小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法

本研究旨在建立一种方便、快捷、有效体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC）的方法。在无菌条件下取小鼠股骨、胫骨,分别用全骨髓贴壁法、骨片消化法、骨髓加骨片法分离小鼠MSC,比较Msc集落出现时间、大小及数量;应用流式细胞术检测细胞免疫表型,并进行MSC成骨、成脂分化鉴定。结果表明,骨髓加骨片法出现的集落时间最早,集落数量最多,第4天集落数为20±4个;骨片消化法为11．5±2．5个;全骨髓贴壁法最少,为9．5±1．5个;到第3代时,骨髓加骨片法获得细胞数量最多,是全骨髓贴壁法和骨片消化法的2倍;流式细胞术检测结果显示,获得的细胞高表达干细胞标志之一Sca-1,高表达CDdd、CD29,不表达白细胞表面抗原CIM5和内皮细胞标志CD31等;所分离的MSC在成骨诱导体系和成脂诱导体系中能分别向成骨细胞和脂肪细胞分化,具有典型的MSC特性。结论：骨髓加骨片法是一种方便、快捷、有效的小鼠骨髓MSC分离方法。     

过表达CXCR4基因的小鼠骨髓间充质干细胞建立及其功能评价

本研究旨在建立稳定表达小鼠CXC型趋化因子受体4（CXC chemokine receptor type 4,CXCR4）基因的小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）并研究其功能.采用脂质体转染法将重组慢病毒表达载体LV-CXCR4-IRES-EGFP与包装质粒pMD2.G及包膜蛋白质粒pSPAX2共转染293FT包装细胞,应用超速离心法浓缩病毒颗粒;通过调整感染复数（MOI）、感染时间、促进病毒吸附等方法优化慢病毒感染小鼠MSC的条件,建立过表达CXCR4的MSC,采用荧光显微镜观察EGFP表达,流式细胞术检测细胞表面CXCR4表达,绘制细胞生长曲线检测增殖能力,Annexin-V和7-AAD双染后应用流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测迁移能力.结果发现,通过优化感染条件,重组慢病毒载体对MSC可获得较高感染效率,感染后72 h在荧光显微镜下可观察到较强EGFP表达,流式细胞术检测到MSC表面CXCR4的表达明显增加.细胞生长曲线和凋亡实验显示,过表达CXCR4不会显著影响MSC增殖和凋亡.Transwell实验显示过表达CXCR4可增强MSC迁移能力.结论：慢病毒载体可介导外源性基因CXCR4在小鼠MSC高效表达.     

小鼠肺内 β-防御素-2下降在重症甲型H1N1流感中的诊断价值

目的观察重症甲型H1N1病毒感染小鼠肺内β-防御素-2表达随时间变化的规律及分布特点,进而分析小鼠肺内β-防御素-2与重症甲型H1N1病毒感染的关系。方法应用聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测重症甲型H1N1病毒感染小鼠肺组织中β-防御素-2的浓度。结果肺组织PCR及ELISA法检测结果提示β-防御素-2在重症甲型H1N1病毒感染及正常小鼠肺内均有扩增及表达。感染H1N1病毒后小鼠肺组织β-防御素-2表达量在第5天开始下降(P 0. 05)。结论随着甲型H1N1病毒感染时程延长,小鼠肺内β-防御素-2的表达量下降,因而肺内β-防御素-2对预测重症甲型H1N1病毒感染具有重要意义。     

骨髓间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防及治疗作用

目的 观测小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)对急性移植物抗宿主病(aGVHD)的预防及治疗作用,并探讨其干预机制.方法 建立以C57BL/6小鼠为供体、致死剂量照射的BALB/c小鼠为受体的aGVHD动物模型.将小鼠分成6组:PBS组(单纯放射组)、BM组(单纯输注骨髓)、GVHD组(输注骨髓+脾细胞)、MSC-A组(输注骨髓+脾细胞,并于移植当天输注1×10~5 MSC)、MSC-B组(输注骨髓+脾细胞,并于移植当天输注5×10~5 MSC)、MSC-C组(输注骨髓+脾细胞,并于+7 d输注1×10~5 MSC),观测各组的生存状态;绿色荧光蛋白基因(Ad-EGFP)转染MSC,输入aGVHD模型小鼠,观察MSC在靶器官组织中的分布.结果①供体MSC可显著控制小鼠的GVHD症状,延长aGVHD小鼠的平均生存时间:PBS组为(13.5±2.6)d、GVHD组为(11.1±4.0)d,MSC-A组为(26.4±7.7)d、MSC-B组为(22.7±9.2)d,MSC-C组为(22.9±8.2)d,MSC各组与GVHD组比较差异均有统计学意义(P＜0.01),但MSC各组之间无明显差异(P=0.28).病理评估显示MSC可明显减少小肠及脾脏组织中淋巴细胞的浸润,减轻损害.②MSC可明显减少aGVHD环境中Th1类炎性因子的分泌:GVHD、MSC.A、MSC-B、MSC-C各组+14 d外周血上清中IFN-γ的水平分别为(607.9±157.1)、(143.6±37.5)、(117.0±77.8)、(131.4±63.4)ng/L,各组TNF-α的水平分别为(52.31±17.95)、(6.02±3.99)、(5.21±0.28)、(22.39±18.21)ng/L;MSC不影响aGVHD环境中异基因T淋巴细胞的增殖,但促进其凋亡:GVHD、MSC-A、MSC-B、MSC-C各组的CD3+ Annexin V+ PI-细胞率分别为(10.3±6.6)%、(13.5±13.8)%、(19.7±6.0)%、(16.6±7.3)%,其中MSC-B组与GVHD组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).③Ad-EGFP成功高效转染MSC,输注入aGVHD模型鼠6 d后,共聚焦显微镜下发现MSC可大量分布至肺及小肠,而肝、脾及肾脏有少量分布.结论 MSC可促进异基因T淋巴细胞凋亡、抑制其二次活化功能、减少Th1类炎症因子的分泌表达、参与修复aGVHD靶器官组织,可有效防治aGVHD.     

骨髓间充质干细胞输注对再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能的影响

本研究探讨人源骨髓间充质干细胞(MSC)输注对免疫介导性再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能及生存率的影响.采用雌性BALB/c小鼠30只,参照姚军等方法建立免疫介导性再生障碍性贫血模型,实验分模型组、MSC组及照射组。MSC组于制模后3天从小鼠尾静脉1次性输注人骨髓MSC1×106,观察各组小鼠外周血象变化、第28天存活率、骨髓有核细胞数量、造血集落生成和骨髓病理学特征。结果显示:于制模后第7天,模型组外周血WBC显著低于MSC组和照射组,分别为(0.65±0.05)×109/L,(2.45±0.71)×109/L,(2.30±0.33)×109/L;第10天3组均表现为全血细胞减少,第14天模型组血象指标仍持续降低,而MSC组及照射组血象指标开始回升,至28天3组小鼠存活率分别为18.2%、80%和100%,MSC组小鼠存活率显著高于模型组(p<0.01)。MSC组小鼠单侧股骨有核细胞数量、造血祖细胞集落生成数量均显著高于模型组,而与照射组结果一致。结论:MSC输注可减轻再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血衰竭程度,提高存活率。     

人骨髓间充质干细胞输注对辐射损伤小鼠造血器官的保护作用

本研究探讨人骨髓间充质干细胞(MSC)对辐射损伤小鼠造血器官的保护作用。培养人骨髓MSC,并进行细胞学鉴定。BALB/c雌性小鼠经6 Gy60Coγ射线照射后,分别通过尾静脉注射不同剂量的人MSC、MSC裂解物或等体积生理盐水。每天记录小鼠存活情况,并于处理后的第9天和16天取小鼠股骨和脾脏进行病理学分析,观察造血组织容量,并进行细胞增生程度评分。结果表明,与对照组比较,MSC及细胞裂解物处理组小鼠生存期无明显延长,但第9天高剂量(5×106)MSC及裂解物组小鼠骨髓造血即部分恢复,造血组织容量显著改善,(43.50±12.08)%和(42.80±13.11)%vs(24.33±9.50)%(P<0.05),增生程度积分明显增高(P<0.05),脾脏出现增生结节。第16天高剂量MSC和裂解物处理组小鼠骨髓和脾脏细胞明显活跃,脾脏和骨髓结构接近正常小鼠。此外,两个时间点MSC与细胞裂解物处理组小鼠骨髓增生积分无明显差异。结论:骨髓MSC可促进辐射损伤小鼠的造血功能恢复,这种作用可能与细胞内固有的活性物质有关。     

CXCR4基因修饰骨髓间充质干细胞对照射损伤小鼠造血重建的影响

本研究旨在探讨过表达CXCR4基因的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）移植对照射损伤小鼠造血重建的影响.采用293FT细胞包装共表达EGFP和Cxcr4慢病毒载体,转导MSC建立稳定共表达EGFP和CXCR4基因MSC（CXCR4-MSC）,同时建立稳定表达EGFP的MSC（EGFP-MSC）作为对照,经尾静脉输注接受亚致死剂量（总剂量3.5Gy）照射的BALB/c小鼠.MSC的输注量5×105,设立单纯照射组为单纯对照组.观察小鼠的一般生存状态,统计小鼠生存率.分别于第3、7、14、21、28 d外周血计数白细胞（WBC）和红细胞（RBC）,流式细胞术（FCM）检测网织红细胞与网织血小板比例及血小板（Plt）数量.病理观察移植后各组骨髓、脾脏恢复情况.PCR检测MSC在受鼠体内植入情况.结果表明,各组小鼠移植后血象呈先下降、继而上升的一般趋势,其中WBC在1周后开始恢复,且CXCR4-MSC组恢复速度明显快于其他两组,差异具有统计学意义（P＜0.05）.病理结果显示,CXCR4-MSC组造血器官照射损伤后修复较快.PCR检测发现,移植后7、14、21、28 d均可在受亚致死剂量照射的受鼠体内检测到供体MSC.结论：输注过表达CXCR4基因的MSC可增加MSC植入,并促进照射损伤小鼠造血功能的恢复.     

骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞的生物学特性及其支持造血的体外研究

为了解骨髓增生异常综合征（MDS）患者间充质干细胞（MSC）的生物学特性,探讨其对体外造血的支持能力,采集MDS的骨髓标本,分离、培养和扩增MSC,进行细胞形态观察和免疫表型、成骨分化及增殖能力检测,并对骨髓细胞进行成纤维细胞集落（CFU-F）形成分析.对MDS患者的MSC进行贴壁培养,接种脐血单个核细胞（MNC）,以观察细胞数和CFU-GM的变化,作为MDS患者MSC支持造血体外实验.结果表明：来自MDS患者的MSC呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定CD34,CD45阴性,SH2（CD105）,SH3（CD73）,Thy-1（CD90）阳性,体外诱导可向成骨细胞分化,其增殖能力和CFU-F形成能力与源于正常供者的MSC相当.支持造血的体外实验显示,实验组培养上清中的细胞总数和CFU-GM计数在第2周后均显著低于对照组（P＜0.05）.结论：来源于MDS患者骨髓的间充质干细胞的生物学特性与正常供者的MSCs无差异,但其体外支持造血的功能较后者显著减弱.     

急性髓系白血病和非白血病骨髓间充质干细胞生物学特性的比较

本研究旨在比较急性髓系白血病的间充质干细胞（MSC）、急性髓系白血病完全缓解后骨髓MSC以及非白血病的MSC的三者生物学特性。将骨髓MSC分为3组：白血病组、完全缓解组以及非白血病组。采用光学显微镜观察各组MSC的形态学特征,在原位瑞氏染色后计数各组CFU-F数,计数各组MSC的融合时间,绘制各组MSC的生长曲线,应用流式细胞仪检测各组MSC的免疫表型及细胞周期并计算DI值。结果发现,3组骨髓MSC的形态无差异;3组原代MSC的CFU-F数有差异（P=0．01）,其中白血病组MSC的CFU—F最少;3组原代MSC的融合时间有差异（P〈0．01）,其中白血病MSC组的融合时间最长;在第3、5、7天对3组MSC（第2代）的细胞计数进行比较,结果无显著性差异（P〉0．05）;3组MSC（第二代）免疫表型检测显示CD105、CD106均为高表达,CIM5表达阴性,3组间结果比较无差异（P值分别为0．37、0．50）;各组MSC（第二代）的G0／G1期细胞比例分别为（89．9±4．0）％,（90．2±3．0）％,（91．0±3．0）％,3组比较未显示差异（P=0．79）。3组MSC的DI值都在0．9-1．1范围之内。结论：在对白血病与非白血病的第二代MSC的生物学特性比较中,未发现有显著性差异。     

多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析

为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31；MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能；MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常；MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论：MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。     

非清髓性单倍体骨髓移植后输注供体免疫细胞治疗白血病的研究

本研究在小鼠非清髓性单倍体骨髓移植模型上,观察移植后早期输注供体免疫细胞对促进植入及改善疗效的作用。以CB6F1雌性小鼠为受鼠,C57BL/6雄性小鼠为供鼠,移植前4 d经尾静脉注射小鼠红白血病细胞1×106个/只,移植前2 d和1 d分别通过腹腔注射阿糖胞苷0.015 g/只,移植前1d予450 cGy全身照射（TBI）,移植当天给予供鼠骨髓及脾细胞混合物6×107个/只,移植后15 d输注供体免疫淋巴细胞6×107个/只,移植后定期监测受鼠外周血供鼠CD3＋细胞嵌合状态和供鼠性别决定基因（SRY）,观察小鼠急性移植物抗宿主病（aGVHD）、疾病复发及生存情况。结果表明：经尾静脉注射小鼠红白血病细胞1×106个/只,不予治疗,小鼠平均生存期为15±1 d;混合骨髓移植组移植后供者细胞获得植入,SRY基因在移植后30和60 d时检测PCR结果均阳性,移植后14、30、60 d外周血供鼠CD3＋细胞嵌合率分别为（17.95±12.03）%、（37.34±2.78）%,（47.06±6.1）%;DLI组移植后30、45、60 d嵌合率为（69.78±12.62）%、（75±15.97）%、（83.41±16.07）%;小鼠移植后平均生存期分别为66.66±1.47 d、78.2±7.82 d。结论：移植前高肿瘤负荷影响供体细胞植入及预后,移植后早期行供体免疫淋巴细胞输注可以进一步改善治疗效果,延长生存期。     

川芎嗪对骨髓移植后小鼠LFA-1和ICAM-1表达的影响

本研究探讨川芎嗪对骨髓移植 (BMT)后小鼠骨髓中LFA 1和ICAM 1表达水平的影响及其促进骨髓造血重建的机制。 15 0只BALB/c小鼠随机分为正常组、生理盐水组和川芎嗪组。正常组未作任何处理 ,生理盐水组和川芎嗪组在BMT后分别喂饲相同剂量的生理盐水 ( 0 .2毫升 /只 ,每天 2次 )和川芎嗪 ( 2毫克 /只 ,每天 2次 ) ,并分别于BMT后第 7,14 ,2 1,2 8天统计存活率 ,计数脾集落形成单位 (CFU S)、外周血细胞、骨髓单个核细胞 (BMM NC) ,分析骨髓组织学变化及LFA 1和ICAM 1表达水平。结果表明 :川芎嗪组小鼠在BMT后第 10天CFU S计数和BMT后第 7,14 ,2 1,2 8天存活率、外周血白细胞、血小板、BMMNC计数、骨髓造血组织容量以及LFA 1表达水平均显著高于生理盐水组 (P <0 .0 1或P <0 .0 5 ) ,成熟红细胞容量和ICAM 1表达水平均明显低于生理盐水组 (P <0 .0 1或P <0 .0 5 )。川芎嗪组小鼠脂肪组织容量在BMT后第 7、14天明显高于生理盐水组 (P <0 .0 1) ,在第 2 1,2 8天明显低于生理盐水组 (P <0 .0 1)。结论 :川芎嗪改善骨髓微环境 ,促进造血重建。     

川芎嗪对同基因骨髓移植小鼠骨髓中VCAM-1/VLA-4表达的影响

为了探讨同基因骨髓移植 (BMT)小鼠骨髓细胞表面黏附分子VCAM 1 VLA 4 (CD4 9d)的表达及川芎嗪对其影响 ,取健康BALB c小鼠 ,随机分为 3组 :正常组 (不做处理 ) ,骨髓移植对照组 (简称BMT组 )和骨髓移植 川芎嗪治疗组 (简称川芎嗪组 )。BMT组和川芎嗪组分别胃饲生理盐水 0 .2ml 只和川芎嗪注射液每次 2mg 只 ,2次 天。在BMT后第 7、14、2 1、2 8天处死小鼠 ,采用免疫组织化学方法检测骨髓基质细胞VCAM 1蛋白表达水平 ,用RT PCR检测骨髓基质细胞VCAM 1mRNA表达水平 ;用流式细胞术检测骨髓有核细胞表面VLA 4的表达水平。结果发现 :BMT后第 7、14、2 1、2 8天川芎嗪组VCAM 1 VLA 4的表达水平、骨髓有核细胞计数均高于BMT组 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。结论 :川芎嗪能提高BMT小鼠骨髓造血细胞和基质细胞黏附分子的表达 ,促进造血干 祖细胞的归巢 ,加速移植后骨髓的造血重建。     

PTD-mFoxp3融合蛋白对异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响

本研究探讨静脉输注PTD—mFoxp3融合蛋白对同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响。10周龄C57BL／6小鼠为受体并随机分为A、B、c3组,每组10只,移植当天（第0天）接受直线加速器x射线6．0Gy全身照射,4-6h内输注供体BALB／c鼠全骨髓细胞3×10^7＋脾细胞1．5×10^7个。A组于移植前2d和移植后0、1、3、5、7、9、11、13d间断多次输入生理盐水,B组输入mFoxp3蛋白,c组输注等量PTD．mFoxp3融合蛋白。移植后每天观察受体有无移植物抗宿主病的表现;取受体肝脏、空肠上端组织做病理学检查,判断组织损伤及淋巴细胞浸润程度;用ELISA法检测受体外周血中炎性因子IL-2及INF．1浓度;流式细胞术测定长期存活受体外周血供体细胞的比例。结果表明,照射后60d内A、B和c组受体平均生存期分别为（32．95±5．48）d、（38．00±5．45）d和（55．30±3．15）d;病理组织学观察示,A组和B组的小肠及肝脏发生明显的损伤,符合GVHD的表现,c组的病理损伤较轻;酶联免疫吸附测定表明,c组IL-2及IFN-γ浓度明显低于A和B组;长期存活的受体形成了稳定的嵌合体状态,移植后60dA、B、C组活存动物供体细胞比例分别为（79．46±1．80）％、（79．13±2．23）％和（85．92±2．82）％。结论：PTD-mFoxp3融合蛋白可有效降低同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的发生,并减轻其临床表现,降低死亡率。     

不同年龄段人骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

本研究通过对不同年龄段人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)的研究探讨MSC生物学特点与年龄的关系,从而为临床寻找合适供体,迅速获取所需MSC提供实验依据。骨髓供体按年龄分为4组:A组(胚胎)、B组(0-20岁)、C组(20-40岁)和D组(40岁以上)。观察各组骨髓MSC的生长、增殖、分化特点;用流式细胞仪检测细胞表面标志,用ELISA方法检测培养上清造血相关因子的水平;进行核型分析及成瘤试验;评价不同年龄段供体骨髓MSC在临床造血干细胞移植中的应用价值。结果显示:各组骨髓均可培养出MSC,各组MSC表面标志无显著差异;各组MSC均具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力;原代培养B组骨髓MSC含量较多,贴壁时间早,传代时间短,P0至P1时间为5.5天,传至P10需33天,8×106MNC培养至P10时MSC数达(5.19±2.15)×1010;A、C、D组P0至P1时间分别为15、7和13天,传至P10分别需50、60和72天,8×106MNC培养传代至P10时MSC数分别为(4.98±2.08)×1010、(1.86±0.47)×1010、(0.64±0.22)×1010。A组MSC较细长,细胞融合后生长无接触抑制,P15增殖速度开始减缓;B、C、D组MSC形态相似,有生长接触抑制B组P10开始增殖减缓,C、D组P8开始增殖减缓;B组MSC培养上清中SCF、FLT3L、IL6及SDF1水平高于其它各组。各组间细胞的增殖指数无显著差异。核型分析均为正常核型,成瘤实验为阴性。结论:MSC增殖生长特性与年龄密切相关;根据临床造血干细胞移植的需要,0-20岁年龄组骨髓是短时间内获取足够细胞数的理想供体,分泌HGFs水平亦占优势;0-20岁组骨髓MSC的生物学特性优于其他各组,可以作为MSC的供源。     

川芎嗪对同基因骨髓移植小鼠骨髓细胞PECAM-1/CD31分子表达与造血重建的作用

本研究通过观察骨髓移植后小鼠骨髓中血小板内皮细胞间黏附分子 (PECAM 1/CD31)的表达水平变化及川芎嗪对其表达的调节作用 ,进一步探讨川芎嗪促进骨髓造血微环境修复、改善造血重建的作用机制。将BALB/c小鼠随机分为正常对照组 ,单纯BMT对照组和川芎嗪治疗组 (骨髓移植 川芎嗪 ) ,接受 7.5Gy60 Coγ射线一次性全身均匀照射 ,照射后进行同基因小鼠骨髓移植 ,并分别胃饲等量生理盐水与川芎嗪注射液 ,2次 /天。骨髓移植后第 7,14 ,2 1天 ,采用流式细胞术检测小鼠骨髓有核细胞表面CD31分子表达水平 ,计数外周血白细胞、血小板及骨髓有核细胞数 ,并做骨髓组织学检查。结果表明 :骨髓移植后第 7,14 ,2 1天川芎嗪治疗组的CD31表达水平 ,外周血白细胞、血小板和骨髓有核细胞计数以及骨髓细胞增生程度均高于骨髓移植对照组 (P <0 .0 1或P<0 .0 5 )。结论 :川芎嗪可以明显促进骨髓移植后骨髓有核细胞表面黏附分子CD31的表达水平 ,这可能是其促进造血重建的作用机制之一。