1×10^-6mol／L胰岛素培养HepG．2细胞24h后,诱发培养基葡萄糖消耗减少建立细胞模型,将细胞分为对照组、空白质粒组、FoxOlsiRNA载体组、1×10^-5mol／L吡格列酮组。以普通培养基培养的细胞作为空白对照组。37℃、5％CO2培养箱中孵育24h,葡萄糖氧化酶法检测培养基中葡萄糖含量,逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测FoxO1mRNA和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）mRNA表达,Westernblot法检测PPAR-γ蛋白表达。将FoxO1mRNA、PPAR-γ mRNA、PPAR-γ蛋白表达与葡萄糖消耗量进行相关分析和曲线拟合。采用单因素方差分析及多样本均数两两比较进行统计学分析。结果高胰岛素培养24h较未诱导细胞培养基的葡萄糖消耗降低[分别为（1．36±0．03）和（2．93±0．05）mmol／L,P〈0．01],细胞Fox01mRNA升高（分别为0．513±0．016和0．425±0．011,P〈0．05）,PPAR-γmRNA降低（分别为0．260±0．025和0．441±0．012,P〈0．05）,PPAR-γ蛋白降低（分别为0．312±0．032和0．600±0．046,P〈0．05）。在抑制FoxO1和吡格列酮干预后此趋势有所缓解,逐渐接近于空白对照组。FoxO1mRNA、PPAR-γ mRNA和PPAR-γ蛋白表达与葡萄糖消耗量高度相关。结论FoxO1表达升高或降低对葡萄糖代谢产生不利影响;增强PPAR-γ表达可有效恢复高胰岛素诱导的高糖,增加肝细胞的胰岛素敏感性。     

叉头状转录因子O1对游离脂肪酸诱导的人肝癌细胞株HepG-2胰岛素抵抗和脂质堆积作用的研究

目的研究叉头状转录因子O1（FoxO1）对游离脂肪酸介导的人肝癌细胞株（HepG-2）胰岛素抵抗和脂质堆积的作用以及对固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）mRNA和蛋白表达的影响。方法将HepG-2细胞培养后用普通培养基培养为对照组,用含5．0×10μmol／L软脂酸的培养基诱导为软脂酸组,诱导后转染空白质粒为空白质粒组,诱导后转染FoxO1siRNA质粒载体为FoxO1siRNA载体组。运用实时定量聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测FoxO1mRNA表达,噻唑蓝（M33＂）比色法检测细胞增殖,葡萄糖氧化酶法检测培养基中葡萄糖消耗量,油红O染色观察细胞脂质堆积;RT—PCR和Westernblot技术分别检测SREBP-1c mRNA表达量以及蛋白的表达量。各组间均值比较采用单因素方差分析,样本间比较采用t检验。结果软脂酸组较对照组细胞葡萄糖消耗量减少（1．174-0．56vsVS4．31±0．21,t=10．587,P〈0．01）、细胞中的脂质堆积增多、FoxO1mRNA升高（0．784-0．10vs0．51±0．12,t=3．629,P〈0．05）、SREBP-1cmRNA升高（0．71±0．17vs0．25±0．08,t=6．290,P〈0．05）、SREBP-1c蛋白升高（0．694-0．10vs0．41±0．07,t=4．797,P〈0．01）。转染FoxO1siRNA质粒载体后葡萄糖消耗量较软脂酸组增加（2．26±0．41vs1．17±0．56,t=3．144,P〈0．05）,FoxO1mRNA、SREBP-1cmRNA、SREBP-1c蛋白的表达较软脂酸组均减少且接近于对照组（分别为0．38±0．06vs0．784-0．10,t=7．164,P〈0．01;0．45±0．13vs0．71±0．17,t=2．479,P〈0．05;0．41±0．06vs0．694-0．10,t=4．797,P〈0．01）,细胞中的脂质堆积也较软脂酸组减少。结论抑制FoxO1的表达,可改善游离脂肪酸诱导的细胞胰岛素抵抗、减少肝脏细胞内脂肪变性,其机制可能是通过下调SREBP-1c的表达。     

A neurosphere-derived factor, cystatin C, supports differentiation of ES cells into neural stem cells

Although embryonic stem (ES) cells are capable of unlimited proliferation and pluripotent differentiation, effective preparation of neural stem cells from ES cells are not achieved. Here, we have directly generated under the coculture with dissociated primary neurosphere cells in serum-free medium and the same effect was observed when ES cells were cultured with conditioned medium of primary neurosphere culture (CMPNC). ES-neural stem cells (NSCs) could proliferate for more than seven times and differentiate into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro and in vivo. The responsible molecule in CMPNC was confirmed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, which turned out to be cystatin C. Purified cystatin C in place of the CMPNC could generate ES-NSCs efficiently with self-renewal and multidifferentiation potentials. These results reveal the validity of cystatin C for generating NSCs from ES cells.     

脑淋巴引流阻断对大鼠蛛网膜下腔出血后神经干细胞增殖、分化和可塑性的影响

目的 探讨脑淋巴引流途径对大鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后神经干细胞增殖、分化和可塑性的影响.方法 采用枕大池内新鲜自体动脉血二次注入法建立成年大鼠SAH模型,用颈淋巴管结扎和颈淋巴结摘除法制作大鼠脑淋巴引流阻断(cerebral lymphatic blockade,CLB)模型.30只大鼠随机分为正常对照组、SAH组和SAH+CLB组(n=10),各组再分为3 d和14 d组(n=5).应用5-溴脱氧脲嘧啶(5-bromodeoxytridine,BrdU)标记增殖的神经干细胞,免疫荧光双重染色检测大鼠皮质、海马和室下区BrdU~+/胶质纤维酸性蛋白(gtial fibrillary acidic protein,GFAP)~+、神经源性分化蛋白(neurogenic differemiation,NeuroD)~+、多聚唾液酸-神经细胞黏附因子(polysialic acid-neural cell adhesion molecule,PSA-NCAM)~+细胞,应用激光共聚焦显微镜观察并计数.结果 与正常对照组比较,SAH组BrdU~+细胞、NeuroD~+/BrdU~+细胞、GFAP~+/BrdU~+细胞以及PSA-NCAM~+/BrdU~+细胞均有不同程度增加(P<0.05或0.01);与SAH组相比,SAH+CLB组BrdU~+细胞、GFAP~+/BrdU~+细胞有所增加(P<0.05或0.01),而NeuroD~+/BrdU~+细胞、PSA-NCAM~+/BrdU~+细胞显著减少(P<0.05或0.01).结论 脑淋巴引流阻断可促进神经干细胞增殖,但不利于神经干细胞向神经元方向分化和可塑性.     

神经干细胞的增殖与分化调控机制

神经干细胞(NSC)是具有高度自我更新能力并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经前体细胞。从胚胎和成年哺乳动物脑内均可分离出NSC。干细胞的增殖和分化受微环境和基因的双重调控,现已发现多种细胞因子和基因可调节NSC的增殖并决定其分化方向。对NSC增殖和分化机制认识的加深将会促进NSC的临床应用。     

胎鼠神经干细胞移植对阿尔茨海默病大鼠海马区的GFAP与S-100β表达的影响

目的探讨胎鼠神经干细胞移植对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马区的GFAP与S-100β表达的影响。方法通过切断Wistar大鼠海马穹窿伞制备AD模型大鼠。我们将大鼠随机分为神经干细胞移植组、生理盐水对照组和正常组。培养胎鼠的神经干细胞,将其移植入AD模型大鼠脑内,并用等量生理盐水脑内注射对比观察。1个月后处死大鼠,进行免疫组织化学实验检测鼠海马区的GFAP与S-100β的表达。结果神经干细胞显示巢蛋白阳性。各组实验鼠海马区有GFAP的阳性表达,生理盐水对照组与其他各组之间有显著差异(P<0.01)。对各组大鼠在海马区均可见棕褐色的S-100β阳性细胞存在,部分细胞呈细胞质性染色阳性。生理盐水对照组AD模型大鼠的海马区切片上可见大量阳性细胞染色,与其他各组比较差异有显著性(P<0.01)。结论神经干细胞移植可以促进AD模型大鼠脑内神经元更好的恢复。     

Melatonin promotes proliferation and differentiation of neural stem cells subjected to hypoxia in vitro

Melatonin, an endogenously produced neurohormone secreted by the pineal gland, has a variety of physiological functions and neuroprotective effects. It can modulate the functions of neural stem cells (NSCs) including proliferation and differentiation in embryonic brain tissue but its effect and mechanism on the stem cells in hypoxia remains to be explored. Here, we show that melatonin stimulates proliferation of NSCs during hypoxia. Additionally, it also promoted the differentiation of NSCs into neurons. However, it did not appear to exert an obvious effect on the differentiation of astrocytes. The present results have further shown that the promotional effect of NSCs proliferation by melatonin involved the MT1 receptor and increased phosphorylation of ERK1/2. The effect of melatonin on differentiation of NSCs is linked to altered expression of differentiation-related genes. In the light of these findings, it is suggested that melatonin may be beneficial as a supplement for treatment of neonatal hypoxic-ischemic brain injury for promoting the proliferation and differentiation of NSCs.     

大鼠脑出血后神经干细胞移植的实验研究

目的探讨脑出血后大鼠胚胎神经干细胞移植治疗的可行性.方法从14d胚龄的大鼠胚胎脑组织中分离、培养神经干细胞,通过荧光免疫组化技术研究其特性.制作大鼠脑出血模型,分别于3d和7 d时将未分化的神经干细胞注入血同侧的尾状核内.分别记录模型制作后2 h和移植后2 h、4周的大鼠运动功能.移植4周后处死大鼠,观察移植后干细胞在体内生长情况.结果实验中分离、培养的神经干细胞体外能够被诱导分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞.出血后7 d干细胞移植组的大鼠运动功能的改善显著好于3 d组和对照组.结论神经干细胞移植治疗能够显著改善脑出血动物的运动功能,是一种很有发展前途的方法,值得进行更深入的研究.     

Histone deacetylase inhibitor but not arsenic trioxide differentiates acute promyelocytic leukaemia cells with t(11;17) in combination with all-trans retinoic acid

Acute promyelocytic leukaemia (APL) with t(11;17)/PLZF-RARalpha responds poorly to all-trans retinoic acid (ATRA) and arsenic trioxide (As2O3), in contrast to APL with t(15;17)/PML-RARalpha. Molecular studies have shown that histone deacetylase (HDAC) recruited by PLZF-RARalpha is associated with the ATRA resistance. Here, we analysed in vitro the differentiation of APL cells with t(11;17) using ATRA, As203, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), HDAC inhibitor trichostatin A (TSA), or combinations of these. Although 1 microM ATRA, which stimulated the differentiation of APL cells with t(15;17), was insufficient to induce differentiation, 3 microM ATRA induced terminal differentiation into granulocytes. As203 alone or in combination with ATRA induced neither differentiation nor apoptosis. However, the combination of TSA and 1 microM ATRA had a potent differentiating effect, although TSA alone had little effect. The combination of 1 microM ATRA and G-CSF did not induce differentiation. These results indicate that APL cells with t(11;17) need a higher concentration of ATRA than those with t(15;17) to differentiate and suggest that HDAC inhibitor is a promising differentiation enhancer in APL with t(11;17).     

Wnt信号通路分子在大鼠神经干细胞分化过程中的表达

目的：观察Wnt信号通路主要分子[β-连环蛋白（β-catenin）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）]在神经干细胞（NSCs）体系的表达及其在增殖和分化过程中的变化,探讨其在神经干细胞分化中可能的调控作用。方法采用原代培养方法,自14～16d大鼠胚胎大脑皮质获得含大量细胞团的NSCs体系。应用含10%胎牛血清培养液诱导NSCs分化。Western印迹检测NSCs在加入胎牛血清12,24,48和72h后,β-catenin与GSK-3β在分化过程中的动态变化。结果免疫细胞化学染色显示NSCs细胞团及散在的单个细胞多呈巢蛋白（nestin）阳性,显示NSCs分化过程中两者存在持续表达,β-catenin分子表达呈现逐渐减少趋势,而GSK-3β分子表达则呈现逐渐增加趋势。结论提示Wnt信号通路与NSCs的增殖和分化过程密切相关,呈现出由活跃到逐步抑制的过程,为研究Wnt信号通路参与NSCs增殖分化调控的机制提供了载体。