日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶DNA疫苗的研制及其保护性免疫的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶 DNA疫苗诱导 C5 7BL /6小鼠的保护性免疫作用。方法　分别以 p U C19- Sj CTPI和 pc DNA1.1- IL - 12为模板设计引物 ,将 PCR扩增到的Sj CTPI基因以及 IL - 12的亚单位 P35 和 P40 基因克隆到真核表达载体 pc DNA .3.1中。大量制备 pc D-NA3.1- Sj CTPI和 pc DNA 3.1- P35 、pc DNA3.1- P40 的质粒 DNA。把 45只 5～ 6周龄 C5 7BL /6小鼠分成 3组 ,对照组 (pc DNA组 )肌肉注射 10 0μg的 pc DNA3.1;实验组 (TPI组 )肌肉注射 10 0μg的pc DNA3. 1- Sj CTPI;加强组 (TPI IL - 12组 )肌肉注射 10 0μg的 pc DNA 3.1- Sj CTPI及 10 0μg的pc DNA3.1- P35 和 pc DNA3.1- P40 的混合物 ,分别于第 1、5周各免疫 1次 ,第 9周每鼠用 45条尾蚴攻击感染 ,攻击后 45 d剖杀小鼠 ,计数成虫、肝内虫卵。采用免疫组化法检测 Sj CTPI在局部肌组织内的表达 ,用脾细胞培养法检测特异性抗原刺激后的 IL - 2、IL - 4、IL - 10、IFN-γ在攻击前后的水平。分别于 2次免疫前和攻击前及攻击后 2周经尾静脉采血 ,分别采用 EL ISA和 Western- blot检测血清中抗 TPI抗体。结果　 Sj CTPI可在 C5 7BL /6小鼠骨骼肌细胞膜、细胞浆中得到表达。细胞因子 IL -2的水平在攻击前、后 ,实验组     

日本血吸虫（中国大陆株）磷酸丙糖异构酶DNA疫苗的研制及其保护性免疫的研

目的 研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶ＤＮＡ疫苗诱导Ｃ５７ＢＬ／６小 保护性免疫作用。方法 分别以ｐＵＣ１９－ＳｊＣＴＰＩ和ｐｃＤＮＡ１．１－ＩＬ－１２为模板设计引物。将ＰＣＲ扩增到的ＳｊＣＴＰＩ基因以及ＩＬ－１２的亚单位Ｐ３５和Ｐ４０基因克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ．３．１中大量制备ｐｃＤ－ＮＡ３．１－ＳｊＣＴＰＩ和ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ３５、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ４０的质粒ＤＮＡ,把４５只５～６周龄Ｃ５７ＢＬ／６小鼠分成３组。对照组（ｐｃＤＮＡ组）肌肉注射１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１;实验组（ＴＰＩ组）肌肉注射１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１－ＳｊＣＴＰＩ;加强组（ＴＰＩ＋ＩＬ－１２组）肌肉注射１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１－ＳｊＣＴＰＩ及１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ３５和ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ４０的混合物     

日本血吸虫磷酸丙糖异构酶小鼠免疫试验

目的：探讨从日本血吸虫大陆株成虫分离的天然磷酸丙糖异构酶抗原（ＳｊｃＴＰＩ）免疫小鼠后对尾蚴攻击感染的保护性作用。方法：采用丙酮沉淀法从日本血吸虫大陆株成虫中提取天然的ＴＰＩ抗原，并以所提纯的ＳｊｃＴＰＩ抗原加福氏佐剂经皮下和肌肉注射免疫ＮＩＨ小鼠，攻击感染后６ｗｋ收集小鼠血清并计数成虫负荷及肝、肠组织虫卵数。同时设有日本血吸虫成虫抗原（ＳＷＡＰ）免疫对照组和攻击感染对照组。结果：天然ＳｊｃＴＰＩ抗原免疫小鼠后减虫率为２１．４％－２５．０％，肝组织减卵率达５７．８％－６０．３％；ＥＬＩＳＡ法检测ＴＰＩ免疫小鼠血清抗ＴＰＩ抗体ＯＤ值明显高于对照组小鼠的ＯＤ值（Ｐ＜０．０５）。结论：天然的ＳｊｃＴＰＩ抗原具明显的免疫原性和抗原性，可以继续进行编码ＴＰＩ基因的克隆与表达。     

重组日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶蛋白质表达,纯？…

磷酸丙糖异构酶是已被公认的血吸虫病疫苗个性候选分子之一，本研究将日本血吸虫中国大陆株ＴＰＩ分子基因ＤＮＡ片段定向克隆到表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３中，构建重组表达质粒，然后转化大肠杆菌ＢＬ２１感受态细胞，阳性克隆用ＩＰＴＧ诱导，阳性菌株可表达分子量约５５ｋＤａ的融合蛋白，此融合蛋白可与Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ结合成复合物，用凝血酶切割融合蛋白复合物，获得分子量约２８ｋＤａ的重     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

重组日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶蛋白质表达、纯化及特性分析

磷酸丙糖异构酶（ＴＰＩ）是已被公认的血吸虫病疫苗候选分子之一,本研究将日本血吸虫中国大陆株ＴＰＩ分子基因ＤＮＡ片段定向克隆到表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３（编码２６ｋＤａ的ＧＳＴ蛋白）中,构建重组表达质粒,然后转化大肠杆菌ＢＬ２１感受态细胞,阳性克隆用ＩＰＴＧ诱导,阳性菌株可表达分子量约５５ｋＤａ的融合蛋白（ＧＳＴ－ＴＰＩ）,此融合蛋白可与ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ结合成复合物,用凝血酶切割融合蛋白复合物,获得分子量约２８ｋＤａ的重组表达ＴＰＩ分子。重组ＴＰＩ分子具有磷酸丙糖异构酶活性,并能被日本血吸虫重感染兔血清,血吸虫病人血清所识别。重组ＴＰＩ免疫家兔产生抗体的效价最高可达１∶２５６００,该血清抗体能识别日本血吸虫中国大陆株成虫抗原中分子量约２８ｋＤａ的蛋白条带。     

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶(SjC-TPI)基因克隆与序列分析

根据已知日本血吸虫菲律宾株TPI序列，设计合成一对5’端分别带有BamH1，Sal1酶切位点的引物P1和P2，制备日本血吸虫成虫（中国大陆株）mRNA，采用反转录聚合酶链反应技术，从mRNA中扩增出日本血吸虫中国大陆株TPI基因片段，序列分析表明，日本血吸虫（中国大陆株）TPI基因开放阅读框架全长为759bp，与曼氏血吸虫TPI基因的同源性为84％。与日本血吸虫（菲律宾株）TPI基因的同源性为99.7％。     

日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶特异性肽段的基因克隆表达及特性鉴定

目的：应用基因工程方法制备SjC-TPI中特有抗原表位区域的肽段,方法：用PCR法对SjC-TPI与人的TPI相应部位同源性较低的两个亲水区15－66aa和129－163aa的DNA的基因列进行扩增,采用基因拼接法连接后,克隆入表达质粒载体pMAL－c2x,转化入大肠杆菌TB1,进行表达和鉴定。结果：该目的基因片段被成功地克隆入表达质粒载体pMAL-c2x并能融合表达,经进一步纯化获得特异的重组肽段具有良好的抗原性,能被日本血吸虫病人血清识别,而不被正常人血清识别,结论：获得与人的TPI同源性较低的特异重组肽段,为日本血吸虫复合多肽抗疫苗的制备提供了物质基础。     

日本血吸虫中国大陆株TPI DNA疫苗诱导BALB／c小鼠保护性免疫力的研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶（SjCTPI)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法 将39只BALB/c小鼠随机分成3组：A组（对照组）,肌注pcDNA3.1质粒DNA100μg/鼠;B组（实验组）,每鼠肌注pcDNA3.1-SjCTPI100μg;C组（加强组）,每鼠肌注pcDNA3.1-SjCTPI100μg及pcDNA3.1-P35和pcDNA3.1-P40的混合物100μg。每两周免疫1次,共计3次,末次免疫4周后,每鼠用45条尾蚴进行攻击,45d后剖杀小鼠,计数成虫以及每鼠肝组织内虫卵数;于攻击前每组各取两只小鼠采用^51Cr释放法测定SjCTPI介导的特异性细胞毒作用。ELISA检测攻击前后的抗TPI的抗体水平。结果 用ELISA检测抗TPI抗体的结果表明,攻击前A组的10份血清均为阴性,B组5/10份血清出现弱阳性,C组也有6/10份血清出现弱阳性反应。^51Cr释放法测定细胞毒活性结果表明,A、B、C组细胞毒活性分别为9.1%、27.6%和54.4%。与对照组相比,实验组的减虫率、减卵率分别为30.2%、52.9%,加强组的减虫率、减卵率分别为32.7%、47.0%。结论 进一步证实了SjCTPI DNA疫苗作为抗血吸虫病核酸疫苗的潜力。     

日本血吸虫中国大陆株TPI DNA疫苗诱导BALB/c小鼠保护性免疫力的研究

目的研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(SjCTPI)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用.方法将39只BALB/c小鼠随机分成3组A组(对照组),肌注pcDNA3.1质粒DNA 100μg/鼠;B组(实验组),每鼠肌注pcDNA3.1-SjCTPI 100μg;C组(加强组),每鼠肌注pcDNA3.1-SjCTPI 100μg及pcDNA3.1-P35和pcDNA3.1-P40的混合物100μg.每两周免疫1次,共计3次.末次免疫4周后,每鼠用45条尾蚴进行攻击,45 d后剖杀小鼠,计数成虫以及每鼠肝组织内虫卵数;于攻击前每组各取两只小鼠采用51Cr释放法测定SjCTPI介导的特异性细胞毒作用;ELISA检测攻击前后的抗TPI的抗体水平.结果用ELISA检测抗TPI抗体的结果表明,攻击前A组的10份血清均为阴性,B组5/10份血清出现弱阳性,C组也有6/10份血清出现弱阳性反应.51Cr释放法测定细胞毒活性结果表明,A、B、C组细胞毒活性分别为9.1%、27.6%和54.4%.与对照组相比,实验组的减虫率、减卵率分别为30.2%、52.9%;加强组的减虫率、减卵率分别为32.7%、47.0%.结论进一步证实了SjCTPI DNA疫苗作为抗血吸虫病核酸疫苗的潜力.     

日本血吸虫中国大陆株23 kDa膜蛋白核酸疫苗对猪免疫保护作用的研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白（SjC23）DNA疫苗诱导猪的保护性免疫作用。方法 构建并大量制备pcDNA3．1－SjC23质粒DNA和pcDNA3．1－p34，pcDNA3．1－p40（小鼠IL－12的2个亚单位）的DNA疫苗。30头2．5月龄的上海松江本地猪（阉猪）发为A、B、C3组，每组10头。A组（SjC23组）于每头猪两侧臂部肌肉注射500μgpcDNA3．1－SjC23质粒DNA，B组（Sj23＋IL－12组），于每头猪肌肉注射500μgpcDNA3．1－SjC23DNA及500μgpcDNA3．1－p35和500μgpcDNA3．1－p40的混合质粒DNA；C组（对照组）每头猪肉注射500μgpcDNA3．1质粒DNA。共免疫3次，每次间3周。末次免疫后30d，每猪经背部皮肤攻击感染日本血吸虫尾蚴600条。攻击后45d剖杀，经胸主动脉灌中，并从门静脉收集计算成虫。从肝脏的同一部位切下小块肝组织，置5％KOH内消化后，计算每克肝组织虫卵数（EPG），比较各组间减虫率、减雌率和减卵率。在免疫前，末次免疫后和攻击后从猪耳静脉采血，分离血清，用ELISA检测抗SjC23抗体。结果 SjC23组与SjC23＋IL－2组与质粒对照组相比，分别获得29．2％和58．6％的减虫率、50．8％和58．8％的减雌率以及48．2％和56．4％的减卵率。抗体检测SjC23组和SjC23＋IL－12组均有约50％的实验猪可检测到明显的抗SjC23抗体。结论 SjC23DNA疫苗可诱导猪产生较好好的保护保护作用，具有较大的发展潜力。     

日本血吸虫SjCTPI和SjC23 DNA疫苗联合免疫保护作用的研究

目的　探索 Sj CTPI和 Sj C2 3DNA疫苗联合应用保护性免疫的协同作用。方法　大量制备 pc DNA3.1- Sj CTPI和 pc DNA3.1- Sj C2 3的质粒 DNA。 4 8只 BAL B/ c小鼠分为 4个组 (A、B、C、D组 )每组 12只。 A组每鼠经双侧股四头肌注射 10 0 μg pc DNA3.1的质粒 DNA,为对照组 ;B组为Sj C2 3组 ,每鼠肌注 10 0μg pc DNA3.1- Sj CTPI的质粒 DNA;C组为 Sj CTPI组 ,每鼠肌注 10 0μgpc DNA3.1- Sj CTPI的质粒 DNA;D组为联合免疫组 ,每组肌注 10 0μg pc DNA3.1- Sj C2 3和 10 0μgpc DNA3.1- Sj CTPI质粒 DNA的混和物。分别于 0、14、2 8d免疫 3次。末次免疫后 30 d,每鼠经腹部皮肤攻击感染 (45± 2 )条日本血吸虫尾蚴。攻击后 4 5 d,剖杀所有小鼠 ,灌冲 ,收集成虫并计数。每鼠肝脏称重后剪碎 ,置 5 % KOH中消化 ,并计数虫卵数。比较各组间的减虫率和减卵率。结果　与对照组相比 ,Sj C2 3组、Sj CTPI及联合组的减虫率分别为 2 8.1%、2 9.1%和 4 1.5 % ,均非常显著地高于对照组 (P分别为 <0 .0 1,<0 .0 1,<0 .0 0 1) ,而联合组则又显著地高于单独 Sj C2 3组及单独 Sj CTPI组 (P均 <0 .0 5 )。三组的减卵率分别为 37.9%、4 4 .2 %和 6 1.4 % ,均非常显著地高于对照组 (P分别为 <0 .0 1,<0 .0 1,<0 .0 0 1) ,但     

日本血吸虫31kDa组织蛋白酶B DNA疫苗保护性免疫效果观察

目的观察日本血吸虫31kDa组织蛋白酶BDNA疫苗(Sj31B1N)在小鼠体内的保护性免疫效果.方法用Sj31B1N和Sj31B1N+pUCDNA疫苗肌注免疫BALB/C小鼠,用空白质粒载体VR1012做对照,在0、4、8周共免疫3次,每次免疫前及末次免疫后4周从尾静脉采血收集血清,经ELISA法检测小鼠血清抗体升高时,用日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠.结果Sj31B1N和Sj31B1N+pUC减虫率分别为24.2%和22.0%;肝卵减少率分别为34.9%和39.5%,每雌肝卵减少率分别为30.4%和35.3%.结论小鼠接种Sj31B1N后对日本血吸虫感染有减虫、减卵作用及抗雌虫生殖的作用.加质粒佐剂pUC未见有增强免疫效果的作用.     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjC FABP)核酸疫苗诱导小鼠免疫保护作用研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白分子 (Sj C FABP)核酸疫苗对 BALB/c小鼠的免疫保护性作用。方法　根据 Sj C2 1.7分子基因序列合成 1对特异性引物 P1和 P2 ,并使其5’端分别带有 Bam H1、Xho1的酶切位点序列 ,采用 PCR方法从重组质粒 Sj C FABP-p UC19中扩增出特异性目的基因的开放阅读框序列 ,并在其翻译起始密码子处引入 Kozark序列。限制性酶切后的基因片段被亚克隆到真核表达质粒 pc DNA3 .1中 ,构建成重组真核表达质粒 Sj C FABP-pc D-NA3 .1,大量制备纯化的重组真核表达质粒。 48只 BAL B/c小鼠分为对照组、实验组、加强组。对照组每只小鼠的股四头肌注射接种 10 0μg质粒 pc DNA3 .1DNA,实验组以同样的方式注射 10 0μg重组质粒 Sj C FABP-pc DNA3 .1DNA,加强组除注射 10 0μg重组质粒 Sj C FABP-PCDNA3 .1DNA外 ,同时注射 P3 5 -pc DNA3 .1,P40 -pc DNA重组质粒各 10 0μg。每隔 2周免疫 1次 ,共免疫3次。第 3次免疫后的第 3 0天每只小鼠经腹部皮肤感染 (4 5± 1)条尾蚴 ,45 d后剖杀 ,计数各组小鼠肝虫卵数及成虫数。于免疫前及末次免疫后 2周分别经尾静脉采血 ,测定抗体水平。在第 2次免疫后第 10天各组取 2只小鼠处死 ,取股四头肌进行免疫组化分析。结果　免疫组化分析显示实     

日本血吸虫23 kDa膜蛋白DNA疫苗和蛋白质疫苗联合应用免疫保护性作用的研究

目的　研究 Sj C2 3DNA疫苗和 Sj C2 3蛋白疫苗联合免疫对 C5 7BL/ 6感染小鼠的免疫保护作用。方法　分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和蛋白疫苗 (Sj C2 3大亲水片段融合蛋白 GST- HD)。 4 8只 C5 7BL / 6小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (Sj C2 3DNA+GST- HD联合应用组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射5 0μg GST- HD+5 0μg CFA 1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0μg pc DNA 3.1。各组在末次免疫后 30 d每鼠以 4 5± 2条 /只日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 4 5 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果　联合组与质粒对照组相比 ,获得了 36 .9%的减虫率和 30 .7%减卵率 ;而单独Sj C2 3DNA疫苗组的减虫率为 2 6 .9% ,显著低于联合组 (P<0 .0 5 )和 2 2 .2 %的减卵率 ,单独蛋白疫苗组 (GST- HD)为 15 .2 %和 12 .2 %     

重组日本血吸虫中国大陆株rTPI分子对小鼠免疫保护性作用的研究

目的研究重组日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶（SjC－TPI）分子抗血吸虫感染的保护性作用。方法用IPTG诱导表达,制备纯化的重组TPI蛋白,将重组TPI抗原免疫C57BL／6及昆明鼠,8周后用血吸虫尾蚴攻击感染,45d后剖杀,计数减虫率及减卵率。结果C57BL／6获得27．78％的减虫率;昆明鼠获得21．39％的减虫率,54．00％的减卵率。结论重组SjC－TPI对血吸虫感染具有一定的保护作用,可能为日本血吸虫病疫苗候选分子之一。