稳定转染小鼠IL-17全长基因的结肠癌细胞株的建立及基因转染对C26细胞的影响

目的建立稳定转染小鼠IL-17基因全长的小鼠结肠癌C26细胞株并进行鉴定。方法脂质体法将携带小鼠IL-17基因全长的真核表达载体pc DNA3.1转染小鼠结肠癌细胞C26,经G418筛选出稳定表达IL-17的细胞株,镜下观察细胞形态,RTPCR法、免疫荧光法检测目的基因和蛋白的表达;划痕修复实验检测细胞的迁移能力,MTS法检测细胞体外增殖能力。结果获得1株稳定表达IL-17的C26细胞,C26/IL-17细胞高表达IL-17基因及蛋白,证明该细胞可表达IL-17;IL-17高表达可以增强C26细胞的迁移能力,减弱该细胞的体外增殖能力。结论成功建立了稳定转染IL-17基因的小鼠结肠癌细胞株。     

转染IL-17基因的小鼠结肠癌细胞体内抗肿瘤机制研究

目的:研究IL-17体内抗肿瘤的作用及其机制,为IL-17基因疫苗进入临床提供实验依据。方法:利用已建立的稳定转染小鼠IL-17全长基因的小鼠结肠癌细胞(C26/pc DNA3.1-IL-17)及相应的对照细胞(C26/pc DNA3.1、C26)建立荷瘤动物模型,观察小鼠的成瘤性、肿瘤生长情况及小鼠生存期的变化,检测各组小鼠脾细胞增殖情况、脾NK细胞杀伤活性;及脾淋巴细胞中Th1、Th2、Th17、Treg细胞特征性细胞因子和/或转录因子的表达;检测各组小鼠肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)的增殖反应情况;及肿瘤浸润巨噬细胞中M1特征性细胞因子IL-10和M2特征性细胞因子IL-12的表达。结果:将C26/pc DNA3.1-IL-17细胞接种小鼠体内后,荷瘤小鼠的肿瘤生长速度、体积均明显小于C26/pc DNA3.1细胞组及C26细胞组(P0.05),接种C26/pc DNA3.1-IL-17细胞的雄性小鼠移植瘤明显小于雌性小鼠移植瘤体积(P0.05),各组小鼠生存时间没有明显区别(P0.05);接种C26/pc DNA3.1-IL-17细胞的小鼠脾细胞较接种C26、C26/pc DNA3.1细胞的小鼠脾细胞增殖能力强(P0.05),与正常小鼠脾细胞增殖能力比较无明显统计学差异(P0.05),接种C26、C26/pc DNA3.1细胞的小鼠脾细胞增殖能力较正常小鼠脾细胞增殖能力降低(P0.05);在效靶比为40∶1和20∶1时,接种三种细胞的小鼠NK杀伤率较正常小鼠均降低(P0.05),在效靶比40∶1时,接种C26/pc DNA3.1-IL-17细胞比接种C26、C26/pc DNA3.1细胞的小鼠的脾淋巴细胞的NK杀伤率明显增强(P0.05),效靶比10∶1时,各组之间没有明显统计学差异(P0.05);接种C26/pc DNA3.1-IL-17细胞的小鼠脾淋巴细胞较接种C26、C26/pc DNA3.1的小鼠脾淋巴细胞表达更高水平的IFN-γ(Th1的特征性细胞因子)、IL-4(Th2特征性细胞因子)、GATA-3(Th2特征性转录因子)、ROR-γt(Th17特征性转录因子)、IL-10(Treg特征性细胞因子)mRNA(P0.05);接种C26/pc DNA3.1-IL-17细胞的小鼠TIL较接种C26、C26/pc DNA3.1细胞的小鼠TIL增殖能力强(P0.05),接种三种细胞的小鼠TIL增殖能力较正常组小鼠均降低(P0.05);各组荷瘤小鼠肿瘤浸润巨噬细胞中IL-10和IL-12 mRNA表达在各组荷瘤小鼠之间均无统计学差异(P0.05)。结论:IL-17在小鼠体内具有明显的抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用与增强机体免疫应答有关。     

新型阳离子脂质体制备及其体外转基因特征

背景:阳离子脂质体及胶束、纳米粒等转基因载体是目前非病毒转基因载体领域研究热点;而目前市售转基因试剂盒价格昂贵,并且基本上都是进口商品,如果能够开发一种价廉,转基因效率高,具有自主知识产权的转基因试剂盒将展现广阔市场前景。目的:合成一种新型阳离子脂质复合物,并制备相应阳离子脂质体,对其体外转基因效率进行考察。方法:以1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺、胆固醇、丁二酸酐为原料合成阳离子脂质复合物,采用薄层色谱、红外光谱等方法对产物进行结构表征。然后用薄膜分散法,将适当比例的二油酰磷脂酰乙醇胺和阳离子脂质复合物混合制备成阳离子脂质体,并用其包封含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFPC1,对人宫颈癌Hela细胞株进行体外转染。结果与结论:通过两步法合成了一种全新的阳离子脂质复合物——胆固醇-丁二酸酯-1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺,薄层色谱及红外光谱结果表明合成了预期产物。薄膜分散法制得阳离子脂质体,其中以这种阳离子脂质复合物和二油酰磷脂酰乙醇胺摩尔比为1:1左右所制备的脂质体颗粒较为均匀、细小,形态基本呈圆形。体外对质粒包裹实验结果表明,阳离子脂质体与质粒比为5:3,可完全包封质粒。用该阳离子脂质体对Hela细胞进行转染,24h后,瞬时转染效率达35.6%。从初步实验结果看,所合成的阳离子脂质复合物结构总体与市售阳性成分结构类似,合成方法简单、廉价,体外对质粒DNA有很好包裹性能,细胞毒性低,然而体外对Hela细胞的转染效率还明显偏低。     

稳定表达hTERT/Luc的小鼠黑色毒瘤肺转移模型的建立

目的 建立稳定共表达荧光素酶基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小鼠黑色素瘤B16细胞系,并通过尾静脉注射的方式建立小鼠肿瘤肺转移模型.方法 利用DNA重组技术将hTERT基因和荧光素酶基因Luc定向插入到真核表达载体,构建真核表达质粒pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc,利用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000共转染小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418及潮霉素B加压筛选出稳定转染的细胞株.应用Western blot法及免疫荧光法检测hTERT和Luc基因在B16细胞中的表达;将稳定共表达hTERT和Luc的B16-hTERT/Luc细胞株通过尾静脉注射的方式接种雄性C57BL/6小鼠建立肿瘤肺转移模型,并通过活体成像技术检测小鼠肺部肿瘤的生长.结果 建立了稳定共表达hTERT和Luc的小鼠黑色素瘤B16单克隆细胞株B16-hTERT/Luc,经检测hTERT基因和荧光素酶基因Luc在单克隆细胞株中的表达分别为84％和98％.通过尾静脉注射的方式成功建立了小鼠肿瘤肺转移模型,应用活体成像技术能方便地检测到B16-hTERT/Luc肿瘤在小鼠体内的生长情况.结论 成功建立了可用于活体成像技术检测的稳定表达hTERT的小鼠黑色素瘤肺转移模型.     

不同IL-15转染对NCI-H446 HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ表达及NK敏感性的影响

目的探讨不同形式IL-15基因转染对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446细胞HLA的Ⅰ类和Ⅱ类分子表达及NK杀伤敏感性的影响。方法在本室已构建的3种细胞模型（转染IL-15成熟肽基因的NCI-H446／IL-15mp细胞、转染原型IL-15基因的NCI-H446／IL-15细胞和转染以IL-2信号肽替代IL-15信号肽的改型IL-15基因的NCI-H446／IL-2sp-IL-15mp细胞）基础上,以野生株细胞为对照,流式细胞分析仪（Fluorescence-activated cell Sorter,FACS）分析这3种细胞HLA的Ⅰ类和Ⅱ类分子表达,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定它们对NK杀伤的敏感性。结果野生株NCI-446细胞表面阳性表达HLA的Ⅰ类和Ⅱ类分子;转染IL-15成熟肽基因或改型IL-15基因后,这两种分子的表达均被抑制为阴性;转染原型IL-15基因后,这两种分子的表达均被显著上调。5名不同健康志愿者的外周血单个核细胞（PBMC）对野生株NCI-H446细胞的平均NK杀伤率最低,对NCI-H446／IL-15、NCI-H446／IL-15mp和NCI-H446／IL-2sp-IL-15mp细胞的平均NK杀伤率依次升高。结论转染不同形式IL-15基因对NCI-H446细胞的免疫生物学特性影响不同。转染IL-15成熟肽基因或改型IL-15基因,抑制NCI-H446细胞表面HLA的Ⅰ类和Ⅱ类分子表达;转染原型IL-15基因,上调这两种分子的表达;转染不同形式IL-15基因均可增强NCI-H446细胞对NK杀伤的敏感性,但程度不同;以改型IL-15者最高,IL-15成熟肽者次之,原型IL-15者最低。     

IL-17D 调控肺脏NK 细胞募集及黄芪的促进作用

目的:探讨IL-17D 调控肺脏NK 细胞的募集机制及中药黄芪的促进作用。方法:采用尾静脉注射B16 黑色素瘤细胞建立小鼠肺肿瘤转移模型,分别经IL-17D 或黄芪处理后,应用流式细胞术和RT-PCR 法检测各组小鼠肺脏IL-17D 表达状态及其NK 细胞含量的变化。结果:小鼠肺转移瘤模型中IL-17D 表达水平及其肺脏NK 细胞含量急剧下降,经IL-17D 处理后可明显上调肺脏NK 细胞含量、降低肺脏肿瘤克隆形成。同时,CXCL9、IL-15 等与NK 募集和功能相关的细胞因子表达明显上调。中药黄芪可促进肺脏IL-17D 表达水平,同时上调肺脏NK 细胞含量,抑制肺脏肿瘤克隆的形成。结论:IL-17D 可调控NK 细胞的肺脏募集;中药黄芪可通过上调IL-17D 的表达,从而增强NK 的肺脏募集能力,促进肺脏抗肿瘤免疫效应。     

IL-27活化NK细胞抗肿瘤效应及其机制研究

目的:本文通过研究转染IL-27基因的人食管癌细胞在裸鼠体内的抗肿瘤效应及其对NK细胞表达和功能的影响,旨在探讨其抗肿瘤作用机制。方法:IL-27基因转染的人食管癌细胞(Eca109/IL-27)接种于裸鼠,观察其抗肿瘤效应。用免疫组化法检测移植瘤组织间质中NK细胞浸润数量;ELISA检测脾细胞产生IFN-γ的含量;RT-PCR检测移植瘤组织中IL-12Rβ2、TNF-α和IL-1β基因的表达;LDH法检测NK细胞对其靶细胞K562细胞的杀伤活性。结果:接种Eca109/IL-27细胞荷瘤裸鼠的移植瘤体积较接种野生型Eca109细胞(未转染)和Eca109/LXSN(空载体质粒转染)减小、裸鼠生存期明显延长(P0.05)。接种Eca109/IL-27细胞移植瘤组织中NK细胞浸润数量增多(P0.05),IL-12Rβ2、TNF-α和IL-1β基因的表达水平增高(P0.05)、脾细胞产生IFN-水平增高(P0.05)、NK细胞对其靶细胞K562细胞杀伤活性增强(P0.05)。结论:IL-27在裸鼠体内能够通过活化NK细胞、诱导炎症性细胞因子的产生而发挥抗肿瘤作用。     

小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆小鼠自细胞介素2l(IL-21)基因，构建真核表达质粒，用以进行肿瘤的基因治疗。方法：用RT-PCR法。从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL-21 cDNA。克隆人哺乳动物细胞高效表达质粒pcDNA3．1中，构建重组mIL-21真核表达质粒。重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2／0细胞，用RT-PCR法鉴定转染细胞中IL-21基因的表达，用MTT比色法检测表达的mIL-21诱导的NK细胞杀伤活性的增强。结果：正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，并在转染的细胞中检测出IL-2l的表达，表达的mIL-21可在体外增强NK细胞的杀伤活性：结论：成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，为进一步在肿瘤动物模型中进行IL-21基因治疗及疗效观察奠定了基础.     

附子多糖与阿霉素长循环热敏脂质体的抗肿瘤作用及其机制探讨

目的:观察附子多糖(MPS)与阿霉素(ADM)长循环热敏脂质体(ALTSL)联合靶向治疗荷肝癌H22小鼠的作用,并探讨其抗肿瘤作用机制。方法:以荷瘤小鼠的瘤重为指标,观察药物的抗肿瘤活性。以荷瘤小鼠的存活天数计算生命延长率。以乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞的杀伤活性。以MTT比色法检测淋巴细胞的转化率。以流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡及p53、Fas、FasL和caspase-3的表达。用RT-PCR法测定IL-2mRNA及IL-12mRNA的表达。制作病理切片观察肿瘤、心、肝、肾脏的组织学变化,探讨抗肿瘤机制。结果:MPS ALTSL联合治疗对肿瘤的抑制作用比单一ALTSL靶向治疗更为显著,抑瘤率达80.4%,并可显著延长荷瘤小鼠的存活时间(P<0.01)。与对照组和ADM组比较,ALTSL可使NK细胞的杀伤活性显著增加,而MPS ALTSL则可使NK细胞的杀伤活性和淋巴细胞转化率进一步提高(P<0.01)。应用ALTSL可使脾细胞中IL-2mRNA和IL-12mRNA的表达明显增高;而MPS ALTSL则可使他们的表达进一步增强。病理切片的结果显示,热敏脂质体配合肿瘤局部加热,可使肿瘤细胞凝固坏死。联合应用MPS,可见肿瘤组织中出现大量的淋巴细胞浸润。结论:ALTSL能提高化疗药物ADM的抗肿瘤效果,并降低其心肺毒性,保护机体的免疫功能。MPS ALTSL能进一步诱导肿瘤细胞凋亡,激活并促进T细胞转化和NK细胞的杀伤活性,增强机体的免疫功能,发挥抗肿瘤的协同作用。     

人SCF和IL-15基因共转染NK细胞系生物学特性研究

目的：研究人SCF和人IL-15基因共转染NK细胞系的生物学特性。方法：利用LipofectAMINE^TM将IL-15真核表达载体pcDNA3-hIL-15和SCF真核表达载体pcDNA3-hSCF共转染NK-92细胞，RT-PCR鉴定表达SCF和IL-15的细胞克隆并以SCF依赖细胞株TF-1和IL-15依赖细胞株CTLL-2测定上清活性，MTT法检测增殖和杀伤活性。流式细胞术检测细胞表面分子CD3、CDl6、CD56、CD25、CD48、CD54、CD69和CD95。结果：建立共表达hSCF和hIL-15基因的NK-92S15细胞株，在IL-2培养条件下，其增殖能力表现出更强的聚集趋势，且生长要求有一定的细胞浓度，杀伤活性有不同程度下降。细胞表面分子CD16和CD56没有显著变化，而NK细胞活化相关分子CD25、CD48、CD54和CD95明显降低。结论：可以通过SCF和IL-15基因共修饰NK-92，改变其生物学特性，观察NK细胞活化、杀伤相关分子的特征，使NK细胞系有更深入的研究价值。     

重组质粒pcDNA3.1-IL-15转染对小鼠骨髓DC上表面分子的表达及功能的影响

目的: 探讨重组质粒pcDNA3. 1 IL- 15对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表面共刺激分子的表达及免疫功能的影响。方法: 构建真核表达质粒pcDNA3. 1 IL- 15, 以其转染小鼠骨髓DC。用流式细胞仪检测转染的DC表面CD40、CD80及CD86的表达, 并分析转染的DC刺激脾淋巴细胞中CD4 、CD8 T细胞亚群的变化。用MTT比色法检测转染的DC刺激T细胞增殖的作用。用ELISA法检测T细胞产生IFN- γ的水平。结果: pcDNA3. 1- IL- 15转染的DC表面CD40、CD80及CD86的表达均有不同程度的升高。重组质粒转染的DC可诱导小鼠脾淋巴细胞中CD4 、CD8 T细胞增殖, 但CD4 /CD8 T细胞的比值降低。结论: 重组质粒pcDNA3. 1 -IL- 15转染可提高DC表面共刺激分子的表达并增强其免疫功能。     

IL-15真核表达质粒的构建及对乙肝疫苗诱导的体液免疫应答的影响

目的 研究两种不同的IL-15真核表达质粒对乙肝蛋白疫苗诱导的免疫应答的影响。方法：构建IL-15真核表达质粒(简称pIL-15)和含有IL-12信号肽的IL-15真核表达质粒(简称pIL-2s-15)，CTLL-2细胞增殖实验验证两种质粒真核表达产物的生物学活性。将这两种质粒分别与HBsAg共免疫BALB／C小鼠，用ELISA法检测小鼠血清抗-HBs IgG及IgGl、IgG2a亚类的效价。结果：与HBsAg蛋白疫苗共免疫时，pIL-15可使HBsAg诱导的抗-HBsIgG效价升高，显著高于载体pcDNA3．1与HB—sAg共免疫对照组，pIL-2s-15对HBsAg诱导抗-HBsIgC效价没有明显影响。与HBsAg pcDNA3．1组相比，HBsAg pIL-2s-15组和HBsAg pIL-15组诱生的抗HBsIgG2a亚类均升高，但前者IgG2a／IgG1比值最高，与HBsAg pcDNA3．1组相比差别有显著性；HBsAg pIL-15组IgG2a／IgG1比值与HBsAg pcDNA3．1组相比差别无显著性。结论 pIL-15真核表达质粒可增强蛋白疫苗诱导的体液免疫应答，pIL-2s-15真核表达质粒则主要使免疫应答趋向Th1型。     

HSV-2gD模拟抗原表位、HBsAg与IL-18融合蛋白DNA疫苗的免疫效果观察

目的:研究串联重组核酸疫苗pc(pcDNA3.1)-S(HBsAg)-P6-IL18和pc(pcDNA3.1)-S(HBsAg)-NP6-IL18对机体的免疫效果,P6是我们前期采用噬菌体展示技术筛选出的HSV-2gD的模拟抗原表位,NP6为与HSV-2gD模拟抗原表位P6最相似的天然抗原表位序列。方法:分别将空质粒pcDNA3.1(阴性对照组)和构建的真核表达质粒pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18肌内注射免疫接种BALB/c小鼠3次,每次间隔2周。末次免疫后2周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量;末次免疫后一月,处死小鼠,无菌分离脾脏,用刀豆蛋白A刺激淋巴细胞,采用MTT法测定脾淋巴细胞增殖率。结果:重组核酸疫苗pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18免疫小鼠后可刺激血清特异性抗体(抗HBsAg抗体和抗HSV-2gD模拟表位抗体)的产生,与阴性对照组相比可诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18,可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。结论:重组核酸疫苗pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18能诱导较强的细胞免疫和体液免疫,可用于今后预防HBV和HSV-2感染的研究。     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

乙型肝炎病毒多表位抗原基因真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

将自行设计、合成的乙型肝炎病毒多表位抗原基因BPT ,克隆入真核表达载体pCDNA3 1,构建重组质粒pCDNA3 1/BPT。后者经脂质体法转染小鼠BALB/c 3T3细胞 ,G4 18加压筛选出阳性转染细胞 ,并用间接免疫荧光法鉴定其在小鼠BALB/c 3T3细胞的表达。该重组质粒经胫骨前肌注射小鼠 ,10 0 μg/次每只小鼠 ,间隔 2周加强一次 ,共 3次。免疫诱发了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应 ,并用PCR法在小鼠的心脏、肝脏及肺组织中检测到pCDNA3 1/BPT ,这为研究HBV多表达抗原的核酸疫苗提供了初步的资料     

小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用

目的：对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4（mPNAS-4）进行克隆，构建其真核表达载体，并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达；探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况。方法：用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA，构建重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4；用脂质体将pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞；用RT—PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况；通过MTT、流式细胞术（FCM）及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4，转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调。mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡。结论：mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用。     

mPer2对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖作用的影响

目的:研究mPer2对小鼠黑色素瘤细胞B16增殖作用的影响。方法:将构建好的mPer2全长表达质粒(pcDNA3.1-mPer2)转染入小鼠黑色素瘤细胞B16中,并以pcDNA3.1空质粒转染为对照,通过平板克隆形成实验和MTT法检测两组细胞的增殖情况。结果:平板克隆形成实验和MTT法检测结果均显示Period2转染组小鼠黑色素瘤细胞B16较空质粒对照组明显降低。结论:mPer2的高表达能显著性的抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的生长。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响,探讨基因的生物学功能。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1( )-Biot2,由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞,用Realtime RT-PCR、Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1( )-Biot2,并稳定转染于NIH3T3细胞。与对照组相比,转染了Biot2cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快。结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节,促进NIH3T3细胞的增殖,为进一步研究基因生物学功能奠定了基础。     

膜联蛋白A5重组质粒的构建及其过表达对SiHa细胞增殖的影响

目的 构建膜联蛋白A5(ANXA5)重组质粒并探讨过表达ANXA5对宫颈癌SiHa细胞的增殖产生的影响. 方法 将ANXA5基因克隆入含His标签的pcDNA3.1质粒载体,构建pcDNA3.1-ANXA5重组质粒;用磷酸钙共沉淀法将重组质粒和pcDNA3.1空质粒分别转染宫颈癌细胞系SiHa细胞,G418加压培养,免疫印迹法筛选过表达ANXA5的细胞克隆,免疫组织化学筛选已转染pcDNA3.1空质粒的细胞克隆;将过表达ANXA5蛋白的细胞、载有pcDNA3.1空质粒的细胞以及未处理的SiHa细胞分别进行四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)实验和CCK-8实验检测细胞增殖情况. 结果 成功构建了peDNA3.1-ANXA5重组质粒,测序证实ANXA5基因序列正确;普通未处理的SiHa细胞和转染了pcDNA3.1空质粒的SiHa细胞生长速度较快,两组同无显著性差异(P>0.05);过表达ANXA5的SiHa细胞其增殖速度比前两组显著降低(P<0.05). 结论 膜联蛋白A5可能对宫颈癌细胞系SiHa细胞的增殖具有抑制作用.     

The cytotoxic activity of the phage E protein suppress the growth of murine B16 melanomas in vitro and in vivo

Novel treatment modalities, including gene therapy, are needed for patients with advanced melanoma. The E gene from the phage ϕX174 encodes a 91-aa protein which lyses Escherichia coli by formation of a transmembrane tunnel structure. To evaluate whether this E gene has a cytotoxic impact on melanoma cells in vitro and in vivo, and could therefore be used as a new therapeutic strategy for this tumor type, we selected the B16-F10 murine melanoma cell line as a model. We used a nonviral gene delivery approach (pcDNA3.1/E plasmid) to study the inhibition of melanoma cells' proliferation in vitro and direct intratumoral injection of pcDNA3.1/E complexed with jetPEI to deliver E cDNA to rapidly growing murine melanomas, and found that the E gene has both a strong antiproliferative effect in B16-F10 cells in vitro and induces an efficient decrease in melanoma tumor volume in vivo (90% in 15 days). Interestingly, the GFP-E fusion protein expressed in melanoma cells was located in the mitochondria. In vitro and in vivo analysis demonstrated significant functional and morphological mitochondrial alterations accompanied by a significant increase of cytochrome c and active caspase-3 and -9 in transfected cells, which suggests that tumoral cell death is mediated by the mitochondrial apoptotic pathway. These results show that E gene expression in melanoma cells has an extraordinary antitumor effect, which means it may be a new candidate for an effective strategy for melanoma treatment. Electronic supplementary material  The online version of this article (doi:) contains supplementary material, which is available to authorized users.