阻断共刺激信号途径对造血干细胞移植后致敏受者免疫耐受排斥的影响简

本研究旨在应用CTLA4Ig及anti-CD154分别阻断致敏小鼠的B7/CD28及CD40/CD154共刺激信号途径,探讨其对异基因造血干细胞（HSC）植入的影响,为临床应用异基因造血干细胞移植（HSCT）治疗致敏受者免疫排斥提供实验基础.实验将BALB/c小鼠分为4组：①移植前7d致敏组;②移植前7d致敏同时应用CTLA4Ig＋anti-CD154组;③正常小鼠应用CTLA4Ig及anti-CD154的鼠源性对照抗体;④正常小鼠空白对照组.每组15只,于移植当天给小鼠8 Gy照射,然后将荧光标记的C57BL/6小鼠骨髓干细胞经尾静脉注射小鼠体内进行移植,于不同时间点取血或器官组织用流式细胞术检测荧光细胞归巢,同时记录生存状况,监测其造血重建水平.结果表明,与致敏鼠相比,CTLA4Ig＋ anti-CD154能促进异基因HSC在致敏受者体内植入,诱导免疫耐受,延长其生存期并在28 d内完成造血重建.结论：应用CTLA4Ig及anti-CDl5能诱导致敏受者对异基因HSC的免疫耐受,促进其植入,并完成造血重建.     

CD28／CD152：CD80／CD86分子在强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞上的表达

目的探讨共刺激分子CD28／CD152：CD80／CD86在强直性脊柱炎（AS）患者外周血淋巴细胞上的表达及与免疫功能的关系。方法流式细胞仪检测AS患者及健康体检者T细胞表面标志CD3、CD4、CD8、CD19的表达及CD28／CD152和CD80／CD86在外周血T、B淋巴细胞上的表达水平；采用速率散射比浊法、酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM及C-反应蛋白（CRP）和白细胞介素-6（IL-6）水平。结果CD3^＋CD4^＋T细胞及CD4^＋／CD8^＋比值明显高于健康对照组（P〈0．05），而CD3^＋CD8^＋T细胞则明显低于健康对照组（P〈0．05）；CD4^＋和CD8^_T细胞上CD28和CD19^＋B细胞上CD80、CD86的表达均较健康对照组增高（P〈0．05），而CD152在CD4^＋T淋巴细胞上的表达也比健康对照组显著增加，但在CD8%＋T淋巴细胞上的表达却显著降低（P〈0.05）；血清IgG、IgA及CRP、IL-6水平均较健康对照组显著增高（P〈0．05）。结论AS患者外周血淋巴细胞CD28／CD152：CD80／CD86分子的异常表达与其免疫功能紊乱有密切关系。     

ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS信号通路可抑制异基因反应性T淋巴细胞的功能

本研究探讨ICOS—Ig融合蛋白阻断ICOS—B7h信号通路对异基因反应性T淋巴细胞的作用和机制。建立稳定高表达ICOS—Ig的CHO细胞株．培养制备纯化的ICOS—Ig融合蛋白;以C57BL／6小鼠脾脏来源的CD4^＋淋巴细胞为反应细胞,BABL／C骨髓源成熟树突状细胞为刺激细胞,应用不同浓度梯度的ICOS—Ig干预,以相同浓度的人Ig作为对照。结果显示：获得的目标蛋白的分子量为54kD,内毒素含量〈10EU／ml。ICOS—Ig在≥10μg／ml时可显著减少DC刺激引起的异基因反应性T淋巴细胞的增殖效应（P〈0．01）。ICOS—Ig不影响T淋巴细胞的活化,ICOS—Ig浓度与CD4^＋T淋巴细胞的凋亡成正相关。单纯刺激组、ICOS—Ig10μg／ml和20μg/ml干预组的CD4^＋An—nexin V^＋P1^-细胞群的频率分别为15．1％、26．4％和33．6％。ICOS—Ig作用后,Th1细胞因子TNFα分泌降低,Th2细胞因子IL4分泌增加。结论：ICOS—Ig融合蛋白阻断ICOS通路可明显减弱异基因反应性T淋巴细胞的增殖反应,并改变Th细胞的极化,对CD4^＋T淋巴细胞的活化无影响,但可促进活化的T淋巴细胞凋亡。     

免疫介导再生障碍性贫血小鼠骨髓T细胞表面CD28、CTLA4水平检测及其意义

目的 研究免疫介导再障小鼠骨髓T细胞CD28、CTLA4的表达及其意义.方法 建立免疫介导再障小鼠模型,取再障和正常组小鼠骨髓单个核细胞（BMNC）,在终浓度为15μg/mL植物血凝素（PHA）条件下培养,于0h和48h分别用双色免疫荧光标记流式细胞术对T细胞CD28、CTLA4的表达进行分析.结果 PHA刺激培养48h后正常组和再障组T细胞CD28、CTLA4的表达较刺激前均明显升高（P〈0.01）;而且再障组刺激培养前后T细胞CD28的表达均显著高于同期正常组（P〈0.01）,但CTLA4的表达与同期正常组相比虽略有升高,但差异无显著性（P〉0.05）.结论 再障T细胞激活及其激活潜能增强,免疫分子CD28、CTLA4在骨髓中的表达异常可能参与了再障T细胞的免疫功能紊乱.     

传染性非典型肺炎患者外周血CD4+T细胞 CD38的表达及意义

目的 探讨传染性非典型肺炎（急性重症呼吸综合征，SARS）患者外周血CD4＋T细胞CD38的表达的变化及其与病程和病情严重程度的关系。方法 用双色流式细胞术测定157例SARS临床诊断病例、37例同期发生的肺炎支原体感染患者及38名健康成人外周血淋巴细胞中CD4＋T细胞的百分率（CD4％）、CD4＋T细胞CD38阳性率（CD38／CD4％）及CD38平均荧光强度（CD38MF）进行检测。结果 SARS病例CD4％与健康对照组相比均无统计学意义，但其CD38／CD4％及CD4＋T细胞CD38 MF显著低于健康对照组（P〈0．05，P〈0．05）；SARS重症患者CD38／CD4％及CD38MF显著低于轻症患，有统计学意义（P〈0．01，P〈0．001）；SARS轻症患者CD4％、CD38／CD4％及CD38MF与健康对照组相比无统计学意义；SARS临床诊断病例CD4％显著高于肺炎支原体感染者，有统计学意义（P〈0．01），而CD38／CD4％及CD38MF显著低于肺炎支原体感染，有统计学意义（P〈0．01，P〈0．01）。结论 SARS患者CD4＋T细胞CD38的表达降低，降低的水平与SARS病情严重程度相关。CD4＋T细胞CD38的表达在SARS诊断病例及肺炎支原体感染中的变化存在统计学意义，CD4＋T细胞CD38的表达的检测有助于SAILS与肺炎支原体感染的鉴别。     

CD4+CD25+调节性T细胞在特发性血小板减少性紫癜患者中的变化

目的探讨CD4^＋CD25^＋T细胞在特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者发病机制中的作用。方法应用流式细胞术检测ITP患者外周血CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4^＋CD25^highT细胞、CD4^＋FOXP3^＋T细胞、CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋T细胞的数量；实时荧光定量PCR检测外周血FOXP3 mRNA的表达水平。将ITP患者和正常人CD4^＋CD25^highT细胞与自身CD4^＋CD25^-T细胞混合培养，检测CD4^＋CD25^high T细胞免疫抑制功能。结果ITP患者外周血中CD4^＋CD25^＋T细胞约占CD4^＋T细胞的（15．64±5．82）％，明显高于正常对照组（9．30±3．95）％（P〈0．01），CD4^＋CD25^high T细胞比例为（1．53±0．66）％，与对照组[（1．36±0．55）％]比较差异无统计学意义（P〉0．05）；CD4^＋FOXP3^＋T细胞和CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋T细胞分别为（1．82±1．42）％和（1．25±0．94）％，均明显低于对照组[（3．90±1．37）％和（2．65±0．92）％]（P值均〈0．01）。ITP患者外周血FOXP3 mRNA表达水平较正常人明显下调（P〈0．01），CD4^＋CD25^high T细胞的抑制活性较正常人减弱（P〈0．01）。结论ITP患者中CD4^＋CD25^＋T细胞FOXP3表达水平降低，抑制活性减弱。     

类风湿关节炎患者外周血CD23^＋／CD19^＋细胞表达状况的研究

目的研究外周血CD19^＋及CD23^＋／CD19^＋细胞的表达在类风湿关节炎（RA）发病机制和病情进展中的意义。方法RA组和正常对照组各20例,应用流式细胞术检测外周血中CD19^＋及CD23^＋／CD19^＋细胞的表达率,比较两组的差异,并分析其与血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）的相关性。结果RA组外周血CD19^＋及CD23^＋／CD19^＋细胞表达率均高于对照组,（10．236±2．212）％vs（6．870±1．052）％,（5．134±1．069）％vs（2．100±0．652）％（P〈0．05或〈0．01）。CD23^＋／CD19^＋细胞的表达率与实验室指标ESR、CRP均呈正相关（P〈0．01）,CD19^＋细胞表达率与ESR、CRP无明显相关关系（P〉0．05）。结论RA患者外周血存在CD19^＋及CD23^＋／CD19^＋细胞的表达增高,检测CD23^＋／CD19^＋细胞的表达情况可能对RA病情监控具有一定的应用价值。     

登革热患者外周血CD4^＋、CD8^＋T细胞及IL-10的检测分析

目的：观察登革热患者外周血CD4^＋、CD8^＋T细胞及白介素-10（IL-10）的变化，探讨其在登革热疾病的发生和发展中的作用。方法：12例健康人和18例登革热患者于治疗前后采静脉血。采用流式细胞仪检测CD4^＋、CD8^＋T细胞并计算CD4^＋／CD8^＋比值，ELISA法检测血清IL-10水平，同时作外周血白细胞、血小板计数。结果：与正常健康人和治疗后相比，登革热患者治疗前外周血CD4^＋细胞百分比、CD4^＋／CD8^＋比值明显降低（P〈0．01）。CD8^＋细胞百分比和血清IL-10显著增高（P〈0．01），白细胞、血小板计数均明显下降（P〈0．01）；治疗后患者以上指标均与健康人无明显差异。结论：CD4^＋、CD8^＋ T细胞在登革热病毒感染后异常激活，CD4^＋／CD8^＋比值明显降低，IL-10分泌增高，可能在登革热的发病中起重要作用。     

自身免疫性甲状腺炎大鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞变化及意义

目的研究CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋调节性T细胞在自身免疫性甲状腺炎（AITD）大鼠外周血中的比例变化,并初步探讨其在疾病进程中的意义。方法选取17例A1TD大鼠,取静脉血,应用流式细胞术及定量PCR的方法,分别在蛋白质和mRNA水平检测Foxp3^＋表达,并与甲状腺炎球蛋白抗体（TgAb）,甲状腺过氧化酶抗体（TPOAb）,甲状腺微粒体抗体（TmAb）和甲状腺组织活检结果作相关分析。取正常大鼠作为对照。结果AITD大鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（5．35％±1．27％）显著低于正常对照组（8．02％±2．29％,P〈0．01）,AITD大鼠CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞占CD4‘T细胞比例（3．12％±0．78％）明显低于正常对照组（6．45％±2．12％,P〈0．01）,AITD大鼠Treg与TgAb、TmAb、TPOAb呈负相关（r=-0．291,-0．357,-0．389,P〈0．05,0．05,0．05）,并与小鼠甲状腺组织的炎症程度呈负相关（r=-0．511,P〈0．01）;Foxp3mRNA表达水平与蛋白质表达水平变化相一致。结论AITD大鼠CD4^＋CD25^＋T细胞明显减少,这群调节性T细胞可能参与了AITD的病理进程。     

rhG-CSF动员对供者外周血CD4+T细胞极化和迁移的影响

T淋巴细胞极化和迁移的过程需要依赖细胞表面的淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）与其配体细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的结合。本研究旨在探讨重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）供者外周血CD4＋T细胞的极化和迁移的影响。采集10例allo-HSCT供者于rhG-CSF动员后第5天和10例健康志愿者的外周血,使用免疫磁珠分选法纯化CD4＋T细胞,使用激光扫描共聚焦显微镜检测CD4＋T细胞接受基质细胞衍生因子1理（SDF-1d）和ICAM-1信号刺激后细胞的极化和迁移能力。结果显示,rhG-CSF动员后供者CD4＋T细胞的极化比例为（32．424-4．91）％,健康人志愿者为（56．55±5．35）％,差异有统计学意义（P〈0．01）;rhG-CSF动员后供者CD4＋T细胞的迁移速率为（7．06±1．44μm／min）,健康志愿者CD4＋T细胞的迁移速率为（9．05±1．91μm／min）,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：rhG-CSF动员能明显抑制供者CD4＋T细胞的极化和迁移能力。     

共刺激分子CD137单克隆抗体对CD4＋CD25＋T淋巴细胞死亡方式影响的研究

目的：初步观察抗共刺激分子CD137单克隆抗体对分离培养的人外周血CD4＋CD 25＋T淋巴细胞自噬、凋亡、胀亡现象的影响及其表面特征性标志物FOXp3的表达的变化。方法：采用密度梯度离心法及尼龙棉柱法分离健康志愿者外周血T淋巴细胞,磁性细胞分离器（MACS）分离得到CD4＋CD25＋T淋巴细胞,分别利用电镜及流式细胞仪观察、检测各分组（抗CD137单克隆抗体2μg/ml组、IgG 1同型抗体对照组）的细胞的自噬率、凋亡率、胀亡率及FOXp3的表达。结果：M ACS可成功分离CD4＋CD25＋T淋巴细胞,纯度可达80.3%-89.5%;抗CD 137单克隆抗体可促进人外周血CD4＋CD25＋T淋巴细胞自噬率及凋亡率增加;各组间的胀亡率改变及FOXp3表达差异无统计学意义。结论：抗CD137单克隆抗体可促进CD4＋CD25＋T淋巴细胞凋亡和自噬,其作用机制未发现与胀亡显著相关,而且不影响CD4＋CD25＋T细胞中Foxp3的表达。     

阻断CD40／CD40L通道诱导同种胰岛移植免疫耐受的研究

目的：观察阻断CD40／CD40L共刺激通路对同种胰岛移植免疫反应的影响,探讨CD40L单克隆抗体对诱导同种移植免疫耐受的作用。方法：清洁级Wistar大鼠,STZ 60mg／kg诱导1型糖尿病模型,随机分为三组,A组：糖尿病大鼠,B组：糖尿病大鼠＋胰岛细胞＋抗CD40L抗体,C组：糖尿病大鼠＋胰岛细胞。B组在移植前24h注入抗CD40L抗体每只20μg。同种胰岛细胞来自SD大鼠,胶原酶V消化法和Ficoll400密度梯度离心法分离纯化胰岛细胞,收获量为（3．49±0．23）×10^5 IEQ／kg,将同种胰岛细胞按12000IEQ／kg导入受体,移植后每天和每周相同时间点检测血糖和体重变化,3d、7d、15d、22d后检测白介素-2的表达。结果：同种异体胰岛移植可使1型糖尿病大鼠的血糖降至正常并维持一段时间,A组为（23．84±2．74）mmol／L,B组（8．15±1．40）mmol／L,维持（18．12±4．12）d,C组（7．42±2．55）mmol／L,维持（8．00±1．30）d,后两组正常血糖维持天数比较,P〈0．001,有统计学意义。体重变化比较：非移植的A组随着时间的延长,体重不断下降,B、C组至移植后体重有所回升,但移植4周后C组的体重再次下降。移植7d、15d后,IL-2的表达B组和C组比较有显著性差异,B组为（0．1280±0．0104）和（0．1235±0．0073）,C组为（0．1744±0．0096）和（0．1667±0．0098）（P〈0．001）,移植22d后两组比较差异无显著性。结论：CD40L单克隆抗体阻断CD40／CD40L共刺激通路显著延长移植的同种胰岛细胞的存活时间,诱导机体产生针对胰岛移植物的免疫耐受状态。     

Induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness in human T lymphocytes by blocking interaction of CD28 with its natural ligand B7/BB1

The specificity of T lymphocyte activation is determined by engagement of the T cell receptor (TCR) by peptide/major histocompatibility complexes expressed on the antigen-presenting cell (APC). Lacking costimulation by accessory molecules on the APC, T cell proliferation does not occur and unresponsiveness to subsequent antigenic stimulus is induced. The B7/BB1 receptor on APCs binds CD28 and CTLA-4 on T cells, and provides a costimulus for T cell proliferation. Here, we show that prolonged, specific T cell hyporesponsiveness to antigenic restimulation is achieved by blocking the interaction between CD28 and B7/BB1 in human mixed leukocyte culture (MLC). Secondary T cell proliferative responses to specific alloantigen were inhibited by addition to the primary culture of monovalent Fab fragments of anti- CD28 monoclonal antibody (mAb) 9.3, which block interaction of CD28 with B7/BB1 without activating T cells. Hypo-responsiveness was also induced in MLC by CTLA4Ig, a chimeric immunoglobulin fusion protein incorporating the extracellular domain of CTLA-4 with high binding avidity for B7/BB1. Cells previously primed could also be made hyporesponsive, if exposed to alloantigen in the presence of CTLA4Ig. Maximal hyporesponsiveness was achieved in MLC after 2 d of incubation with CTLA4Ig, and was maintained for at least 27 d after removal of CTLA4Ig. Accumulation of interleukin 2 (IL-2) and interferon gamma but not IL-4 mRNA was blocked by CTLA4Ig in T cells stimulated by alloantigen. Antigen-specific responses could be restored by addition of exogenous IL-2 at the time of the secondary stimulation. Addition to primary cultures of the intact bivalent anti-CD28 mAb 9.3, or B7/BB1+ transfected CHO cells or exogenous IL-2, abrogated induction of hyporesponsiveness by CTLA4Ig. These data indicate that interaction of CD28 with B7/BB1 during TCR engagement with antigen is required to maintain T cell competence and that blocking such interaction can result in a state of T cell hyporesponsiveness.     

间充质干细胞调控趋化因子配体2对系统性红斑狼疮作用的机制探讨

目的:探讨趋化因子配体2[chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL2]在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)中的作用。方法:采用酶联免疫吸附试验检测SLE患者及正常对照者的血清、尿液及骨髓MSCs培养上清中的CCL2及白细胞介素(interleukin,IL)-17的表达水平,并采用流式细胞术检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中Th17-CD4+IL-17+的百分率及其表面CCR2的表达。将18只雌性MRL/lpr SLE小鼠随机分为SLE小鼠组(n=6)(未治疗组)、脐带MSCs移植联合CCL2中和抗体治疗SLE小鼠组(n=6)及脐带MSCs移植联合同型对照IgG2B治疗SLE小鼠组(n=6),另选6只同周龄雌性C57BL/6小鼠作为健康阴性对照组。采用酶联免疫吸附试验检测各组血清CCL2及IL-17的水平,流式细胞术检测各组PBMCs中CD4+CCR2+IL-17+细胞百分率。结果:SLE患者血清[(839.0±160.5)pg/mL]、尿液[(881.8±162.7)pg/mL]及骨髓MSCs培养上清[(22 935±2 304)pg/mL]的CCL2含量均显著高于正常对照者[(433.0±31.0)pg/mL、(222.7±52.8)pg/mL、(8 394±5 125)pg/mL];SLE患者PBMCs中CD4+CCR2+IL-17+细胞百分率较正常对照者显著升高(P<0.01)。脐带MSCs移植联合CCL2中和抗体治疗SLE小鼠组血清CCL2浓度显著低于未治疗组,PBMCs中CD4+T细胞亚群IL-17、CCR2表达较未治疗组显著降低。结论:MSCs移植治疗SLE的效果可能通过抑制CCL2表达,进而下调患者Th17细胞水平来实现。     

Distinct regulatory roles of lymphocyte costimulatory pathways on T helper type-2 mediated autoimmune disease

We assessed the role of CD40-CD40L, cytotoxic T lymphocyte (CTL)A4/CD28- B7s, and CD2-CD48/CD58 lymphocyte costimulatory pathways in the development of mercury chloride (HgCl2)-induced autoimmune disease in mice, which is believed to be mediated by T helper (Th) subset Th2. Inhibition of CD40-CD40-L and CTLA4/CD28-B7s interactions by anti-CD40- L antibody and soluble CTLA4-immunoglobulin (Ig) fusion protein, respectively, abrogated the autoimmune disease without affecting interleukin 4 (IL-4) production, showing the importance of physical contact between T and B lymphocytes in the Th2-mediated process. In contrast, two anti-CD2 antibodies that have been shown to induce immunosuppression of Th1-mediated events exacerbated the autoantibody response and augmented IgG1, IgE, and IL-4 production, transforming a mild mesangial glomerulopathy into a severe systemic immune complex disease. These observations demonstrate that manipulation of lymphocyte accessory counterreceptor interactions may affect the course of Th2- associated autoimmune disease and suggest that signals resulting from CD2 engagement play an essential role in the regulation of the Th1-Th2 effector equilibrium.     

CD4＋CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞在急性白血病患者外周血的表达及意义

目的·探讨CD4＋CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞（Tregs）在急性白血病（AL）患者外周血中的表达及其临床意义。方法采用流式细胞术分别检测34例AL初诊（A组）、30例经化疗完全缓解（cR）（B组）患者以及20名健康对照者（c组）外周血CD4＋CD25nt/hiCD127loTregs的比例。结果AL患者中A组外周血CD4＋CD25nt/hiCD127loTregs比例显著高于C组（7.31±3．37）％vs（3．24±O．58）％,P〈O．01】。B组CD4＋CD25nt/hiCD127loTregs比例较A组及C组均明显增加【（11．32±5．87）％vs（7．31±3．37）％,P〈O．01;（11．32±5．87）％vs（3．24±O．58）％,P〈O．O1】。结论初治AL患者外周血CD4＋CD25nt/hiCD127loTregs细胞比例显著增加,说明Tregs细胞的免疫抑制作用可能参与了AL的发病。AL缓解后Tregs细胞比例增加,可能与AL患者化疗后免疫功能进一步抑制以及化疗药物相关。     

妊娠合并重症甲型H1N1流感患者T细胞亚群及Th1/Th2水平的变化

[目的]研究妊娠合并重症甲型H1N1流感患者T细胞亚群的分布特点及辅助性T细胞1/辅助性T细胞2(Th1/Th2)水平的变化.[方法]收集2009年11月14日至12月31日于中国医科大学附属盛京医院确诊的女性甲型H1N1流感患者34例,按是否妊娠分为甲流妊娠组(A组,17例),甲流非妊娠组(B组,17例),同时收集抗...