冬凌草甲素诱导多发性骨髓瘤U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡实验研究

目的 探究冬凌草甲素对多发性骨髓瘤(MM)U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响。方法 通过细胞培养和处理方法,采用0、10、20、30、40、50μmol/L的冬凌草甲素处理MM相关U266细胞、RPMI8226细胞48 h。采用MTT法测定U266细胞、RPMI8226细胞的增殖情况,采用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒检测U266细胞、RPMI8226细胞凋亡情况,并采用蛋白质印迹法测定Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10～50μmol/L)的增加,U266细胞、RPMI8226细胞的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10～50μmol/L)的升高,促凋亡蛋白Bax表达量逐渐升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 冬凌草甲素具有抑制MM细胞增殖和诱导细胞凋亡的潜力,其作用机制可能与促进Bax表达,抑制Bcl-2表达,改变细胞Bcl-2/Bax比例,调节细胞凋亡有关。     

黄芩素对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨黄芩素对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖和迁移能力的影响及分子机制.方法 以不同浓度黄芩素处理MM细胞株RPMI 8226和U266细胞不同时间后,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测黄芩素对MM细胞增殖的影响;用黄芩素和(或)IL-6处理RPMI 8226、U266细胞,激光共聚焦及Western blot检测处理前后细胞中β连环素(β-catenin)蛋白表达;Transwell小室实验检测不同浓度黄芩素处理前后RPMI 8226和U266细胞的迁移能力;RT-PCR检测不同浓度黄芩素处理前后细胞内β-catenin、c-myc、细胞周期素D1(Cyclin D1)和细胞迁移相关基因整联蛋白β7(integrin β7)基因mRNA表达.结果 黄芩素呈浓度和时间依赖性抑制RPMI 8226和U266细胞的增殖;激光共聚焦及Westem blot结果显示黄芩素能够抑制β-catenin的表达从而抵抗IL-6对MM细胞的促增殖作用;RT-PCR检测显示黄芩素能够抑制β-catenin、c-myc、cyclin D1和integrin β7的mRNA表达;Transwell小室迁移实验表明,在基质细胞衍生因子(SDF-1)的趋化下,黄芩素以浓度依赖的方式降低MM细胞的迁移能力.结论 黄芩素具有抑制MM细胞增殖和迁移的作用,其分子机制与抑制增殖相关基因β-catenin、c-myc、cyclin D1和integrin β7的表达有关.     

甘草次酸诱导U266细胞凋亡及对Survivin表达的影响

本研究旨在观察甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)对人骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及survivin表达的影响。用MTT法检测GA对U266细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测不同浓度GA作用于U266细胞后细胞凋亡,细胞周期的变化;扫描电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化;实时定量PCR检测GA对U266细胞survivin基因表达的影响。结果表明:GA对U266细胞有增殖抑制作用,其抑制作用呈现为时间和浓度依赖性;GA可以诱导U266细胞凋亡;扫描电子显微镜下可见核仁染色质边集,凝聚成块;GA可以诱导U266细胞周期阻滞于G0/G1期,表现为G0/G1期细胞比例升高,而G2/M及S期细胞比例下降。GA可以下调U266细胞survivin基因的表达,下调作用与浓度呈正相关。结论 :CA能抑制U266细胞增殖,呈浓度和时间依赖性,诱导其凋亡,其作用机理可能与细胞周期阻滞于G0/G1期和下调survivin基因表达有关。     

马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡与bax基因的表达

背景:马钱子碱具有抗肿瘤作用,而其对人多发性骨髓瘤细胞生长的影响尚不明确。目的:探讨马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的机制。方法:取对数生长期的U266细胞,分别用0,0.05,0.1,0.2,0.4g/L的马钱子碱干预12,24,48h,通过MTT法测得IC50,并以此浓度干预U266细胞,通过形态学观察、RT-PCR法检测马钱子碱对人多发性骨髓瘤U266细胞株的诱导凋亡作用。结果与结论:马钱子碱诱导U266的凋亡呈时间和浓度依赖性(P<0.05),其作用48h的IC50为0.16g/L。在马钱子碱诱导的凋亡细胞中可见凋亡小体,同时,细胞中的促凋亡基因bax的表达量随马钱子碱作用时间的延长逐渐增加(P<0.01)。说明0.4g/L浓度范围内的马钱子碱具有诱导U266细胞凋亡的作用,这种作用具有浓度和时间依赖性,可能是通过激活bax基因途径实现的。     

Mangiferin抑制多发性骨髓瘤恶性生物学特性与发挥抗癌效应机制的实验研究

目的:探讨纯中药提取物Mangiferin对多发性骨髓瘤(MM)细胞恶性生物学行为的影响，分析Mangiferin抗骨髓瘤效应的分子机制，为MM替代治疗提供实验依据。方法:不同浓度Mangiferin干预人MM细胞株U266、RPMI8226细胞后，CCK-8法检测细胞增殖，Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot检测凋亡及相关信号通路蛋白的表达，实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测基质金属蛋白酶(MMP)、CXC趋化因子受体(CXCR)家族的表达变化。结果:Mangiferin可抑制U266、RPMI8226细胞增殖活性，并诱导其凋亡。当Mangiferin干预U266和RPMI8226细胞48 h后，U266和RPMI8226细胞中Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax表达上调，并下调survivin、Bcl-xL蛋白的表达同时水解活化caspase-3以促进细胞凋亡，且显著下调U266细胞中Bcl-2蛋白表达以诱导细胞凋亡(P<0.05)。在Mangiferin干预MM细胞后，其不仅可增加肿瘤抑制因子p53的表达水平，同时通过抑制抗凋...     

马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡与bax基因的表达

背景：马钱子碱具有抗肿瘤作用,而其对人多发性骨髓瘤细胞生长的影响尚不明确。目的：探讨马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的机制。方法：取对数生长期的U266细胞,分别用0,0.05,0.1,0.2,0.4g/L的马钱子碱干预12,24,48h,通过MTT法测得IC50,并以此浓度干预U266细胞,通过形态学观察、RT-PCR法检测马钱子碱对人多发性骨髓瘤U266细胞株的诱导凋亡作用。结果与结论：马钱子碱诱导U266的凋亡呈时间和浓度依赖性（P〈0.05）,其作用48h的IC50为0.16g/L。在马钱子碱诱导的凋亡细胞中可见凋亡小体,同时,细胞中的促凋亡基因bax的表达量随马钱子碱作用时间的延长逐渐增加（P〈0.01）。说明0.4g/L浓度范围内的马钱子碱具有诱导U266细胞凋亡的作用,这种作用具有浓度和时间依赖性,可能是通过激活bax基因途径实现的。     

Apogossypolone诱导骨髓瘤细胞凋亡及其机制研究

本研究探讨棉酚衍生物apogossypolone（ApoG2）对多发性骨髓瘤细胞系的抑制增殖、诱导凋亡的作用及其作用机制。应用台盼蓝染色、Hoechst 33258染色、透射电子显微镜检、DNA凝胶电泳法、流式细胞仪分析细胞DNA含量等来判断ApoG2对多发性骨髓瘤细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用。以caspase-3、caspase-9以及BCL-2、BCL—XL分析ApoG2诱导骨髓瘤细胞凋亡的可能机制。结果表明：ApoG2对多发性骨髓瘤细胞增殖具有明显的抑制作用,IC50值在U266细胞和Wusl细胞（48小时）分别为0．1、0．2μmol／L。ApoG2可以诱导骨髓瘤细胞凋亡且呈时间和剂量依赖性。ApoG2可以使骨髓瘤细胞周期停止在G2期,U266细胞G2期比例从9．7％增至19．6％。Wusl细胞从9．8％增至31．7％。ApoG2能导致U266、Wusl细胞caspase-9、caspase-3活性增高。U266细胞和Wusl细胞经ApoG2 25μmoL／L作用24小时后,BCL—XL表达分别下降（7．3±1．4）％和（11．2±6．2）％,Wusl细胞BCL-2表达下降84．4±3．4％。结论：ApoG2对多发性骨髓瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用,其作用机制可能和下调BCL-2／BCL—XL表达以及影响细胞周期有关。     

美伐他汀对人多发性骨髓瘤细胞系U266体外增殖与凋亡的影响

为了探讨羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖与凋亡的调控作用及机制，应用MTT比色法、光镜形态学观察、流式细胞术、DNA凝胶电泳及RT-PCR研究了美伐他汀(mevastatin)对MM细胞系U266细胞体外增殖与凋亡的影响。结果显示，美伐他汀以剂量及时间依赖方式抑制u266细胞增殖；细胞周期分析显示美伐他汀诱导u266细胞G0-G1期阻滞，但对p27蛋白及mRNA的表达无影响；在美伐他汀作用下U266细胞出现核染色质凝聚、核固缩、核碎裂等凋亡形态改变，PI Annexin V^ 细胞增多，线粒体跨膜电位(△φm)下降，DNA凝胶电泳出现梯形条带，bcl-2mRNA表达下调。加入外源性甲羟戊酸(meva-lonate，MVA)可完全逆转美伐他汀对U266细胞增殖与凋亡的效应。结论：美伐他汀可通过MvA途径，诱导G0-G1期阻滞抑制增殖、下调bcl-2表达及降低线粒体膜电位触发U266细胞凋亡。     

DNA甲基转移酶在骨髓瘤细胞株中的表达异常及其意义

本研究旨在探索多发性骨髓瘤细胞株U266 DNA甲基转移酶(DNMT)活性、基因表达情况并分析其生物学意义。用ELISA方法检测U266细胞DNMT活性,用半定量RT-PCR技术分析DNMT 1、3a、3b mRNA在U266细胞中的表达,体外用不同浓度去甲基化化合物异硫氰酸苯己酯(phenyl hexyleisothiocyanate,PHI)处理U266细胞,分析DNMT活性变化及DNMT1、3a、3b在瘤细胞中的表达改变。结果表明,骨髓瘤细胞U266中DNMT总活性升高,DNMT1、3a、3b mRNA均高表达,不同浓度PHI处理U266细胞后,细胞增殖抑制,DNMT活性亦被显著抑制,DNMT1、DNMT3a以及DNMT3b mRNA表达下降并呈浓度依赖性。结论:DNMT活性及其表达增高是骨髓瘤细胞特征之一,当DNMT活性或mRNA表达抑制时瘤细胞发生凋亡,因此DNMT可作为骨髓瘤治疗的新靶点。     

冬凌草甲素抗Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病效应的实验研究

目的 探讨冬凌草甲素对Ph染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)的抗白血病效应及其机制.方法 以Ph+ALL细胞株SUP-B15为研究对象,应用改良MTT法测定冬凌草甲素对SUP-B15细胞增殖的影响,计算72 h的半数抑制浓度(IC50);光学显微镜下观察冬凌草甲素处理后SUP-B15细胞的形态学变化;用流式细胞术检测药物作用前后SUP-B15细胞的凋亡率;以K562细胞为对照,应用Western blot法比较药物作用前后SUP-B15细胞Akt/mTOR、Raf/MEK/ERK、STAT5信号转导通路活化水平,以及凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的变化.结果 ①冬凌草甲素呈浓度及时间依赖地抑制SUP-B15细胞增殖,作用72 h的IC50值为(7.08±1.21)μmol/L;②冬凌草甲素处理24 h后光学显微镜下SUP-B15细胞边界不清晰,部分细胞崩解;③0、5、10 μmol/L冬凌草甲素作用24 h后,SUP-B15细胞凋亡百分率分别为(6.67±0.83)%、(18.30±1.79)%、(37.63±7.12)%;④冬凌草甲素明显抑制SUP-B15细胞ABL酪氨酸激酶及其下游Akt/mTOR、Raf/MEK/ERK、STAT5多条信号转导通路的活化;下调SUP-B15细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达.结论 冬凌草甲素通过抑制ABL酪氨酸激酶及其下游Akt/mTOR、Raf/MEK/ERK、STAT5信号转导,以及上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2而发挥抗Ph+ALL作用.     

熊果酸对t（8；21）白血病细胞kasumi-1的抗肿瘤作用机制的研究

本研究旨在探讨熊果酸对急性髓系白血病t（8;21）阳性细胞株kasumi-1细胞的抑制增殖、诱导凋亡机制。采用CCK-8法检测细胞增殖抑制,瑞氏染色法观察细胞凋亡形态,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR法及Westernblot法检测kasumi-1细胞内相关基因mRNA及蛋白的表达。结果表明,经熊果酸处理后的ka—sumi-1细胞的生长增殖受到抑制,出现凋亡形态学改变;在熊果酸2．5、5、10、20、50μmol／L浓度梯度以及在12,24,36,48,60。72h时间梯度下,AnnexinV阳性细胞比率随药物浓度的增加及作用时间的延长呈上升趋势;细胞内AMLI-ETO、KIT、MYC、CCND1、BCL2、MDM2mRNA的表达随作用时间的延长及用药浓度的增加而呈显著的下降趋势,而P53及BAX的mRNA表达逐渐增高;Westemblot显示AML1-ETO、C—kit、C—MYC、BCL-2蛋白表达减低,而P53蛋白表达增高。结论：熊果酸呈浓度和时间依赖性抑制kasumi-1细胞的增殖并诱导其凋亡,从而发挥抗白血病的作用。这为t（8;21）白血病靶向治疗方案的选择提供理论依据。     

Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究

为了研究velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡效应及机制，采用台盼蓝拒染法检测2、10、50和100nmol／L velcade处理U266细胞活率，用流式细胞术分析Annexin—V、线粒体跨膜电位（△ψm）和氧自由基（ROS），用半定量RT—PCR法检测bcl-2 mRNA的表达。结果表明：velcade抑制U266细胞增殖；诱导U266细胞凋亡，24小时Annexin—V阳性细胞比例增高，△ψm降低；12小时时活性氧明显增高，荧光强度增强；抗凋亡基因bcl-2表达降低。结论：velcade对U266细胞具有增殖抑制和杀伤作用。其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导U266细胞凋亡。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA诱导骨髓瘤细胞的凋亡

背景：SAHA是一种新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,目前有关其对多发性骨髓瘤细胞作用的研究还少见报道,而且其诱导细胞凋亡的分子机制还不十分清楚。目的：观察SAHA对多发性骨髓瘤细胞株U266细胞增殖和凋亡的影响,并分析其可能机制。方法：采用锥虫蓝拒染法、四氮唑蓝比色法检测SAHA对U266细胞增殖的影响。AllllexinV和PI染色后应用流式细胞仪检测SAHA作用U266细胞的凋亡率,Hoechst33342染色法检测凋亡细胞的形态。Western-blot方法检测信号转导通路Ras/Raf/Mek/Erk相关蛋白的表达水平。结果与结论：锥虫蓝拒染法和四氮唑蓝比色法均显示,SAHA可明显抑制U266细胞增殖,且具有时间剂量依赖性。0.5,2,4μmol/L SAHA作用U266细胞48h后,经流式细胞仪检测细胞凋亡率分别为（17.61±1.30）%,（43.13±3.80）%和（74.01±4.39）%,呈剂量依赖性（P〈0.05）。Hoechst33342染色荧光显微镜下可见,SAHA组细胞胞核出现明显的核固缩、核碎裂,而对照组改变不明显。Western-blot结果显示U266细胞经SAHA处理后,Raf-1和Erk蛋白的磷酸化水平受到明显抑制,药物作用48h时出现显著降低。提示SAHA抑制多发性骨髓瘤细胞株U266细胞增殖并诱导凋亡,信号转导通路Ras/Raf/Mek/Erk阻断是机制之一。     

CD45表达与骨髓瘤细胞凋亡敏感性的关系

目的 探讨CD45分子的表达与骨髓瘤细胞凋亡的关系.方法 用马法兰诱导骨髓瘤细胞系U266的凋亡;无血清培养法诱导转染CD45基因或空质粒的U266细胞凋亡;无葡萄糖培养法诱导AMO1细胞凋亡;动物实验比较U266细胞CD45阴性和阳性两群细胞在体内的存活能力;流式细胞术检测凋亡细胞率和线粒体膜电位;Western blot法检测线粒体内细胞色素C的释放和caspase-9的激活.结果 经马法兰处理后,45%的CD45+U266细胞发生凋亡,而CD45-U266细胞只有30%发生凋亡;在无葡萄糖培养条件下,与低表达CD45的AMO1细胞相比,高表达CD45的AMO1细胞更易发生凋亡.无血清培养5 d,转染CD45RB基因的U266细胞60%发生凋亡,而转染空质粒的U266细胞的凋亡数无明显增加,与对照组相似,约为10%.动物体内实验表明,CD45-U266细胞群在SCID-hIL-6小鼠体内存活能力是CD45+U266细胞群的5倍.经DiOC6染色流式细胞术检测马法兰处理的U266细胞线粒体膜电位,CD45+U266细胞线粒体膜电位下降60%,而CD45-U266细胞线粒体膜电位仅下降30%,两对照组线粒体膜电位下降均为10%左右.经紫外线照射后,CD45+U266细胞更易从线粒体释放细胞色素C,导致更多的caspase-9被激活.结论 CD45分子的表达参与线粒体介导的细胞凋亡过程,使骨髓瘤细胞对多种凋亡刺激因子的敏感性增加.     

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤（MM）基因治疗的可行性。将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIRES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF，酶切、测序鉴定。用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266，G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR、Westernblot法分别检测阳性克隆中VEGFmRNA和蛋白的表达；利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化；利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成。结果表明：获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF；VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达，转染重组质粒的U266细胞VEGFmRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少，细胞的增殖受到抑制，凋亡增加。转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少。结论：VEGF反义RNA可以下调VEGF表达，从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖，增加其凋亡并抑制血管形成。     

脂肪酸合成酶抑制剂抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的 明确脂肪酸合成酶（FAS）在人多发性骨髓瘤（MM）细胞中的高表达；探讨FAS抑制剂抑制MM细胞增殖及诱导其凋亡的机制。方法 通过RT-PCR方法检测FAS在MM细胞系U266、RPMI8226细胞中的表达；以MM细胞系U266细胞为模型，MTT法观察FAS抑制剂浅蓝菌素（cerulenin）对U266细胞增殖抑制率；以流式细胞术检测经cerulenin处理后U266细胞Annexin V的表达及细胞周期变化。结果 MM细胞系U266、RPMI8226细胞均有FAS mRNA的高表达，而健康献血员外周血单个核细胞（PBMNC）中不表达FAS mRNA；cerulenin对U266细胞增殖有显著的抑制作用，并呈剂量-效应相关；20μg／ml的cerulenin作用于U266细胞12h，细胞早期凋亡率为56．9％，24h细胞早期凋亡率为69．3％，而对照组分别为4．3％和1．8％（P＜0．01）；细胞周期DNA分析发现，20μg／mlcerulenin作用于U266细胞12h，S期细胞从对照组的9．7％上升至20．3％，作用24h，S期细胞上升为29．8％。结论 FAS在MM细胞中高表达；FAS抑制剂可抑制U266细胞的增殖；DNA合成阻止在S期，其抑制增殖的作用可能是通过促进U266细胞早期凋亡；FAS可能是一个潜在的抗MM的靶位。