Syncytin蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的克隆人syncytin基因并在大肠杆菌中表达,并用表达后的融合蛋白制备syncytin蛋白多克隆抗体。方法 PCR扩增人syncytin基因编码区的DNA片段,将其克隆入原核表达质粒pET30a(+),转化大肠杆菌BL21,诱导产生syncytin-His融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA、Western-Blot和免疫组织化学等方法来检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功表达并纯化了syncytin-His融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白主要以包涵体形式存在;ELISA法测定抗体效价为1:10 000;Western-Blot和免疫组织化学结果显示所制备的抗体能特异性识别syncytin蛋白。结论成功制备和鉴定了人syncytin多克隆抗体,多克隆抗体特异性强和效价高,为下一步研究Syncytin的生物学功能奠定了基础。     

果蝇硒蛋白D-SelK原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码果蝇硒蛋白D-SelK结构基因并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗D-SelK的抗体。方法:利用PCR从pGM-T-D-SelK质粒中扩增D-SelK基因,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-D-SelK,以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,通过变性、电泳纯化D-SelK蛋白,SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定目的蛋白的表达;以表达的D-SelK蛋白免疫家兔,制备抗D-SelK的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了D-SelK基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出目的蛋白,纯化后免疫家兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶51 200以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建D-SelK基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗D-SelK抗体,效价及特异性均良好,这为进一步研究功能特异性的D-SelK提供了有效的手段。     

Rig-I蛋白C端Helicase结构域的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的:为Rig-I蛋白结构与模式识别功能的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测试剂。方法:PCR法克隆小鼠Rig-I基因Helicase区编码序列(726～2240bp,编码241～746位氨基酸),构建带组氨酸标签的原核表达载体pET15b-mRig-I-H,阳性克隆经酶切、测序鉴定后转化E.coliBL21进行诱导表达。目的蛋白电泳分离并割胶纯化后免疫家兔制备抗血清。抗血清用ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法进行鉴定。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,制备的抗Rig-I抗体效价达到1∶100000,Western blot、细胞免疫荧光结果显示该抗体能够有效地对细胞内Rig-I蛋白的表达水平进行检测。结论:成功地对mRig-I-H进行了原核表达、纯化,抗mRig-I-H的多克隆抗体具有较高的特异性,为进一步研究Rig-I尤其是Helicase区的结构与功能奠定了坚实的基础。     

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人白细胞介素18（hIL-18)，制备兔抗人白细胞介素18多克隆抗体，方法：用RT－PCR扩增出hIL-18的cDNA克隆到原核表达载体pJW2中，转化大肠杆菌JM101中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素18免疫新西兰兔制备多克隆抗体，结果：克隆得到序列正确的IL-18 cDNA，与载体连接后转化入大肠杆菌JM101中诱导表达并成功纯化，并用纯化的人白细胞介素18成功制备了兔抗人白细胞介素18多克隆抗体。结论：制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

结核分枝杆菌PPE15蛋白的原核表达、鉴定及其兔多克隆抗体的制备

目的 克隆、表达和纯化结核分枝杆菌脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸15(PPE15)蛋白,制备并鉴定PPE15蛋白兔多克隆抗体.方法 通过PCR从结核分枝杆菌H37Rv株基因组扩增PPE15基因,利用同源重组克隆技术构建原核表达组氨酸标签PPE15蛋白的pET28a-PPE15载体.将pET28a-PPE15转化至大肠杆菌BL2...     

结核分枝杆菌休眠生存调节子蛋白Rv2628的表达、纯化及其兔多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化结核分枝杆菌休眠生存调节子蛋白Rv2628,制备并鉴定其兔多克隆抗体。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,扩增Rv2628基因,构建重组表达质粒,转化至大肠杆菌表达菌株中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)层析柱纯化目的蛋白,以纯化Rv2628蛋白免疫新西兰大白兔获得兔多克隆抗体,分别利用Western blot法和间接ELISA验证多克隆抗体的特异性。结果 成功构建pET-30a-Rv2628重组载体,IPTG诱导后Rv2628蛋白在大肠杆菌主要以包涵体形式表达,Ni-NTA层析柱纯化获得高纯度Rv2628蛋白。免疫兔后获得兔抗Rv2628多克隆抗体具有良好的抗原结合特性,且抗体效价达1∶1 093 500。结论 成功制备高纯度Rv2628蛋白及高效价兔抗Rv2628多克隆抗体。     

QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI-7蛋白,并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法:将成功插入QKI-7编码区cDNA的PET32b( )原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3)感受态细菌,以IPTG诱导6×His-QKI-7融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,应用纯化的融合蛋白,分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以Western blot进行检测。结果:经表达并纯化的QKI-7蛋白纯度达到95%以上,应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度,特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论:成功地表达并纯化了QKI-7蛋白,并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。     

PEG10基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

肝癌是我国主要恶性肿瘤之一,其死亡率在所有肿瘤中居第二位.近年来随着诊疗手段的不断提高,肝癌的预后有所改善,但生存率仍很低.     

Autotaxin多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Autotaxin(58-157位氨基酸)融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotax-in的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58-157)-His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。     

CML66基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:获得原核表达的新的肿瘤抗原CML66蛋白,并制备兔多克隆抗体。方法:采用RT-PCR技术从睾丸中获得cML66的cDNA,亚克隆至pGEMT载体中,经测序确证后,将该基因插入原核表达载体pET32b( )中,通过电穿孔技术转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2 亲和柱层析纯化。通过SDS-PAGE、Westernblot鉴定后,应用纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:获得的CML cDNA序列与GenBank登录的cDNA序列 一致。用纯化的目的蛋白免疫家兔后,获得高滴度的特异性兔抗血清。结论:成功地克隆CML66基因,建立了原核表达、纯化体系。制备纯化的CML66蛋白和高滴度、特异的兔抗血清。     

人Fkbp19的多克隆抗体的制备

目的:制备针对人Fkbp19的多克隆抗体,为进一步研究Fkbp19基因的功能奠定基础。方法:利用鉴定正确的重组原核表达载体pET21a-Fkbp19,在大肠杆菌BL21-DE3中诱导表达,应用Ni-NTA亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白,并免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot及免疫荧光的方法检测抗体对乳腺癌细胞中内源性Fkbp19蛋白的识别能力。结果:成功地在大肠杆菌中实现了His-Fkbp19融合蛋白的表达,经纯化后免疫家兔得到了高滴度的多克隆抗体,该抗体可以用Western blot的方法检测内源性Fkbp19蛋白。结论:所制备的多克隆抗体可以用于Fkbp19的Western blot检测。     

新疆出血热病毒核蛋白多克隆抗体的制备及其免疫学评价

目的 原核细胞中表达、纯化新疆出血热病毒BA88166毒株核蛋白(NP)并制备及鉴定抗NP蛋白的多克隆抗体.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出BA88166毒株S基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-32a上,形成重组原核表达质粒pET-88166S.构建好的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,经镍柱亲和层析法纯化NP-His融合蛋白,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量(Mr).用该纯化蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot法检测血清效价和特异性.结果 双酶切鉴定和DNA测序证实构建的pET-88166S重组表达载体正确,目的基因序列与GenBank中公布的序列一致,在E.coli BL21中表达的NP-His融合蛋白经SDS-PAGE分析,其Mr约为66000.ELISA检测抗体效价高于1:25600,蛋白免疫印迹实验结果表明抗体能特异性识别新疆出血热病毒YL04057毒株的NP蛋白及其截短蛋白.结论 成功获得新疆出血热病毒NP-His融合蛋白,得到了特异性兔抗NP蛋白多克隆抗体.     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

Preparation and application of polyclonal antibody against a recombinant laccase

A laccase gene from Trametes sp. 420 was recombinantly expressed in Pichia pastoris, producing the enzyme rLacD. Six mutant enzymes were produced by site-directed mutation at six potential glycosylation sites in the enzyme rLacD respectively. To probe the mutants with lower activities sensitively and specifically, the antiserum containing specific polyclonal antibodies were prepared by immunizing healthy male rabbits, about 4-month-old and 2 kilogram weight, using pure rLacD as an immunogen. Antibodies were collected after the fifth immunization injection. The antiserum had titres of 1：32 in double immunodiffusion test and of 1：128,000 in enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The results obtained by Western blot analysis showed that the antiserum could react with rLacD and its mutants with highly specific and sensitive affinities.     

人源Nodal成熟肽的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:表达人Nodal成熟肽,免疫小鼠制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达质粒pReceiver-hNodal,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His6-hNodal融合蛋白,融合蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后,回收融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。通过间接ELISA、Westernblot和免疫细胞化学染色和间接免疫荧光等方法检测抗体的效价和特异性。结果:在大肠杆菌中高效表达了与预期理论值大小相符的Mr约13 000的人Nodal成熟肽的融合蛋白,通过免疫小鼠制备的多克隆抗体效价高、特异性强。结论:成功制备了抗人Nodal成熟肽多克隆抗体,为进一步深入研究Nodal在肿瘤发生发展过程中的生物学功能奠定了基础。     

人CD59基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建人CD59真核及原核表达质粒,并制备抗人CD59多克隆抗体,以用于研究糖蛋白CD59生物学功能.方法:用RT-PCR技术从人PBMCs中获取hCD59全长及其胞外区hsCD59 cDNA序列,分别克隆至pVAX-1真核表达载体及pGEX-KG原核表达载体.重组融合蛋白GST-hsCD59由经IPTG诱导的大肠杆菌BL21表达后纯化并鉴定.用pVAX-1-hCD59质粒免疫家兔并用纯化的GST-hsCD59融合蛋白加强免疫制备兔抗人CD59多克隆抗体并测定其效价.结果:成功构建人CD59真核表达质粒pVAX-1-hCD59和原核表达质粒pGEX-KG-hsCD59.融合蛋白GST-hsCD59在大肠杆菌中高效表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值一致.制备的兔抗人CD59多克隆抗体效价为1:3 200.结论:成功地构建了重组真核表达质粒pVAX-1-hCD59及原核表达质粒pGEX-KG-hsCD59,获得了兔抗人CD59多克隆抗体,这将有助于我们深入研究CD59在人类疾病中的生物学功能.     

结核分枝杆菌重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68的表达、纯化与多克隆抗体的制备

目的构建重组质粒pET32a（＋）-cfp-10-esat-6-ppe68,得到重组结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白及兔抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的多克隆抗体,为下-步应用于临床结核病的检测奠定基础。方法将结核分枝杆菌cfp-10-esat-6-ppe68基因转入质粒pET32a,将经PCR、酶切、序列测定鉴定为阳性的质粒转人大肠杆菌DE3,IPTG诱导表达重组蛋白,经亲和层析法纯化重组蛋白后用凝血酶切除载体蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体并进行纯化。结果成功构建重组质粒表达体系pET32a（＋）-cfp-10-esat-6-ppe68,制得去除载体蛋白的高纯度重组蛋白CFP-10．ESAT-6-PPE68,并成功得到高纯度抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6。PPE68蛋白的抗体。结论成功表达结核重组蛋白并制得高纯度多克隆抗体。     

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的：克隆结核杆菌热休克蛋白70(TBhsp70)基因，并在大肠杆菌中表达。方法：利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因，并将其克隆到pUC19中，进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGEX—TBhsp70，在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实，与GenBank公布的序列一致。含pGEX-TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，能够表达相对分子质量(MR)约为96000的融合蛋白。结论：获得了TBhsp70基因，成功地构建了原核表达质粒pGEX-TBhsp70，并在大肠杆菌得到表达，为其相关研究奠定了一定的基础。