非整合型质粒重编程脐带血CD34~＋细胞形成诱导性多潜能干细胞的研究

本研究探索和优化非整合质粒的方法,将人脐带血来源的CD34＋（CB CD34＋）细胞进行重编程,建立无病毒的iPS技术体系。利用细胞核转染仪将质粒pEB-C5和pEB-Tg转入短暂培养后的CB CD34＋细胞中,使其进行重编程形成iPSC,14 d后观察到2×106CB CD34＋细胞中约有200个类似ES细胞特征的克隆出现,并对产生的iPSC进行体内外多能性鉴定及细胞核型检测。结果表明,重编程后的CB CD34＋细胞的多能性基因表达与ESC类似,细胞核型正常,外源基因无插入,且具有体内分化成三胚层的全能性。结论：利用非整合型质粒的方法重编程CB CD34＋细胞形成iPSC,该方法无外源基因插入、重复性好、操作简单、且效率较高,为建立相对安全的iPSC提供了一个行之有效的途径,为深入探索iPSC应用于临床药物的筛选、组织工程和再生医学研究等提供了很好的研究材料。     

细胞重编程前后基因组的动态稳定性

背景：研究表明,人类早代诱导多能性干细胞发生拷贝数变异多于晚代、体细胞及人类胚胎干细胞。目的：分析重编程过程是否危及基因组稳定性,进一步探讨诱导多能性干细胞建系的有效性。 方法：利用高分辨率的Affymetrix Cytoscan HD芯片检测遗传性癫痫先证者的体细胞及早代诱导多能性干细胞,分析重编程后基因组拷贝数变异及杂合性缺失的变化。 结果与结论：与遗传性癫痫患者体细胞相比,其早代诱导多能性干细胞的杂合性缺失未发现明显差异,而存在更多的拷贝数变异,且均为微重复,涉及致癌基因。结果证明重编程过程中基因组稳定性动态变化,需要动态监测诱导多能性干细胞保证其基因组稳定性及临床安全性。     

建立非基因整合原发性骨髓纤维化诱导性多能干细胞株

目的:利用诱导多能性干细胞(iPSC)技术建立原发性骨髓纤维化(PMF)诱导多能性干细胞系,为研究血液病的发生发展提供一个实验模型。方法:采用非基因整合型质粒重编程携带JAK2V617F突变的PMF患者骨髓来源的单个核细胞,诱导生成该患者特异的iPS细胞株。结果:采用此方法建立的iPS细胞株,在体外能够稳定传代,无外源性基因整合,多能性基因表达水平与人胚胎干细胞类似,在体内具有形成三胚层结构的能力。测序结果显示,所建立的患者的iPS细胞株携带不同负荷的JAK2V617F突变。结论:成功地建立非基因整合的PMF患者特异的iPS细胞株,这为研究PMF的发病机制、化疗药物筛选及实现精准化治疗提供了一个重要的疾病模型。     

再生医学研究新进展：DNA甲基化与细胞重编程

背景：使用一些生长因子能使终分化的体细胞重编程而产生多能性干细胞。目的：讨论表观遗传机制在细胞重编程和调节中的作用,揭示表观遗传基因调控的变化、表观遗传修饰标记的稳定性及其对基因组表达的影响。方法：在PubMed数据库及CNKI数据库,以＂DNA甲基化,细胞重编程,干细胞＂为关键词检索1990/2008相关的文章。结果与结论：尽管在体内细胞分化通常是单向和不可逆的,但这个过程可被重编程而改变。使用一些生长因子能使终分化的体细胞重编程而产生多能性干细胞。目前为止,导入转录因子、DNA去甲基化、表观基因改变已被用于诱导重编程。通过了解其分子机制,揭示表观遗传基因调控的变化、表观遗传修饰标记的稳定性及其对基因组表达的影响,对基因治疗的发展有重要意义。然而依然许多问题有待深入研究,如：是AID还是DNA去甲基酶对DNA去甲基化起重要作用？DNA去甲基化需要什么条件？肿瘤细胞中CpG片段能否去甲基化,癌细胞是否更难重编程？     

诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了 Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断 ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在 OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34＋造血祖细胞。     

CLCN2基因突变者尿液来源诱导多能干细胞的构建及定向分化神经细胞

目的建立和鉴定CLCN2基因突变患者尿液来源特异诱导多能干细胞(iPSC),并初步探讨其神经分化能力。方法收集临床上1例CLCN2基因突变患者尿液细胞,将表达重编程因子OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT的附加型载体通过电转染导入尿液细胞,使其重编程为iPSC,并继续诱导其神经分化。通过Sanger测序、核型鉴定、免疫荧光、逆转录PCR、畸胎瘤实验及定向分化等评价干细胞和神经细胞特性。结果电转后部分尿液细胞发生形态改变,形成边界清楚的致密细胞克隆团;这些克隆状生长的细胞可以连续传代,具有正常核型,含有CLCN2基因无义突变,表达多能干性标记且无外源基因;裸鼠体内形成三胚层畸胎瘤;体外可定向诱导分化为神经干细胞和星形胶质细胞。结论 CLCN2基因突变患者尿液细胞可重编程为iPSC,并可体外分化为神经细胞,可为CLCN2基因突变相关疾病的研究提供重要材料。     

诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的生物学特性

目的:利用外周血单个核细胞获得诱导多能干细胞(iPSC)并进一步诱导分化为间充质干细胞(MSC),观察iPSC来源MSC的生物学特性,并与其他来源MSC的相关生物学特性进行对比。方法:获取外周血单个核细胞并使用仙台病毒载体对其进行重编程因子的转导,鉴定其细胞形态和多能性因子的免疫荧光表达水平。对1株完成所有鉴定的iPSC进行MSC的诱导分化,并利用免疫组织化学和流式细胞术对其细胞形态、免疫表型进行鉴定。使用成脂、成骨培养液进行成脂成骨的诱导分化,以鉴定其分化能力。利用PCR鉴定其转录因子的表达,以系统阐明iPSC诱导分化所得的MSC的生物学特性。结果:外周血单个核细胞经过携带重编程因子的仙台病毒转染后,命运发生转归。通过启动干性基因表达,成功地获得iPSC克隆,经扩增、纯化,最后获得了可稳定增殖的iPSC。免疫荧光定位证明,其多能性因子分别在胞膜和胞内得到表达。经鉴定,利用iPSC诱导获得了间充质干细胞,其形态与其它来源的MSC一致,免疫表型检测也相符。iPSC-MSC的成脂成骨诱导分化与UC-MSC结果一致,表明iPSCMSC具有分化(成脂成骨)能力,也表明了其具备MSC的多项基本特征。RT-PCR检测显示,iPSC-MSC高表达PDL1,低表达A20;其STAT3表达水平与BM-MSC相当,但高于UC-MSC;而HIF1α的表达水平与UC-MSC相当,但低于BM-MSC。结论:外周血单个核细胞在携带重编程因子的仙台病毒载体的转导后,成功地启动了细胞的干性表达,获得了具有多能干性的iPSC。iPSC可成功诱导分化为MSC,且分化后的MSC具备标准的MSC形态、免疫表型和分化能力。iPSC来源的MSC与脐带MSC相比,高表达免疫抑制分子PDL1并低表达A20等转录因子,提示iPSC来源细胞在细胞增殖和免疫调节等方面具有不同的生物学特性。     

诱导性多能干细胞诱导效率和方法的研究进展

背景：将多能性基因导入人或动物成体细胞内,使其重编程为具有发育多潜能的干细胞,这类细胞被称为诱导性多潜能干细胞或诱导性多能干细胞。目前,有关诱导性多能干细胞的研究进展非常迅速。目的：综述诱导性多能干细胞在转化效率及优化诱导方法等方面的研究进展。方法：应用计算机检索Medline数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Pubmed）,检索时间范围为2006-01/2010-07,检索词为＂induced pluripotent stem cells＂,限定文章语言为English。共检索1831篇文献,选用其中57篇进行综述。结果与结论：诱导性多能干细胞的研究对生命科学产生了十分重大而深远的影响,成为干细胞领域新的研究热点,并在细胞重编程机制、诱导效率的提高、诱导方法的改进、细胞来源的扩大及向功能细胞的分化等方面取得了许多重要的进展。这些研究成果为最终的诱导性多能干细胞技术应用于临床细胞替代治疗奠定基础。     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.     

诱导性多能干细胞技术的研究进展及其应用前景

在分化的体细胞中表达转录因子可以诱导体细胞重编程,获得诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）.这些细胞具有不断的自我更新能力和多向分化潜能,这些细胞重编程领域的突破性研究进展,为细胞重编程机制、人类疾病发病机制的研究及发展新的治疗方法提供了一种强有力的工具.iPS细胞技术是当前干细胞研究领域的热点之一,近年来取得了迅猛的发展.最初,研究者利用逆转录病毒作为载体将4种转录因子导入小鼠成纤维细胞诱导其重编程.近年来,iPS细胞的诱导方法不断改进,包括使用不整合入宿主细胞基因组的病毒载体、非病毒载体或者用基因敲除的方法切除导入的外源基因,从而产生了更为安全的iPS细胞系,许多小分子化合物也被证实能显著提高重编程效率.iPS细胞在再生医学、疾病模型的建立及药物筛选等领域正逐渐显现出它巨大的应用价值.本文回顾过去几年iPS细胞技术的研究进展,包括诱导方法的改进、iPS细胞诱导效率的提高和安全性的提高,并探讨iPS细胞的临床应用前景及当前研究存在的问题.     

诱导多功能干细胞的研究进展

背景：由于胚胎干细胞移植存在致瘤性和伦理学争议,有关胚胎干细胞的研究及临床应用存在较大的限制。2006年Yamanaka实验室利用Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc4种因子将鼠成纤维细胞重编程为诱导多功能干细胞,标志着一种新型类胚胎干细胞的问世。目的：了解诱导多功能干细胞的研究进展和应用前景。方法：由第一作者检索2006/2010PubMed数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed）及万方数据库（http：//g.wanfangdata.com.cn/）有关诱导多功能干细胞的产生、细胞特征、产生技术的研究进展及应用前景等方面的文章,英文检索词为＂induced pluripotent stem cells,defined factors,reprogramming,vectors,disease＂,排除重复性研究,共保留其中的69篇进行归纳总结。结果与结论：诱导多功能干细胞研究在诱导因子种类,因子导入方式,重编程效率及应用研究等诸多方面取得进展。然而体细胞重编程为诱导多功能干细胞仍存在一定的风险,重编程效率还非常低。一旦解决诱导多功能干细胞的安全性和重编程效率问题,诱导多功能干细胞就可被广泛应用于疾病模型,药物测试,细胞移植及患者和疾病特异性多功能干细胞的建立等诸多方面。     

应用白细胞管路采集外周造血干细胞的效果评价

目的采用美国COBE Spectra血细胞分离机,比较Auto PBSC管路和白细胞管路采集外周血造血干细胞的效果。方法选择供者/患者接受外周血造血干细胞单采46例64人次,AutoPBSC管路采集21例31人次,平均年龄（32.75±10.26）岁,白细胞管路采集25例33人次,平均年龄（31.47±14.21）岁;比较两组采集产品MNC、CD34＋细胞数、采集效率、采集产品体积、红细胞和血小板含量,无出血倾向和不良反应。结果两组采集产品的MNC、CD34＋细胞数、采集效率、红细胞和血小板含量的差异均无统计学意义;MNC白细胞管路组采集产品体积高于Auto PBSC管路组。64例供者采集后均无出血倾向,仅有5例出现轻度不良反应。结论两组管路采集外周血干细胞的效果无差异,采集产品需超低温冰冻保存者使用Auto PBSC管路组采集更为高效经济和安全。     

Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells

Human (h) induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a potentially abundant source of blood cells, but how best to select iPSC clones suitable for this purpose from among the many clones that can be simultaneously established from an identical source is not clear. Using an in vitro culture system yielding a hematopoietic niche that concentrates hematopoietic progenitors, we show that the pattern of c-MYC reactivation after reprogramming influences platelet generation from hiPSCs. During differentiation, reduction of c-MYC expression after initial reactivation of c-MYC expression in selected hiPSC clones was associated with more efficient in vitro generation of CD41a(+)CD42b(+) platelets. This effect was recapitulated in virus integration-free hiPSCs using a doxycycline-controlled c-MYC expression vector. In vivo imaging revealed that these CD42b(+) platelets were present in thrombi after laser-induced vessel wall injury. In contrast, sustained and excessive c-MYC expression in megakaryocytes was accompanied by increased p14 (ARF) and p16 (INK4A) expression, decreased GATA1 expression, and impaired production of functional platelets. These findings suggest that the pattern of c-MYC expression, particularly its later decline, is key to producing functional platelets from selected iPSC clones.     

胎肺间充质干细胞对脐血来源的单个核细胞体外扩增为巨核细胞的影响

本研究探讨胎儿肺部组织来源的间充质干细胞在无血清条件下体外对脐血单个核细胞诱导扩增为巨核细胞的影响。取脐血单个核细胞,在TPO,IL-11,肝素的扩增体系中分为2组培养。第1组为脐血单个核细胞单独培养,第2组脐血单个核细胞与间充质干细胞共培养,在第7,10,14天时进行活细胞计数,用流式细胞仪分析CD41a和CD61的表达情况。采用免疫组织化学和透射电子显微镜观察第14天细胞的形态与结构,用流式细胞仪分析细胞DNA含量。结果表明,第2组在第10天时获得的CD41^＋细胞和CD61^＋细胞数量最多,分别为第1组的4．5倍和4．7倍;但免疫组织化学和电子显微镜显示,2个组的CD41a^＋和CD61^＋细胞的核发育不成熟。结论：胎肺间充质干细胞能有效刺激CD41a^＋和CD61^＋细胞生成,但不能促进幼巨核细胞核的发育。