检测鼠疫抗体胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立快速、简易的检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析法(G ICA)。方法(1)采用胶体金颗粒标记纯化F1抗原,并将标记物喷于玻璃纤维;同时将纯化F1抗原喷线固定于硝酸纤维素膜上,用于F1抗体的捕捉;按常规组装成检测鼠疫抗体免疫层析试纸条。(2)采用该试纸条与血凝法对同一份兔抗F1抗体进行检测,以评价该试纸条的敏感性。(3)采用该试纸条对44株非鼠疫菌的免疫鼠血清进行检测,以评价该试纸条的特异性。(4)采用该试纸条、血凝法及ELISA对607份血清标本进行检测,以评价该试纸条对现场材料的检测效果。结果(1)该试纸条可在15 m in之内完成检测;(2)在敏感性上,该试纸条对同一份免疫兔血清的检测较血凝法高一个滴度;(3)对被试的44株所选菌株的免疫鼠血清的检测均为阴性;(4)在对607份血清标本的检测中,免疫层析试纸条、血凝及ELISA三种方法的符合率中度,而免疫层析试纸条的敏感性分别比血凝与ELISA高111%和90%。结论以纯化的鼠疫F1抗原为基础建立的G ICA检测鼠疫F1抗体的方法特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有较大的推广应用价值。     

胶体金免疫层析试纸条对云南鼠疫现场材料的检测

目的评价检测鼠疫抗原及抗体胶体金免疫层析试纸条(G ICA及RG ICA)对现场材料的检测效果。方法采用G ICA分别对采自云南省的607份血清标本(查鼠疫抗体)及572份鼠脏器标本(查鼠疫抗原)进行检测,同时以血凝试验(IHA及R IHA)与酶联试验(ELISA及F1-ELISA)作为对照。结果(1)在对607份血清标本的检测中,G ICA、IHA及ELISA三种方法的符合率中度,而G ICA的敏感性比IHA与ELISA分别高111%和90%;(2)在对572份鼠脏器标本的检测中,RG ICA、R IHA及F1-ELISA三种方法的符合率中度,而RG ICA的敏感性比R IHA与F1-ELISA分别高100%和14.3%。结论检测鼠疫的G ICA及RG ICA特异性强、灵敏度高、简便快速,有较大的推广应用价值。     

诊断家畜日本血吸虫感染胶体金免疫层析试纸条的研制

目的 目的 研制一种可用于疫区现场快速诊断家畜日本血吸虫感染的胶体金免疫层析试纸条。方法 方法 设计重组蛋 白G并在大肠杆菌中表达, 得到重组蛋白。对重组蛋白G进行胶体金标记并制备金标垫, 分别用可溶性虫卵抗原 （SEA） 和重组蛋白G划线, 作为检测线和质控线。采用组装的试纸条检测标准阴、 阳性BALB/c鼠与新西兰大白兔血清, 以及粪 检阴、 阳性的绵羊与水牛血清, 评估其灵敏度和特异度; 利用组装的试纸条检测前后盘吸虫病病牛血清, 评价其交叉反应 性。结果 结果 成功构建了重组蛋白G的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达。以重组蛋白G制备的试纸条可用于检测日本 血吸虫感染BALB/c鼠、 新西兰大白兔、 水牛、 绵羊血清抗体。该试纸条检测日本血吸虫感染小鼠与兔血清的灵敏度、 特 异度均为100%; 检测绵羊血清的灵敏度为100%, 特异度为88.46%; 检测水牛血清的灵敏度为94.44%, 特异度为100%; 其与前后盘吸虫交叉反应率为5.88%。结论 结论 成功研制能检测多种家畜血吸虫病的胶体金免疫层析试纸条, 其检测家 畜血吸虫感染的灵敏度和特异度均较高。     

胶体金免疫层析法检测鼠疫F1抗体技术的应用及效果评价

目的研究鼠疫胶体金免疫层析法(GICA)快速检测鼠疫F1抗体技术在鼠疫血清学诊断、监测及流行病学调查中的应用及效果评价。方法应用GICA、双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)对比检测190份啮齿动物血清和11份鼠疫免疫血清中鼠疫F1抗体。结果190份动物血清IHA检测结果均为阴性:GICA检测出1份阳性血清,滴度1:10;DAgS-ELISA检测出3份阳性血清,滴度1:4( ) 2份和1:16( )1份。3种方法检测11份鼠疫免疫血清均为9份阳性,但GICA敏感性低于IHA和DAgS-ELISA (GICA与IHA:t=3．257,P<0．05;GICA与ELISA:t=3．625,P<0．01;IHA与ELISA:t=1.437,P>0．05)。201份血清检测结果,GICA与IHA总符合率99．50％,与DAgS-ELISA总符合率99．00％,3种方法检测结果差异无统计学意义(x2=0．5,P>0．05)。结论GICA检测鼠疫F1抗体敏感特异、简便快速,与DAgS-ELISA同样为鼠疫血清学快速诊断和鼠疫监测中有应用价值的检测技术。     

胶体金免疫层析测试条快速诊断鼠疫应用研究

目的观察胶体金免疫层析测试条快速诊断鼠疫的效果。方法用胶体金免疫层析抗体(抗原)测试条与鼠疫间接血凝试验(IHA)/反向间接血凝试验(RIHA)两种方法平行检测鼠疫的抗体(或抗原)。结果通过对实验感染动物、青海鼠疫疫源地内鼠疫患者(尸体)及染疫动物等396份样品的检测,两种方法符合率为100%。结论胶体金免疫层析法操作简单、方便、快速,适用于现场应用和鼠疫的快速诊断。     

胶体金免疫层析法快速诊断鼠疫的实验研究

目的建立一种快速、简易的检测鼠疫F1抗原的胶体金免疫层析法(GICA).方法采用直径为20nm胶体金颗粒,标记F1单克隆抗体,并将标记物以6μL/cm喷于玻璃纤维;将另1株F1单克隆抗体与羊抗鼠IgG以1μL/cm喷线固定于硝酸纤维素膜上,装配后以4mm/条切割制成免疫层析检测试条.分别用粗制F1抗原和EV菌对该试纸条的敏感性进行测定,同时用44株鼠疫近缘菌及昆明小鼠、黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠的正常血清等标本进行特异性检测.结果本试纸条可在15min之内完成实验,检测粗制F1抗原的浓度可达0.5ng/mL,最小检出EV菌菌量为10万个;本方法的特异性为100%.结论 GICA检测鼠疫F1抗原特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有广泛应用价值.     

胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体

目的建立检测鼠疫耶尔森菌F1抗体的胶体金标记免疫层析方法。方法胶体金标记纯化鼠疫F1抗原,双抗原夹心法原理制成免疫层析检测试纸条,并对兔、羊、人和黄鼠血清进行检测评价。结果用80份不同动物种属的阴性血清进行检测,未出现非特异性反应,对5份恢复期病人血清、13份免疫兔血清和2份免疫羊血清检测也取得阳性结果,对于8份I HA临界阳性(滴度1∶20)的达乌尔黄鼠血清检出阳性6份。结论建立了可以用于现场快速检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析方法。     

胶体金免疫层析法与双单克隆抗体夹心ELISA检测鼠疫F1抗原的比较

目的比较胶体金免疫层析法（GICA）和双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验（DMcAbS-ELISA）检测鼠疫F1抗原的敏感性和特异性。方法用GICA试纸条和DMcAbS-ELISA平行检测308份强毒鼠疫耶尔森菌感染鼠脏器标本和327份对照鼠标本,用RIHA微量法同时检测作为参照。结果327份对照鼠鼠疫细菌学检验及GICA,DMcAbS-ELISA和RIHA的F1抗原检测均为阴性,GICA,DMcAbS-ELISA和RIHA在108cfu/mL水平上未发现与近缘假结核耶尔森菌有交叉反应;308只感染鼠样本细菌培养阳性284只,24只样本未分离到鼠疫菌;F1抗原检测GICA阳性287份,DM-cAbS-ELISA阳性280份,RIHA阳性276份,GICA阳性检出率最高93.19%,与DMcAbS-ELISA和RIHA比较,差异均有统计学意义（χ^2=5.14,9.09;P=0.016,0.001）;GICA与DMcAbS-ELISA符合率97.73%（Kappa=0.845）;GICA和DMcAbS-ELISA与RIHA符合率分别是96.43%和98.70%（Kappa=0.774,0.926）;284份细菌培养阳性鼠标本F1抗原检测GICA阳性率是98.59%,高于DMcAbS-ELISA和RIHA,差异有统计学意义（χ^2=4.17,5.14;P=0.031,0.016）;24份细菌培养阴性实验鼠标本F1抗原检测：GICA检出7份阳性,阳性率29.17%,DMcAbS-ELISA检出6份阳性,阳性率25%,RIHA检出3份阳性,阳性率12.5%,GICA高于DMcAbS-ELISA和RIHA,但差异无统计学意义（χ^2=2.25,0;P=0.125,1.000）。结论GICA检测鼠疫F1抗原敏感特异,快速简便,优于DMcAbS-ELISA和RIHA,是鼠疫快速诊断中有应用价值的检测技术。     

胶体金层析试纸条应用于1起人间肺鼠疫诊断

2004年9-10月,青海省玉树藏族自治州囊谦县发生1起人间肺鼠疫的爆发流行。在此起鼠疫疫情的实验诊断中,除应用常规的间接血凝试验(IHA)和反相间接血凝试验(RIHA)进行血清学诊断外,还结合应用免疫胶体金层析(GICA)技术,对被检材料进行平行检测,现将结果报道如下。1材料与方法1.1检测标本:5例肺鼠疫患者尸体脏器(包括心、肝、脾、肺、骨髓)及7例现患     

一起炭疽疫情中鼠疫F1抗体胶体金检测阳性分析

目的通过对一起人间皮肤炭疽疫情中患者血清鼠疫F1抗体胶体金阳性分析,为鼠疫诊断提供借鉴。方法炭疽疫情处理过程中对患者血清鼠疫F1抗体进行鼠疫间接血凝试验(IHA)和胶体金检测。结果 2名皮肤炭疽患者2份血清鼠疫F1抗体胶体金检测阳性,鼠疫间接血凝检测试验复判结果显示阴性。结论在其他疫情处理过程中排除鼠疫时,应结合患者临床症状、流行病学调查结果及实验室检测结果综合诊断和分析。     

鼠疫F1单克隆抗体的胶体金标记及斑点渗滤法检测F1抗原方法的建立

目的建立斑点渗滤法快速检测鼠疫F1抗原的方法。方法粗提鼠疫F1单克隆抗体,在pH8.2下对其进行胶体金标记,以兔抗F1抗体与金标记的单克隆抗体建立斑点渗滤快速检测鼠疫F1抗原的方法,并对该方法进行特异性与敏感性试验。结果成功建立斑点渗滤法快速检测鼠疫F1抗原的方法,该检测可在15min内完成,敏感性为3.12mg/L,对假结核、小肠结肠炎等近缘菌的特异性实验未发现交叉反应。结论该方法可作为鼠疫快速诊断的手段,但实验敏感性有待进一步提高。     

胶体金免疫层析法检测鼠疫F1抗原的研究

Objective To study the sensitivity and specificity of gold-immunochromatography assay (GICA) for detection of Yersiniapestis(Y. pestis ) F1 antigen. Methods Viscera organ(liver and spleen) specimens of 308 mice with virulent Y. pestis infection and 225 control specimens of rats(217 Spermophilus dauricus, 5 mice,3 guinea pigs) were detected by GICA dipstick with monoclonal antibody against plague F1 antigen (F1MAb).Meanwhile, micro-method of reverse indirect hemagglutination assay(RIHA) and bacteria culture were carried out for parallel testing. Results Bacteriological examination of 225 control specimens, and F1 antigen detected with GICA and RIHA were all negative. No cross-reaction with related Yersinia pseudotuberculosis at 1 x 108 cfu/ml level was found in GICA and RIHA. Detection sensitivity of Y. pestis by GICA and RIHA were 2.5 × 105 cfu/ml and 2.0 × 105 cfu/ml, respectively, and of F1 antigen were 1μg/L and 10 μg/L, respectively. Coincidence was 97.94% (522/533) between GICA and bacteriological test, Kappa = 0.959, and the difference was statistically insignificant(x2 = 0.36, P ＞ 0.05); and 97.94%(522/533) between GICA and RIHA, Kappa = 0.959, with statistically significant difference in the positive detection rates(x2 = 9.09, P ＜ 0.05). Out of the 308 infected mice, 284 were positive of plague bacterial cultured, In 284 samples with positive bacterial culture, there were 280 of positive detected by GICA for F1 antigen, positive rate of F1 antigen was 98.59%, higher than that by RIHA[the positive rate of 96.13%(522/533)], with statistically significant difference(x2 = 5.14, P ＜ 0.05). Sensitivity of GICA was 98.59% (280/284), specificity was 97.19% (242/249), positive predictive value (PPV) was 97.56% (280/287),negative predictive value ( NPV ) was 98.37% (242/246), and Youden index was 0.9578. Conclusions GICA is sensitive and specific, fast and simple in detection of F1 antigen of the plague. It's a valuable detection technique for early and rapid diagnosis of plague.     

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的表位预测

目的预测F1抗原的B细胞表位,为抗F1单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)蛋白B细胞表位研究的可行性方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析F1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测。结果F1蛋白的B细胞表位可能位于第106~132和141~155等区域内。结论预测结果为后续抗F1单克隆抗体的制备奠定一定理论基础,表位预测法有利于我国鼠疫菌B细胞表位研究平台的建立。     

胶体金免疫层析法检测鼠疫F1抗原的研究

目的 研究胶体金免疫层析试纸条检测鼠疫F1抗原的敏感性和特异性.方法通过鼠疫F1抗原单克隆抗体(F1MAb)捕捉F1抗原的胶体金免疫层析(GICA)试纸条,检测308只强毒鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)感染鼠脏器标本和225份对照鼠(达乌尔黄鼠217只,小白鼠5只,豚鼠3只)标本,同时用鼠疫反向间接血球凝集试验(RIHA)微量法和细菌培养做平行检测.结果 225只对照鼠鼠疫细菌学检验及GICA和RIHA的F1抗原检测均为阴性,GICA和RIHA在1×108 cfu/ml水平上未发现与近缘假结核耶尔森菌有交叉反应.GICA、RIHA对鼠疫菌检测灵敏性为2.5×105、2.0×105cfu/ml;检测F1抗原灵敏性为1、10 μg/L.GICA与细菌学检验符合率为97.94%(522/533),Kappa值=0.959,阳性检出率组间比较,差异无统计学意义(x2=0.36,P＞0.05);与RIHA符合率为97.94%(522/533),Kappa值=0.959,阳性检出率组间比较差异有统计学意义(x2=9.09,P＜0.05).308只实验鼠样本细菌培养阳性284只,284份细菌培养阳性标本中,GICA有280份检测阳性,阳性率为98.59%,高于RIHA[阳性率为96.13%(522/533)],两组比较差异有统计学意义(x2=5.14;P＜0.05).GICA的敏感度为98.59%(280/284),特异度为97.19%(242/249),阳性预测值为97.56%(280/287),阴性预测值为98.37%(242/246),Youden指数为0.9578.结论 GICA检测鼠疫F1抗原敏感特异,快速简便,是鼠疫早期快速诊断中有应用价值的检测技术.     

鼠疫耶尔森菌F1抗原免疫Balb/c小鼠方法的研究

目的 观察鼠疫耶尔森菌F1抗原(F1Ag)单克隆抗体制备过程中,F1Ag免疫Balb/c小鼠的免疫剂量和方法,探索操作性强、用时短和免疫效果好的方法.方法 7～9周龄Balb/c小鼠48只,按体质量随机分成6组:150、100、50、25μg组(第1次接种为皮下多点注射,F1Ag分别为150、100、50、25μg,第2、3次接种分别为皮下多点注射和腹腔注射,F1Ag量均为100 μg)、皮下接种组(3次F1Ag接种均采用皮下多点注射,每次100 μg)、腹腔接种组(3次F1Ag接种均采用腹腔注射,每次100 μg),每组8只.首次免疫接种F1Ag+等量弗氏完全佐剂(CFA)的乳化剂;3周后第2次接种F1Ag+等量弗氏不完全佐剂(IFA)的乳化剂;1周后第3次接种F1Ag(不加佐剂);1周后取小鼠尾血,用双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)微量法检测F1抗体.结果 不同剂量(150、100、50、25μg)组小鼠血清F1抗体效价(DAgS--ELISA法:G=12 173.87、13 440.37、15 024.19、4466.72;IHA微量法:G=19 972.32、18 089.40、23 170.47、4871.08)比较,差异有统计学意义(DAgS-ELISA法:F=3.11,P<0.05;IHA微量法:F=4.11,P<0.05).150、100、50 μg组小鼠血清F1抗体效价明显高于25μg组(DAgS-ELISA法:t值分别为2.18、2.39、2.73,P<0.05;IHA法:t值分别为2.54、2.73、3.13,P<0.05).不同接种途径条件下,皮下注射组、腹腔接种组、100μg组小鼠血清F1抗体效价呈渐次增高趋势(DAgS-ELISA法:G=8933.44、9986.16、13 440.37:IHA微量法:G=13 777.25、16 384.00、18 089.40),但差异无统计学意义(F值分别为0.66、0.25,P>0.05).结论 F1Ag免疫小鼠首次皮下多点注射50μg,加强免疫(腹腔注射)100μg,可以缩短整个免疫周期,免疫效果良好,抗体水平较高.     

PCR检测鼠疫菌种中F1抗原基因

目的应用PCR检测试验用EV菌株是否存在caf1基因。方法应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因caf1合成一对引物,进行PCR实验。结果该试验用EV菌株经PCR扩增,呈现一条与caf1基因分子量相吻合的清晰目的扩增带。结论该试验用EV菌株未缺失产生F1抗原的基因,可以用于提取F1抗原等试验。     

酶联免疫吸附试验检测大沙鼠心血冲洗液中鼠疫F1抗体的可行性分析

目的 分析酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大沙鼠心血冲洗液鼠疫F1抗体的可行性及其在鼠疫监测工作中的应用价值.方法 2007年,在准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地,采用弓形夹捕获大沙鼠.取大沙鼠血清、心血冲洗液和肝脾浸液,用ELISA法检测鼠疫F1抗体的阳性检出率和阳性滴度.数据处理用SPSS 17.0.结果 大沙鼠鼠疫F1抗体的阳性检出率与平均阳性滴度,血清分别为12.35%(20/162)和2535;心血冲洗液分别为10.49%(17/162)和23.75,肝脾浸液分别为6.79%(11/162)和2240.血清鼠疫F1抗体的阳性检出率与心血冲洗液比较,差异无统计学意义(χ2=1.333,P＞0.05),与肝脾浸液比较,差异有统计学意义(χ2=7.111,P＜0.0l);心血冲洗液与肝脾浸液比较,差异有统计学意义(χ2=6.250,P＜0.05).鼠疫F1抗体平均滴度,血清与心血冲洗液和肝脾浸液比较,差异有统计学意义(t值分别为2.290,3.612,P＜0.05或＜0.01).鼠疫F1抗体阳性符合率,血清与心血冲洗液为85.0%(17/20),与肝脾浸液为55.0%(11/20);心血冲洗液与肝脾浸液为64.7%(11/17).结论 ELISA法能检测到鼠心血冲洗液中鼠疫F1抗体,在鼠疫监测中,利用鼠心血冲洗液测定鼠疫F1抗体具有可行性.

Abstract：

Objective To analyse the feasibility of detecting F1 antibody to Yersinia pestis in flushing fluid of heart blood of Rhombomys opimus with enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) method and its application value in surveillance of the disease. Methods Serum, flushing fluid of heart blood and infusion fluid of liver and spleen of Rhombomys opimus, which were caught by capture in the plague focus of Zunger basin in 2007, were taken to carry out detection for F1 antibodies to Yersinia pestis with ELISA method. The data were processed with SPSS 17.0. Results Positive rate and average titer of serum were 12.35%(11/162) and 25.35, of flushing fluid of heart blood were 10.49%(17/162) and 23.75 and of the infusion fluid of liver and spleen 6.79%(17/162) and 2240,respectively. No statistical difference was found in positive detection rate when it was compared between serum and flushing fluid of heart blood(χ2 = 1.333, P ＞ 0.05), but it was obviously different between serum and infusion fluid of liver and spleen(χ2 = 7.111, P ＜ 0.01 ) and between flushing fluid of heart blood and infusion fluid of liver and spleen(x2 = 6.250, P ＜ 0.05). There was a significant difference in average titer between serum, flushing fluid of heart blood and infusion fluid of liver and spleen(t = 2.290, 3.612, P ＜ 0.05 or ＜ 0.01 ). The plague F1 antibody positive coincidence rate of serum and flushing fluid of heart blood was 85.0%(17/20), of serum and infusion fluid of liver and spleen was 55.0% (11/20), and of flushing fluid of heart blood and infusion fluid of liver and spleen was 64.7%(11/17). Conclusions The ELISA method can detect Fl antibody in flushing fluid of heart blood,and the method is feasible in plague surveillance.